Questo lavoro è stato finanziato dalla Alliance of NanoHealth Pre-center Award (W81XWH-11-2-0168) e Texas Center for Cancer nanomedicina (1U54CA151668-01).

1. Chip Fabrication <ol><li> Creare la soluzione di rivestimento per il chip iniziando con la soluzione idrolizzata precursore di silicato. Mescolare 14 mL di tetraetilortosilicato (TEOS) con 17 mL di etanolo, 6,5 ml di acqua deionizzata e 0,5 mL di HCl 6M sotto forte agitazione (1200 giri al minuto) utilizzando uno agitare piastra calda. Riscaldare questa soluzione a 80 ° C per 2 ore, mantenendo la costante agitazione. </li><li> Preparare soluzioni di polimeri aggiungendo il desiderato triblocco coploymer (Pluronic F127, L121 e P123) in 10 mL di etanolo a temperatura ambiente sotto energica agitazione. Completa la miscela aggiungendo 7,5 ml della soluzione di silicato (dal punto 1.1) nel tri-blocco di soluzione di copolimero seguito da 2 ore di agitazione a temperatura ambiente. Questa rappresenta la soluzione di rivestimento finale. </li><li> Applicare 1 mL di soluzione di rivestimento ad un wafer di silicio da 4 pollici spin-coating ad una velocità di 1500 rpm per 20 secondi. Poi calore a 80 ° C per 12 ore. </li><li> Scaldare i film da rimuovere su organicirfactant aumentando temperatura di 1 ° C al minuto fino a 425 ° C, e poi cuocere per 5 ore. </li><li> Pretrattare il mesoporosa silice (MPS) superficie del chip con l&#39;ossigeno incenerimento plasma (Plasma Asher - marzo Plasma System). (O 2 Portata: 80 SCCM, potenza: 300 W, tempo: 10 minuti). </li><li> Opzionale modificazione chimica della superficie: i chip a 3% silanizzata organosilano in un Metanolo: acqua deionizzata (19:01) la soluzione per 72 ore a temperatura ambiente in una scatola di guanti 2 N. Sciacquare sequenziale con metanolo e acqua deionizzata. Cure chip a 110 ° C per 15 minuti in un ventilatore azionato forno. </li></ol> 2. Pretrattamento dei campioni <ol><li> Aggiungere TFA e ACN per ciascun campione di siero tale che le concentrazioni finali sono 0,01% TFA e il 5% ACN. Vortex per mescolare. </li><li> Agitare questi campioni su un tavolo vortice agitatore a temperatura ambiente per 30 minuti. </li></ol> 3. Frazionamento Siero <ol><li> Pre-bake chip per tutta la notte in un forno a 160 ° C. In alternativa, store i chip in un essiccatore fino al momento dell&#39;uso per impedire l&#39;idratazione della superficie con acqua ambiente in aria. </li><li> Utilizzare aria compressa per rispolverare eventuali particelle che possono essere sulla superficie del chip. </li><li> Tagliare prefabbricati, acquistati CultureWell chambered coverglass per includere il numero desiderato di pozzi. Coprioggetti pulito con etanolo al 100% e poi metterlo su una superficie chip di MPS. Premere coverglass verso il basso con una pinza per garantire una tenuta completa di chip. </li><li> Pipettare 10 microlitri di campione di siero in ogni mm 3 bene. Incubare per 30 minuti in una camera umidificata a temperatura ambiente. </li><li> Pipettare il siero di pozzi e scartare. Pipettare 10 L di acqua deionizzata a ciascun pozzetto per lavare via proteine ​​più grandi. Ripetere 4 volte. </li><li> Pipettare 5 tampone di eluizione microlitri (0,1% TFA + 50% ACN) in ciascun pozzetto. Pipettare su e giù per 30 volte mentre si muove la punta della pipetta in giro per il bene mescolare il tampone di eluizione. (Applicare solo tampone di eluizione per 1-2 i campioni in un momento per evitare tampone di eluizionel&#39;evaporazione così in fretta). </li><li> Dopo la miscelazione, pipettare tutti i buffer di eluizione e posto in una provetta da microcentrifuga fino al momento di effettuare l&#39;analisi MALDI-TOF. </li><li> Al fine di emulare la complessità di un campione biologico e di valutare l&#39;effetto di arricchimento per la raccolta di specie a basso peso molecolare con il nostro sistema on-chip frazionamento, abbiamo selezionato e assemblato una miscela standard di proteine ​​e peptidi conteggio specie diverse ventisei con un ampio gamma di pesi molecolari (900-66 500 Da) e inibitori della proteasi (4,0-10,2) e concentrazioni (0,5-8 pmol / pl) (vedi lista delle proteine ​​nella Tabella 1). </li></ol> 4. MALDI-TOF analisi dei peptidi <ol><li> Spot 0,5 microlitri di campione di destinazione piastra MALDI e lasciare asciugare. </li><li> Spot matrice 0,5 pl (α-ciano-4-idrossicinnamico acido (CHCA), 5 g / L) o soluzione satura di acido trans-3 ,5-dimetossi-4-idrossicinnamico (SA) in 50% acetonitrile contenente 0,1% TFA e consentono di co-cristallizzazione. &lt;/ Li&gt; <li> Spot 0,5 ml di soluzione di calibrazione per ogni punto di taratura e lasciare asciugare. </li><li> Inserire la piastra di destinazione in MALDI-TOF spettrometro di massa. La macchina deve essere impostato sulla modalità riflettore positivo, con un intensità del laser di 4200 e 3000 colpi al campione. La gamma di massa dovrebbe essere selezionato 800-5000 Da una massa di 2000 Da bersaglio. </li><li> Eseguire la stessa analisi MALDI-TOF in modalità lineare, ma modificare l&#39;intervallo di massa a 900 a 10.000 Da o 3000 a 70.000 Da e una massa di 5000 Da bersaglio. </li></ol> 5. Analisi dei dati <ol><li> Gli spettri raw sono stati elaborati con il software ConvertPeakList ed i dati sono stati esportati in SpecAlign software per la pre-elaborazione. Tutti gli spettri sono stati allineati con il metodo PAFFT correlazione e intensità sono stati normalizzati in corrente ionica totale (TIC) in ogni spettro corrispondente. Tutti gli spettri sono state levigate e de-divulgata con fattore di 4 e 0,5 rispettivamente. Picchi sono stati rilevati con una base di 0,5, finestra di massa 21 e altezzarapporto 1,5, valori negativi sono stati rimossi prima dell&#39;analisi. </li><li> Clustering gerarchico è stata effettuata utilizzando Cluster 3.0 e visualizzati con il software MapleTree. MALDI MS dati (m / z potenze di picco) è stato il log-trasformato, normalizzato, e centrato mediana. Pearson correlazione è stato utilizzato per calcolare la distanza tra i campioni, e raggruppamento linkage completa è stata eseguita. </li><li> Un Student indipendente t-test è stato utilizzato per il confronto tra i gruppi (n = 2 gruppi) per ciascun picco rilevato MS prima unsupervised analisi clustering gerarchico. Un P-value di 0.02 o inferiore è stata considerata significativa per selezionare peptidi e proteine ​​differenzialmente raccolte tra i diversi chip mesoporosi proteomica (pori dilatati vs piccoli pori). </li></ol> 6. Risultati rappresentativi Come mostrato in figura 1, in questo studio abbiamo fabbricato una serie di film sottili di silice mesoporosi con una varietà di nanotextures ed esaurientemente esplorato l&#39;uso ir in Figura 2a selettiva cattura e arricchimento LMW peptidi e proteine ​​da siero umano. e B mostrano gli spettri MS del campione non trasformate siero per peptidi nell&#39;intervallo di 900 a 10.000 Da e per le proteine ​​nell&#39;intervallo 3.000 ~ 70.000 Da rispettivamente . Questi spettri illustrano la soppressione segnale nella regione LMW dovuta alla presenza di ben ionizzato, molto abbondanti, ad alto peso molecolare (HMW), proteine ​​come albumina. Figura 2c e d rappresentano gli spettri MS del campione di siero dopo frazionamento dal L121 MPS (dimensione dei pori, 6 nm). La maggior parte delle molecole grandi sono stati esauriti, con conseguente arricchimento significativa dei componenti LMW. Come controllo, lo stesso campione di siero è stato applicato su una superficie porosa silice pura per valutare la specificità di film sottili per il recupero MPS LMWP. Come si può vedere in figura 2e e f, non vi era alcuna significativa raccolta di pepmaree o proteine ​​dalla silice non poroso. Così si può concludere che fosse l&#39;architettura mesoporosa e non l&#39;affinità superficie della silice che costituisce il fattore predominante per l&#39;arricchimento di LMWP. Proprio controllati variazioni nelle dimensioni dei pori può essere realizzato attraverso l&#39;uso di copolimeri con differenti lunghezze blocco idrofobo. Utilizzando le proteine ​​progettati e miscela peptidi, l&#39;effetto della dimensione dei pori sulla peptide LMW e recupero efficacia proteina è stata studiata utilizzando MPS sottili pellicole preparate da quattro tensioattivi (Pluronic F127, P123, L121, L121 e più agente rigonfiante) con rapporti volumetrici differenti dei componenti idrofili e idrofobi per formare dimensioni dei pori 3.7 nm, 5.2 nm, 7,4 nm e 9,0 nm, rispettivamente. Questa gamma di dimensioni dei pori ha portato al recupero di un diverso repertorio di peptidi e proteine ​​dallo stesso campione di siero attraverso dimensioni e la forma di esclusione (Figura 3). Gli spettri proteina ad alto peso molecolare demonstrate molecolare cut-off di ciascun tipo di chip. Oltre alla dimensione-dipendente deplezione di proteine ​​HMW, l&#39;on-chip frazionamento della soluzione standard mostra un differenziale e arricchimento selettivo di specie LMW associati con le dimensioni dei pori. Il raggruppamento bidirezionale gerarchico presentato nella figura 3b mostra l&#39;arricchimento LMW standard modello ottenuto con il MSC differenti. Anche se tutti i peptidi sono al di sotto del cut-off molecolare dei chip, vi è una correlazione positiva tra le dimensioni dei pori e il peso molecolare della specie intrappolati. Il MSC e con pori dilatati, fino a 9 nm, preferenzialmente raccogliere grandi peptidi, mentre quelli più piccoli peptidi vengono recuperati in modo più efficiente i chip con i più piccoli pori. La trasformazione strutturale del dispositivo mesoporoso è stata effettuata regolando la concentrazione del polimero modello. Aumentando la concentrazione del polimero modello determinato una curvatura ridotto interfacciale tra le fasidell&#39;acqua, il copolimero, il silicato e, conseguentemente avviare la progressione interconnessi da un sferico ad una struttura cilindrica. Pluronic F127, con il suo alto peso molecolare, possiede questo alto grado di periodicità strutturale. Aumentando la concentrazione di F127 in soluzione di partenza, diverse nanostrutture a film sottile MPS periodiche possono essere ottenuti da nanostruttura 3D nanostruttura 2D. Le nanostrutture 3D cubi a testa esagonale a nido d&#39;ape, in possesso di interconnettività nanoporo più desiderabile e la morfologia nanoporo più accessibile, mostrano prestazioni superiori in modo selettivo arricchire peptidi LMW che la struttura 2D esagonale, anche se condividono simili distribuzioni di dimensione dei pori e la molecolari stesso cut-off per il siero frazionamento (Figura 4). Abbiamo anche semplificato la coniugazione di composti organo-silano su chip MPS con l&#39;introduzione di plasma di ossigeno incenerimento per pretrattare la superficie del chip. Per studiare qualitativamente l&#39;effetto elettrostatico sulla selezioneive on-chip di arricchimento, usiamo le proteine ​​e peptidi miscela. L&#39;analisi MS di soluzione standard di proteomica frazionati su chip MPS preparati con L121 e coniugate con i gruppi chimici funzionali è presentato in Figura 5. La carica positiva e caricati negativamente i peptidi e proteine ​​LMW vengono catturati sulla anionici e cationici, rispettivamente, i chip. Il confronto quantitativo di molteplici chip MPS nel recupero dei peptidi con carica positiva netta viene visualizzato in figura 5a. I chip con carica negativa e le chips senza alcuna modifica (con una minore carica negativa in origine) mostrano un arricchimento notevolmente più elevato per quei peptidi che i chip modificati con APTES (-NH 2). Al contrario, i chip di carica positiva MPS possiede eccezionali capacità di recuperare tali peptidi con carica netta negativa, come mostrato nella figura 5b. Mentre α-Endorphin non mostra significativi cambiamenti due la sua PI circa 6. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3876/3876fig1.jpg" /> Figura 1. Principio di frazionamento MPS chip e arricchimento LMW. Dopo campione macchie sulla superficie, LMW proteine ​​e peptidi sono intrappolati nei pori, mentre le specie più grandi rimasti fuori dei pori e vengono rimossi durante le fasi di lavaggio. Le frazioni arricchite vengono poi eluita ed analizzata tramite MALDI. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3876/3876fig2.jpg" /> Figura 2. Arricchimento peptide utilizzando i mesoporosi chip film sottile di silice. MALDI MS profili sia nella gamma bassa massa (900 a 10 000 Da) e l&#39;intervallo di massa elevato (3000 a 70 000 Da) prima (a, b) e dopo (c, d) lavorazione del siero sui film sottili di silice mesoporosi ( L121, 6 nm). Il recupero molecolare è ridotto significativamente quando si utilizza silice bianco superfici porose (e, f). <img alt="Figura 3" src=&quot;/ Files/ftp_upload/3876/3876fig3.jpg&quot; /&gt; Figura 3. Molecolare arricchimento cut-off e la dimensione-dipendente dei chip MPS. (A) Visualizzazione ingrandita della spettri MALDI dimostrando molecolare caratteristica di cut-off di ciascun chip MPS correlazione alla dimensione dei pori. (B) di clustering bidirezionale gerarchica delle caratteristiche mix peptidici tra i diversi chip. L&#39;intensità del colore rosso o giallo indica la concentrazione relativa peptide. Grandi pori migliorato la raccolta di peptidi più grandi (3600-8500 Da), mentre i piccoli peptidi (900-3500 Da) sono stati recuperati preferenzialmente dai chip con pori più piccoli. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3876/3876fig4.jpg" /> Figura 4. Caratterizzazioni fisiche di MPS film sottili e di recupero selettivo con diverse nanostrutture. Modelli di XRD (a, b, c), TEM (inserto a, b, c), Pluronic F127 a concentrazioni diverse in soluzione di precursore: 4,0 ×10 -3 M (a), 6,0 × 10 -3 M (b), e 8,0 × 10 -2 M (c). (D) Istogramma dell&#39;intensità di rilevazione illustrare il recupero selettivo peptidi su cubi 3D e 3D esagonali F127 chip proteomica (Cub e Hex, rispettivamente). Le modifiche strutturali differenti presentano un arricchimento selettivo. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3876/3876fig5_lg.jpg"><img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/3876/3876fig5.jpg" /></a> Figura 5. Charge-specifica di recupero per i chip con funzioni di superficie. Istogramma dell&#39;intensità MS di rilevamento di peptidi selettivamente catturati sui chip funzionalizzati. Secondo il loro punto isoelettrico, i peptidi sono positivamente o caricato negativamente a pH 7,0. (A) peptidi positivi ((1)-des-Arg1 bradichinina, (2) bradichinina, (3) sostanza P-ammide, (4) neurotensina, (5) ACTH (1-17), (6) ACTH (7 - 38)) sono specificamente arricchito sul carico negativamente surfacce. (B) peptidi (negativi (7) Glu1-fibrinopeptide B, (8) α-endorfina, (9) insulina ACTH (18-39), (10), (11) EGF, (12) insulino-simile GFII) sono in particolare arricchito sulle superfici con carica positiva. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3876/3876fig6_lg.jpg"><img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/3876/3876fig6.jpg" /></a> Figura 6. On-Chip stabilizzazione di siero frazionato. (A) rappresentativi di profili MALDI LMW peptidi e proteine ​​eluite immediatamente dopo frazionamento siero (superiore) o dopo 3 settimane di on-chip stoccaggio a temperatura ambiente (inferiore). (B) Dall&#39;alto in basso: analisi di regressione lineare di intensità media di rilevati picchi MS in ogni replica rispetto a 1 per replicare appena frazionato nel siero e frazionato siero dopo 3WK stoccaggio MPS chip a temperatura ambiente. Equazione, CV e il coefficiente di determinazione (R 2) sono indicati.

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	<li>Wulfkuhle, J. D., Liotta, L. A., Petricoin, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+applications+for+the+early+detection+of+cancer.">Proteomic applications for the early detection of cancer.</a> Nat. Rev. Cancer. 3, 267-275 (2003).</li><li>Etzioni, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+case+for+early+detection.">The case for early detection.</a> Nat. Rev. Cancer. 3, 243-252 (2003).</li><li>Hanash, S. M., Pitteri, S. J., Faca, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mining+the+plasma+proteome+for+cancer+biomarkers.">Mining the plasma proteome for cancer biomarkers.</a> Nature. 452, 571-579 (2008).</li><li>Liotta, L. A., Ferrari, M., Petricoin, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+proteomics:+written+in+blood.">Clinical proteomics: written in blood.</a> Nature. 425, 905-905 (2003).</li><li>Petricoin, E. F., Belluco, C., Araujo, R. P., Liotta, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+blood+peptidome:+a+higher+dimension+of+information+content+for+cancer+biomarker+discovery.">The blood peptidome: a higher dimension of information content for cancer biomarker discovery.</a> Nat. Rev. Cancer. 6, 961-967 (2006).</li><li>Anderson, N. L., Anderson, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+plasma+proteome:+history,+character,+and+diagnostic+prospects.">The human plasma proteome: history, character, and diagnostic prospects.</a> Mol. Cell Proteomics. 1, 845-867 (2002).</li><li>Gorg, A., Weiss, W., Dunn, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+two-dimensional+electrophoresis+technology+for+proteomics.">Current two-dimensional electrophoresis technology for proteomics.</a> Proteomics. 4, 3665-3685 (2004).</li><li>Liu, H., Sadygov, R. G., Yates, J. R., 3rd, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+model+for+random+sampling+and+estimation+of+relative+protein+abundance+in+shotgun+proteomics.">A model for random sampling and estimation of relative protein abundance in shotgun proteomics.</a> Anal. Chem. 76, 4193-4201 (2004).</li><li>Rabilloud, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-dimensional+gel+electrophoresis+in+proteomics:+old,+old+fashioned,+but+it+still+climbs+up+the+mountains.">Two-dimensional gel electrophoresis in proteomics: old, old fashioned, but it still climbs up the mountains.</a> Proteomics. 2, 3-10 (2002).</li><li>Hu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tailoring+of+the+nanotexture+of+mesoporous+silica+films+and+their+functionalized+derivatives+for+selectively+harvesting+low+molecular+weight+protein.">Tailoring of the nanotexture of mesoporous silica films and their functionalized derivatives for selectively harvesting low molecular weight protein.</a> ACS Nano. 4, 439-451 (2010).</li><li>Bouamrani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesoporous+silica+chips+for+selective+enrichment+and+stabilization+of+low+molecular+weight+proteome.">Mesoporous silica chips for selective enrichment and stabilization of low molecular weight proteome.</a> Proteomics. 10, 496-505 (2010).</li></ol>

Non abbiamo nulla da rivelare.

La prova sta montando che il basso peso molecolare regione del proteoma circolatorio è una ricca fonte di biomarker diagnostici per la diagnosi precoce della malattia. In questa tecnologia, abbiamo presentato una serie di chip di silice mesoporosi con dimensioni dei pori, strutture pori e modifiche per arricchire selettivamente peptidi e proteine ​​a basso peso molecolare. Per valutare la stabilità della proteina, i chip MPS sono state incubate con siero umano, essiccato dopo il lavaggio, e conservate per 3WK a temperatura ambiente. Le proteine ​​/ peptidi modelli ottenuti sono paragonabili a quelle di siero fresco frazionato (figura 6a), come confermato dai risultati dell&#39;analisi statistica mostrato nella Figura 6b. La variabilità dei segnali di picco misurate dal CV medio è stato stimato a 12,7% di siero grezzo e al 14,2% per i campioni frazionati. Le variazioni marginali potrebbe essere dovuto alla variabilità interna dello strumento MALDI e suggerito che la on-chip pretrattamento e conservazione non ha indotto alcuna alterazione significativa dei profili proteici di MS. Lo stesso esperimento è stato eseguito su non silicio poroso. Il siero essiccato recuperato dopo stoccaggio su superficie di silicio è stato frazionato sui chip MPS prima analisi MALDI. Il profilo povero MS ottenuti hanno evidenziato il vantaggio stabilizzazione della superficie mesoporoso. In analogia con i meccanismi postulati precedentemente, si ipotizza che le specie LMW intrappolati all&#39;interno dei nanopori sono stati conservati dal degrado attraverso l&#39;esclusione dimensioni delle proteasi, o attraverso l&#39;inibizione sterica della loro attività proteolitica nello spazio angusto dei nanopori. Il metodo basato su chip di MPS potrebbe essere un potente strumento per il peptide e la profilazione di proteine ​​LMW del complesso studio biologico fluidi. I chip MPS sono poco costosi da produrre e permettere la produzione di scalata fino a raggiungere la lavorazione simultanea di un gran numero di campioni, fornendo caratteristiche vantaggiose per esplorativo screening e biomarcatore scoperta.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reattivo </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Comments </td></tr><tr><td> Tetraetossisilano </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 131903 </td><td> 98% </td></tr><tr><td> Spin coater </td><td> Brewer Science </td><td> Cee 200X </td><td></td></tr><tr><td> Plasma Asher </td><td> Nordson marzo </td><td> AP-600 </td><td></td></tr><tr><td> Ellissometro spettroscopica </td><td> JA Woollam Co. </td><td> M-2000DI </td><td></td></tr><tr><td> MALDI-TOF </td><td> Applied Biosystems </td><td> Voyager-DE-STR </td><td></td></tr><tr><td> α-ciano-4-idrossicinnamico acido </td><td> Sigma-Aldrich Co. </td><td> C8982 </td><td> Matrice per MALDI-TOF </td></tr><tr><td> trans-3 ,5-dimetossi-4-idrossiacido cinnamico </td><td> Sigma-Aldrich Co. </td><td> 85429 </td><td> Matrice per MALDI-TOF </td></tr><tr><td> Mescolare piastra calda </td><td> Thermo Scientific </td><td> 11-475-30Q </td><td></td></tr><tr><td> CultureWell chambered coverglass </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> GBL103350 </td><td> 3 millimetri diam. × 1 mm di profondità, 3-10 pl, sterile </td></tr><tr><td> Pluronic F 127 </td><td> BASF </td><td></td><td> 106 PEO-PPO-PEO 70 106 </td></tr><tr><td> Pluronic L121 </td><td> BASF </td><td></td><td> PEO 5-70-PPO PEO 5 </td></tr><tr><td> Pluronic P123 </td><td> BASF </td><td></td><td> 20 PEO-PPO-PEO 70 20 </td></tr></tbody></table> Tabella 1. Fisico-chimiche e concentrazioni progettate (peso molecolare e Iso-Elettrico punto) del peptide selezionato e proteine ​​standard.

low molecular weight protein enrichment on mesoporous silica thin films for biomarker discovery

L&#39;identificazione di biomarcatori circolanti ha un grande potenziale per i non invasive nella diagnosi precoce e la prognosi, così come per il monitoraggio della efficacia terapeutica. 1-3 La circolazione proteoma a basso peso molecolare (LMWP) composto di piccole proteine ​​versato dai tessuti e cellule o frammenti peptidici derivati ​​dalla degradazione proteolitica di proteine ​​più grandi, è stata associata con la condizione patologica in pazienti e probabilmente riflette lo stato di malattia. 4,5 Nonostante questi potenziali applicazioni cliniche, l&#39;uso di spettrometria di massa (MS) per analizzare la LMWP dal fluidi biologici ha dimostrato di essere molto difficile a causa della vasta gamma dinamica di concentrazioni di proteine ​​e peptidi nel siero. 6 senza pretrattamento dei campioni, alcune delle più proteine ​​altamente abbondanti oscurare la rivelazione di bassa abbondanza specie nel siero / plasma. Attuali approcci basati sulla proteomica, come ad esempio bidimensionale su gel di poliacrilammide-elmetodi ectrophoresis (2D-PAGE) e proteomica shotgun sono alta intensità di manodopera, bassa produttività e l&#39;idoneità dell&#39;offerta limitata per le applicazioni cliniche. 7-9 Pertanto, una strategia più efficace è necessaria per isolare LMWP dal sangue e consentire lo screening ad alta produttività di campioni clinici . Qui vi presentiamo un veloce, efficiente ed affidabile multi-frazionamento sistema basato su chip di silice mesoporosi di indirizzare in modo specifico e arricchire LMWP. 10,11 mesoporosi silice (MPS), film sottili con caratteristiche sintonizzabili su scala nanometrica sono stati realizzati utilizzando il copolimero a tre blocchi via template . Uso di modelli diversi e concentrazioni di polimero nella soluzione di polimero precursore, diverse distribuzioni di grandezza dei pori, strutture dei pori, connettività e proprietà superficiali sono state determinate ed applicati per il recupero selettivo di proteine ​​bassa massa. L&#39;analisi selettiva dei peptidi arricchito in sottoclassi differenti a seconda delle loro proprietà fisico-chimiche saranno enHance l&#39;efficienza di recupero e l&#39;identificazione di specie poco abbondanti. In combinazione con spettrometria di massa e analisi statistica, abbiamo dimostrato la correlazione tra le caratteristiche nanofasici dei film sottili di silice mesoporosi e la specificità e l&#39;efficacia di raccolta bassa massa proteoma. I risultati qui presentati rivelano il potenziale della nanotecnologia basata su tecnologia per fornire una valida alternativa ai metodi convenzionali per la raccolta LMWP da fluidi biologici complessi. A causa della possibilità di regolare le proprietà del materiale, la capacità di produzione a basso costo, la semplicità e rapidità di raccolta dei campioni, ed i requisiti del campione notevolmente ridotti per l&#39;analisi, questo romanzo la nanotecnologia sarà sostanzialmente un impatto nel campo della ricerca biomarker proteomica e proteomica clinica valutazione.

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Low Molecular Weight Protein Enrichment on Mesoporous Silica Thin Films for Biomarker Discovery

Abbiamo sviluppato una tecnologia basata su pellicola sottile di silice mesoporosa per il recupero selettivo di proteine ​​a basso peso molecolare e peptidi da siero umano. Le proprietà fisico-chimiche delle nostre chip mesoporosi stati finemente sintonizzato per fornire il controllo sostanziale arricchimento peptide e di conseguenza il profilo del proteoma siero per scopi diagnostici.

Basso Peso Molecolare proteina di arricchimento sul film sottili di silice mesoporosi per la scoperta di biomarcatori

The identification of circulating biomarkers holds great potential for non invasive approaches in early diagnosis and prognosis, as well as for the ...

low-molecular-weight-protein-enrichment-on-mesoporous-silica-thin

Research

JoVE Journal

Bioengineering

13.4K Views.  The Methodist Hospital Research Institute. Abbiamo sviluppato una tecnologia basata su pellicola sottile di silice mesoporosa per il recupero selettivo di proteine ​​a basso peso molecolare e peptidi da siero umano. Le proprietà fisico-chimiche delle nostre chip mesoporosi stati finemente sintonizzato per fornire il controllo sostanziale arricchimento peptide e di conseguenza il profilo del proteoma siero per scopi diagnostici.

Video: Low Molecular Weight Protein Enrichment on Mesoporous Silica Thin Films for Biomarker Discovery

Developing Custom Chinese Hamster Ovary-host Cell Protein Assays using Acoustic Membrane Microparticle Technology

Custom assays for unique proteins are often limited to time consuming manual detection and quantitation techniques such as ELISA or Western blots due to the complexity of development on alternate platforms. BioScale's proprietary Acoustic Membrane MicroParticle (AMMP) technology allows sandwich immunoassays to be easily developed for use on the ViBE platform, providing better sensitivity, reproducibility, and automated operation. Provided as an example, this protocol outlines the procedure for developing a custom Chinese Hamster Ovary- Host Cell Protein (CHO-HCP) assay. The general principles outlined here can be followed for the development of a wide variety of immunoassays.
An AMMP assay measures antigen concentration by measuring changes in oscillation frequency caused by the binding of microparticles to the sensor surface to calculate. It consists of four major components: (1) a cartridge that contains a functionalized eight sensor chip (2) antibody labeled magnetic microparticles, (3) hapten tagged antibody that binds to the surface of the functionalized chip (4) samples containing the antigen of interest. BioScale's biosensor is a resonant device that contains eight individual membranes with separate fluidic paths. The membranes change oscillation frequency in response to mass accumulating on the surface and this frequency change is used to quantitate the amount of added mass.
To facilitate use in a wide variety of immunoassays the sensor is functionalized with an anti-hapten antibody. Assay specific antibodies are modified through the covalent conjugation of a hapten tag to one antibody and biotin to the other. The biotin label is used to bind the antibody to streptavidin coupled magnetic beads which, in combination with the hapten-tagged antibody, are used to capture the analyte in a sandwich. The complex binds to the chip through the anti-hapten/hapten interaction. At the end of each assay run the sensors are cleaned with a dilute acid enabling the sequential analysis of columns from a 96-well plate.
Here, we present the method for developing a custom CHO-HCP AMMP assay for bioprocess development. Developing AMMP assays or modifying existing assays into AMMP assays can provide better performance (reproducibility, sensitivity) in complex samples and reduced operator time. The protocol shows the steps for development and the discussion section reviews representative results. For a more in-depth explanation of assay optimization and customization parameters contact BioScale. This kit offers generic bioprocess development assays such as Residual Protein A, Product titer, and CHO-HCP.

Development of custom assays on the ViBE platform for more sensitive, reproducible, automated results in complex matrices is described. The universal cartridge allows assays to be easily adapted for use with custom assays. This versatility enables rapid development and validation of novel assays or automated versions of existing manual assays, exemplified in this video.

Sviluppo di ovaio di criceto cinese-dosaggi delle proteine ​​della cellula ospite con la tecnologia Acoustic microparticelle di membrana

Custom assays for unique proteins are often limited to time consuming manual detection and quantitation techniques such as ELISA or Western blots due to ...

Ricerca

Bioingegneria

Low-Cost Cryo-Light Microscopy Stage Fabrication for Correlated Light/Electron Microscopy

The coupling of cryo-light microscopy (cryo-LM) and cryo-electron microscopy (cryo-EM) poses a number of advantages for understanding cellular 
dynamics and ultrastructure. First, cells can be imaged in a near native environment for both techniques. Second, due to the vitrification process, samples are
 preserved by rapid physical immobilization rather than slow chemical fixation. Third, imaging the same sample with both cryo-LM and cryo-EM provides correlation of
 data from a single cell, rather than a comparison of "representative samples". While these benefits are well known from prior studies, the widespread use of correlative 
 cryo-LM and cryo-EM remains limited due to the expense and complexity of buying or building a suitable cryogenic light microscopy stage. Here we demonstrate the 
 assembly, and use of an inexpensive cryogenic stage that can be fabricated in any lab for less than $40 with parts found at local hardware and grocery stores. This 
 cryo-LM stage is designed for use with reflected light microscopes that are fitted with long working distance air objectives. For correlative cryo-LM and cryo-EM 
 studies, we adapt the use of carbon coated standard 3-mm cryo-EM grids as specimen supports. After adsorbing the sample to the grid, previously established protocols 
 for vitrifying the sample and transferring/handling the grid are followed to permit multi-technique imaging. As a result, this setup allows any laboratory with a 
 reflected light microscope to have access to direct correlative imaging of frozen hydrated samples.

We demonstrate the fabrication of a low-cost cryogenic stage designed to fit most reflected light microscopes. This lab-built cryogenic stage enables efficient and reliable correlative imaging between cryo-light and cryo-electron microscopy.

Low-Cost Cryo-Stage Light fabbricazione microscopia per Luce correlate / Microscopia Elettronica

The coupling of cryo-light microscopy (cryo-LM) and cryo-electron microscopy (cryo-EM) poses a number of advantages for understanding cellular 
dynamics ...

Synthesis, Assembly, and Characterization of Monolayer Protected Gold Nanoparticle Films for Protein Monolayer Electrochemistry

Colloidal gold nanoparticles protected with alkanethiolate ligands called monolayer protected gold clusters (MPCs) are synthesized and subsequently incorporated into film assemblies that serve as adsorption platforms for protein monolayer electrochemistry (PME). PME is utilized as the model system for studying electrochemical properties of redox proteins by confining them to an adsorption platform at a modified electrode, which also serves as a redox partner for electron transfer (ET) reactions. Studies have shown that gold nanoparticle film assemblies of this nature provide for a more homogeneous protein adsorption environment and promote ET without distance dependence compared to the more traditional systems modified with alkanethiol self-assembled monolayers (SAM).1-3 In this paper, MPCs functionalized with hexanethiolate ligands are synthesized using a modified Brust reaction4 and characterized with ultraviolet visible (UV-Vis) spectroscopy, transmission electron microscopy (TEM), and proton (1H) nuclear magnetic resonance (NMR). MPC films are assembled on SAM modified gold electrode interfaces by using a "dip cycle" method of alternating MPC layers and dithiol linking molecules. Film growth at gold electrode is tracked electrochemically by measuring changes to the double layer charging current of the system. Analogous films assembled on silane modified glass slides allow for optical monitoring of film growth and cross-sectional TEM analysis provides an estimated film thickness. During film assembly, manipulation of the MPC ligand protection as well as the interparticle linkage mechanism allow for networked films, that are readily adaptable, to interface with redox protein having different adsorption mechanism. For example, Pseudomonas aeruginosa azurin (AZ) can be adsorbed hydrophobically to dithiol-linked films of hexanethiolate MPCs and cytochrome c (cyt c) can be immobilized electrostatically at a carboxylic acid modified MPC interfacial layer. In this report, we focus on the film protocol for the AZ system exclusively. Investigations involving the adsorption of proteins on MPC modified synthetic platforms could further the understanding of interactions between biomolecules and man-made materials, and consequently aid the development of biosensor schemes, ET modeling systems, and synthetic biocompatible materials.5-8

Alkanethiolate stabilized gold colloids known as monolayer protected clusters (MPCs) are synthesized, characterized, and assembled into thin films as an adsorption interface for protein monolayer electrochemistry of simple redox protein like Pseudomonas aeruginosa azurin (AZ) and cytochrome c (cyt c).

Sintesi, assemblaggio e caratterizzazione di film monostrato Protetta delle nanoparticelle d&#39;oro per Elettrochimica proteine ​​monostrato

Colloidal gold nanoparticles protected with alkanethiolate ligands called monolayer protected gold clusters (MPCs) are synthesized and subsequently ...

Polymer Microarrays for High Throughput Discovery of Biomaterials

The discovery of novel biomaterials that are optimized for a specific biological application is readily achieved using polymer microarrays, which allows a combinatorial library of materials to be screened in a parallel, high throughput format1. Herein is described the formation and characterization of a polymer microarray using an on-chip photopolymerization technique 2. This involves mixing monomers at varied ratios to produce a library of monomer solutions, transferring the solution to a glass slide format using a robotic printing device and curing with UV irradiation. This format is readily amenable to many biological assays, including stem cell attachment and proliferation, cell sorting and low bacterial adhesion, allowing the ready identification of 'hit' materials that fulfill a specific biological criterion3-5. Furthermore, the use of high throughput surface characterization (HTSC) allows the biological performance to be correlated with physio-chemical properties, hence elucidating the biological-material interaction6. HTSC makes use of water contact angle (WCA) measurements, atomic force microscopy (AFM), X-ray photoelectron spectroscopy (XPS) and time-of-flight secondary ion mass spectrometry (ToF-SIMS). In particular, ToF-SIMS provides a chemically rich analysis of the sample that can be used to correlate the cell response with a molecular moiety. In some cases, the biological performance can be predicted from the ToF-SIMS spectra, demonstrating the chemical dependence of a biological-material interaction, and informing the development of hit materials5,3.

A description of the formation of a polymer microarray using an on-chip photopolymerization technique. The high throughput surface characterization using atomic force microscopy, water contact angle measurements, X-ray photoelectron spectroscopy and time of flight secondary ion mass spectrometry and a cell attachment assay is also described.

Microarrays polimerici per Discovery High Throughput di Biomateriali

The discovery of novel biomaterials that are optimized for a specific biological application is readily achieved using polymer microarrays, which allows a ...

Optical Detection of E. coli Bacteria by Mesoporous Silicon Biosensors

A label-free optical biosensor based on a nanostructured porous Si is designed for rapid capture and detection of Escherichia coli K12 bacteria, as a model microorganism. The biosensor relies on direct binding of the target bacteria cells onto its surface, while no pretreatment (e.g.&#160;by cell lysis) of the studied sample is required. A mesoporous Si thin film is used as the optical transducer element of the biosensor. Under white light illumination, the porous layer displays well-resolved Fabry-P&#233;rot fringe patterns in its reflectivity spectrum. Applying a fast Fourier transform (FFT) to reflectivity data results in a single peak. Changes in the intensity of the FFT peak are monitored. Thus, target bacteria capture onto the biosensor surface, through antibody-antigen interactions, induces measurable changes in the intensity of the FFT peaks, allowing for a &#39;real time&#39; observation of bacteria attachment.
The mesoporous Si film, fabricated by an electrochemical anodization process, is conjugated with monoclonal antibodies, specific to the target bacteria. The immobilization, immunoactivity and specificity of the antibodies are confirmed by fluorescent labeling experiments. Once the biosensor is exposed to the target bacteria, the cells are directly captured onto the antibody-modified porous Si surface. These specific capturing events result in intensity changes in the thin-film optical interference spectrum of the biosensor. We demonstrate that these biosensors can detect relatively low bacteria concentrations (detection limit of 104 cells/ml) in less than an hour.

Optical Detection of E. coli Bacteria by Mesoporous Silicon Biosensors

A label-free optical biosensor for rapid bacteria detection is introduced. The biosensor is based on a nanostructured porous Si, which is designed to directly capture the target bacteria cells onto its surface. We use monoclonal antibodies, immobilized onto the porous transducer, as the capture probes. Our studies demonstrate the applicability of these biosensors for the detection of low bacterial concentrations within minutes with no prior sample processing (such as cell lysis).

Rilevamento ottico di<em&gt; E. coli</em&gt; Batteri di mesoporosi Silicon Biosensors

A label-free optical biosensor based on a nanostructured porous Si is designed for rapid capture and detection of Escherichia coli K12 bacteria, as a ...

Characteristics of Precipitation-formed Polyethylene Glycol Microgels Are Controlled by Molecular Weight of Reactants

This work describes the formation of poly(ethylene glycol) (PEG) microgels via a photopolymerized precipitation reaction. Precipitation reactions offer several advantages over traditional microsphere fabrication techniques. Contrary to emulsion, suspension, and dispersion techniques, microgels formed by precipitation are of uniform shape and size, i.e.&#160;low polydispersity index, without the use of organic solvents or stabilizers. The mild conditions of the precipitation reaction, customizable properties of the microgels, and low viscosity for injections make them applicable for in vivo purposes. Unlike other fabrication techniques, microgel characteristics can be modified by changing the starting polymer molecular weight. Increasing the starting PEG molecular weight increased microgel diameter and swelling ratio. Further modifications are suggested such as encapsulating molecules during microgel crosslinking. Simple adaptations to the PEG microgel building blocks are explored for future applications of microgels as drug delivery vehicles and tissue engineering scaffolds.

This work describes the formation of poly(ethylene glycol) (PEG) microgels via a photopolymerized precipitation reaction. Increasing the PEG molecular weight increased microgel diameter and swelling ratio. Simple adaptations to the PEG microgel precipitation reaction are explored for future applications of microgels as drug delivery vehicles and tissue engineering scaffolds.

This work describes the formation of poly(ethylene glycol) (PEG) microgels via a photopolymerized precipitation reaction. Precipitation reactions offer ...

Hydrogel Nanoparticle Harvesting of Plasma or Urine for Detecting Low Abundance Proteins

Novel biomarker discovery plays a crucial role in providing more sensitive and specific disease detection. Unfortunately many low-abundance biomarkers that exist in biological fluids cannot be easily detected with mass spectrometry or immunoassays because they are present in very low concentration, are labile, and are often masked by high-abundance proteins such as albumin or immunoglobulin. Bait containing poly(N-isopropylacrylamide) (NIPAm) based nanoparticles are able to overcome these physiological barriers. In one step they are able to capture, concentrate and preserve biomarkers from body fluids. Low-molecular weight analytes enter the core of the nanoparticle and are captured by different organic chemical dyes, which act as high affinity protein baits. The nanoparticles are able to concentrate the proteins of interest by several orders of magnitude. This concentration factor is sufficient to increase the protein level such that the proteins are within the detection limit of current mass spectrometers, western blotting, and immunoassays. Nanoparticles can be incubated with a plethora of biological fluids and they are able to greatly enrich the concentration of low-molecular weight proteins and peptides while excluding albumin and other high-molecular weight proteins. Our data show that a 10,000 fold amplification in the concentration of a particular analyte can be achieved, enabling mass spectrometry and immunoassays to detect previously undetectable biomarkers.

Several pathological biomarkers cannot be easily detected by current techniques because of their low concentration in biological fluids, the presence of degrading enzymes, and large amounts of high molecular weight proteins. Chemically functionalized hydrogel nanoparticles can harvest, preserve and concentrate low abundance proteins enabling the detection of previously undetectable biomarkers.

Hydrogel nanoparticelle raccolta di plasma o nelle urine per il rilevamento di proteine ​​a basso Abbondanza

Novel biomarker discovery plays a crucial role in providing more sensitive and specific disease detection. Unfortunately many low-abundance biomarkers ...

From Fast Fluorescence Imaging to Molecular Diffusion Law on Live Cell Membranes in a Commercial Microscope

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the regulation of many cellular functions. However, due to the fast dynamics and the tiny structures involved, a very high spatio-temporal resolution is required to catch the real behavior of molecules. Here we present the experimental protocol for studying the dynamics of fluorescently-labeled plasma-membrane proteins and lipids in live cells with high spatiotemporal resolution. Notably, this approach doesn&#8217;t need to track each molecule, but it calculates population behavior using all molecules in a given region of the membrane. The starting point is a fast imaging of a given region on the membrane. Afterwards, a complete spatio-temporal autocorrelation function is calculated correlating acquired images at increasing time delays, for example each 2, 3, n repetitions. It is possible to demonstrate that the width of the peak of the spatial autocorrelation function increases at increasing time delay as a function of particle movement due to diffusion. Therefore, fitting of the series of autocorrelation functions enables to extract the actual protein mean square displacement from imaging (iMSD), here presented in the form of apparent diffusivity vs average displacement. This yields a quantitative view of the average dynamics of single molecules with nanometer accuracy. By using a GFP-tagged variant of the Transferrin Receptor (TfR) and an ATTO488 labeled 1-palmitoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (PPE) it is possible to observe the spatiotemporal regulation of protein and lipid diffusion on &#181;m-sized membrane regions in the micro-to-milli-second time range.

Spatial distribution and temporal dynamics of plasma membrane proteins and lipids is a hot topic in biology. Here this issue is addressed by a spatio-temporal image fluctuation analysis that provides conceptually the same physical quantities of single particle tracking, but it uses small molecular labels and standard microscopy setups.

Da Veloce imaging di fluorescenza di Molecular legge Diffusione su membrane cellulare dal vivo in un microscopio commerciale

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the ...

Design and Construction of Artificial Extracellular Matrix (aECM) Proteins from Escherichia coli for Skin Tissue Engineering

Recombinant technology is a versatile platform to create novel artificial proteins with tunable properties. For the last decade, many artificial proteins that have incorporated functional domains derived from nature (or created de novo) have been reported. In particular, artificial extracellular matrix (aECM) proteins have been developed; these aECM proteins consist of biological domains taken from fibronectin, laminins and collagens and are combined with structural domains including elastin-like repeats, silk and collagen repeats. To date, aECM proteins have been widely investigated for applications in tissue engineering and wound repair. Recently, Tjin and coworkers developed integrin-specific aECM proteins designed for promoting human skin keratinocyte attachment and propagation. In their work, the aECM proteins incorporate cell binding domains taken from fibronectin, laminin-5 and collagen IV, as well as flanking elastin-like repeats. They demonstrated that the aECM proteins developed in their work were promising candidates for use as substrates in artificial skin. Here, we outline the design and construction of such aECM proteins as well as their purification process using the thermo-responsive characteristics of elastin.

Design and Construction of Artificial Extracellular Matrix aECM Proteins from Escherichia coli for Skin Tissue Engineering

Recombinant technologies have enabled material designers to create novel artificial proteins with customized functionalities for tissue engineering applications. For example, artificial extracellular matrix proteins can be designed to incorporate structural and biological domains derived from native ECMs. Here, we describe the construction and purification of aECM proteins containing elastin-like repeats.

Progettazione e Costruzione di Artificiale matrice extracellulare (AECM) Proteine ​​da<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Per la pelle Ingegneria dei Tessuti

Recombinant technology is a versatile platform to create novel artificial proteins with tunable properties. For the last decade, many artificial proteins ...

Microfluidic Genipin Deposition Technique for Extended Culture of Micropatterned Vascular Muscular Thin Films

The chronic nature of vascular disease progression requires the development of experimental techniques that simulate physiologic and pathologic vascular behaviors on disease-relevant time scales. Previously, microcontact printing has been used to fabricate two-dimensional functional arterial mimics through patterning of extracellular matrix protein as guidance cues for tissue organization. Vascular muscular thin films utilized these mimics to assess functional contractility. However, the microcontact printing fabrication technique used typically incorporates hydrophobic PDMS substrates. As the tissue turns over the underlying extracellular matrix, new proteins must undergo a conformational change or denaturing in order to expose hydrophobic amino acid residues to the hydrophobic PDMS surfaces for attachment, resulting in altered matrix protein bioactivity, delamination, and death of the tissues.
Here, we present a microfluidic deposition technique for patterning of the crosslinker compound genipin. Genipin serves as an intermediary between patterned tissues and PDMS substrates, allowing cells to deposit newly-synthesized extracellular matrix protein onto a more hydrophilic surface and remain attached to the PDMS substrates. We also show that extracellular matrix proteins can be patterned directly onto deposited genipin, allowing dictation of engineered tissue structure. Tissues fabricated with this technique show high fidelity in both structural alignment and contractile function of vascular smooth muscle tissue in a vascular muscular thin film model. This technique can be extended using other cell types and provides the framework for future study of chronic tissue- and organ-level functionality.

We present a method for microfluidic deposition of patterned genipin and fibronectin on PDMS substrates, allowing extended viability of vascular smooth muscle cell-dense tissues. This tissue fabrication method is combined with previous vascular muscular thin film technology to measure vascular contractility over disease-relevant time courses.

Microfluidic genipina Deposizione Tecnica per la cultura estesa di micropatterned vascolari muscolari Thin Films

The chronic nature of vascular disease progression requires the development of experimental techniques that simulate physiologic and pathologic vascular ...