この作品は、NanoHealthプレセンター賞（W81XWH-11-2から0168まで）と、がんナノメディシンのためにテキサス州センター（1U54CA151668-01）のアライアンスによって資金を供給された。

1。チップの作製<ol><li>加水分解されたケイ酸塩前駆体溶液を用いて起動することによってチップのコーティング溶液を作成します。エタノール17 mLでオルトケイ酸テトラエチル（TEOS）の14 mLを混合し、強力な攪拌しながら脱イオン水と6M塩酸0.5 mLを6.5 mLの（1200 rpm）のホットプレートを攪拌使用します。攪拌を一定に保ち、2時間、80℃でこの溶液を加熱する。 </li><li>強く攪拌しながら室温でエタノール10mlに所望のトリブロックcoploymer（プルロニックF127、L121およびP123）を追加することにより、ポリマー溶液を準備します。室温で強力な2時間撹拌し、続いてトリブロック共重合体溶液にケイ酸塩溶液（ステップ1.1から）7.5 mlを加えることによって混合物を完了します。これは最終的なコーティング溶液を表しています。 </li><li> 20秒間1500rpmの速度でスピンコーティングすることにより、4インチシリコンウエハにコーティング溶液の1 mLを適用します。 80その後、熱℃で12時間。 </li><li>有機suを削除するには、フィルムを加熱する425温度1℃当たりの分を上げることによってrfactant°C、その後5時間焼く。 </li><li>酸素プラズマアッシング（ - 3プラズマシステムプラズマアッシャー）とメソポーラスシリカ（MPS）チップ表面を前処理。 （O 2流量：80 SCCM、消費電力：300 W、時間：10分）。 </li><li> N 2グローブボックス内で室温で72時間DI水（19:1）溶液：任意の表面化学修飾：メタノールで3％のシランでsilanateチップ。メタノール、DI水で順次すすぎます。 110℃でファン駆動のオーブンで15分間チップを治す。 </li></ol> 2。サンプル前処理<ol><li>最終濃度が0.01％TFA、5％ACNであること、各血清サンプルにTFAとACNを追加します。混在させる渦。 </li><li> 30分間室温でテーブル渦シェーカー上で、これらのサンプルを振る。 </li></ol> 3。血清分画<ol><li> 160℃のオーブンで一晩プリベークチップ℃にまた、STOR電子デシケーター内のチップ空気中の周囲の水で表面の水和を防ぐために使用する準備ができるまで。 </li><li>チップの表面上に存在する可能性のある粒子をほこりに圧縮空気を使用しています。 </li><li>プレハブをカットし、井戸の希望する番号を含めることCultureWellチャンバーカバーガラスを購入しました。 100％エタノールとその後MPSチップ表面上の場所できれいなカバーガラス。チップとの完全なシールを確保するためにピンセットでカバーガラスを押し下げます。 </li><li>各ウェルに3ミリメートルに血清サンプルのピペット10μL。室温で加湿チャンバー内で30分間インキュベートします。 </li><li>井戸から血清をピペットで廃棄します。大規模なタンパク質を洗い流すために脱イオン水のピペット10μLを各ウェルに。 4回繰り返します。 </li><li>よく、各サンプルにピペット5μLの溶出バッファー（0.1％TFA + 50％ACN）。溶出緩衝液を混合することもで周りにピペットチップを移動させながら30回ピペッティングします。 （のみの溶出バッファーを防ぐために、一度に1から2のサンプルを溶出バッファーを適用するあっという間に蒸発から）。 </li><li> MALDI-TOF分析を実行する準備ができるまで混合した後、マイクロ遠心チューブ内のすべての溶出緩衝液と場所をピペット。 </li><li>生物試料の複雑性をエミュレートするために、我々のオンチップ·分別システムと低分子量の種を収穫に濃縮効果を評価するために、我々は広いと二〇から六種を数え、タンパク質やペプチドの標準混合物を選択し、組み立て分子量（900から66 500 Da）のとPI（4.0から10.2）と濃度（0.5から8ピコモル/μL）の範囲（ 表1の蛋白質のリストを参照してください）。 </li></ol> 4。ペプチドのMALDI-TOF分析<ol><li> MALDIターゲットプレートにサンプルを0.5μLをスポットし、乾燥することができます。 </li><li>スポット0.5μLマトリックス（α-シアノ-4 - ヒドロキシ桂皮酸（CHCA）、5 g / L）を0.1％TFAを含む50％アセトニトリルのトランス-3,5 - ジメトキシ-4 - ヒドロキシ桂皮酸（SA）の飽和溶液と共結晶化することができます。&lt;/ LI&gt; <li>各キャリブレーションスポットにキャリブレーション溶液0.5μLをスポットし、乾燥することができます。 </li><li> MALDI-TOF質量分析計にターゲットプレートを挿入します。マシンは、サンプルあたりの4200と3000ショットのレーザ強度​​の正反射モードに設定する必要があります。選択した質量範囲は2000 Daのターゲット質量で800から5000ダなければなりません。 </li><li>リニアモードで同じMALDI-TOF分析を実行しますが、900万ダまたは3000〜70,000 Daと5000 Daのターゲット質量を質量範囲を変更します。 </li></ol> 5。データ解析<ol><li>生スペクトルはConvertPeakListソフトウェアを使用して処理された、データは前処理用のソフトウェアをSpecAlignにエクスポートされました。すべてのスペクトルはPAFFT相関法と強度をそれぞれに対応するスペクトルの総イオン電流（TIC）に正規化されたを使用して整列させた。すべてのスペクトルを平滑化し、それぞれ4と0.5の係数で解除noisedた。ピークは0.5、質量21の窓と高さの基準で検出された比1.5は、負の値は分析の前に削除されました。 </li><li>階層的クラスタリングは、クラスタ3.0を使用して行い、MapleTreeソフトウェアを使用して可視化した。 MALDI MSデータ（m / zのピーク強度）は、対数変換、正規化され、中央値を中心とした。ピアソンの相関はサンプル間の距離を計算するために使用された、完全なリンケージクラスタリングを行った。 </li><li>独立スチューデントt-検定前に教師なし階層的クラスタリング解析に検出された各ピークのMS群（n = 2のグループ）との間の比較のために使用されていました。 0.02以下のP値は異なるメソポーラスプロテオームチップ（大孔対小孔）間の差収穫ペプチドおよびタンパク質を選択することが重要と考えられた。 </li></ol> 6。代表的な結果 図1に示すように、本 ​​研究で我々はnanotexturesの様々なメソポーラスシリカ薄膜のシリーズを作製し、総合的に探求ヒト血清からの選択的取り込みと豊かな低分子のペプチドおよびタンパク質のIRを使用する。 図2aおよび b 900〜10,000 Daの範囲で、3,000の範囲内のタンパク質のペプチドを未処理の血清試料のMSスペクトルを示す〜70,000それぞれダ。これらのスペクトルはよくイオン化され、非常に豊富、高い分子量の存在はアルブミンなど（HMW）蛋白質による低分子領域での信号の抑制を示しています。 図2c、dは MPS L121による分画後、血清試料のMSスペクトルを描く（孔径、6 nm）の。大きな分子の大部分は、LMW成分の大幅な充実をもたらして、枯渇しています。コントロールとして、同じ血清試料は、LMWP回復のためのMPS薄膜の特異性を評価するために、無孔純粋なシリカ表面に塗布した。 図2eおよび fに見られるように、PEPの有意な収穫はありませんでした非多孔性シリカから潮の干満や蛋白質。したがって、それはメソポーラスアーキテクチャではなく、LMWPの濃縮で支配的な要因を構成するシリカの表面親和性であると結論することができます。 孔径を精密に制御バリエーションが疎水性ブロックの長さが異なるとの共重合体の使用によって達成することができます。設計されたタンパク質やペプチド混合物を使用することにより、LMWペプチドおよびタンパク質の回復効果で細孔径の影響は、4つのプルロニック界面活性剤（F127、P123、L121、およびL121加え​​て膨潤剤）から調製されたMPS薄膜を用いて調べた別のボリューム比のそれぞれ3.7 nmで、5.2 nmで、7.4 nm、および9.0 nmの細孔径を形成する親水性および疎水性成分の。細孔サイズのこの範囲は、サイズと形状の除外（ 図3）を介してペプチドと同一の血清サンプルからのタンパク質の異なるレパートリーの回復につながった。高分子量dでタンパク質のスペクトルチップの各タイプのカットオフ分子をemonstrate。 HMWタンパク質の大きさに依存するの枯渇に加え、標準溶液のオンチップ·分別は、差動と細孔径に関連付けられたLMW種の選択的濃縮を表示します。 図3bに示す双方向の階層的クラスタリングは、別のMSCを用いて得られたLMW標準濃縮パターンを示しています。すべてのペプチドは、チップのカットオフ分子以下である場合であっても、細孔サイズと閉じ込められた種の分子量の間に正の相関があります。小さなペプチドは小さい細孔を有するチップで、より効率的に回収されている間に大きな孔を有するMSC、最大9 nmは、優先的に、より大きなペプチドを収穫。メソポーラス配置の構造変換は、テンプレートポリマーの濃度を調整することにより行った。テンプレートのポリマーの濃度を増加させると、相間の界面の曲率の減少をもたらしたの結果、球状から円筒状の構造体に相互に進行を開始水、共重合体、およびケイ酸塩、。プルロニックF127は、その高い分子量、構造の周期性のこの高度を持っています。ソリューションを開始するにはF127の濃度を増加させることにより、異なるMPS薄膜周期的ナノ構造を3次元ナノ構造から2次元ナノ構造を得ることができます。より望ましいナノ細孔の相互接続性とアクセス可能なナノ細孔の形態を有する3次元立方晶とハニカム六角形のナノ構造は、彼らが同様の細孔サイズ分布および血清中の同じ分子量カットオフを共有するにもかかわらず、選択的に2次元六方晶構造よりLMWペプチドを豊かで優れた性能を発揮分別（ 図4）。また、我々はチップ表面を前処理しアッシング酸素プラズマを導入することにより、MPSチップ上に有機シランの合理化共役。質的に選択上の静電効果を研究するために、IVEは、オンチップ濃縮は、我々はタンパク質やペプチド混合物を使用しています。 L121で調製したMPSチップ上に分画し、化学官能基を結合させたプロテオミクスの標準溶液のMS分析は、 図5に示されています。正に帯電したと負に帯電したペプチドや低分子タンパク質がそれぞれアニオン性およびカチオン性チップ上に捕捉されています。正の正味電荷を有するペプチドを回収し、複数のMPSチップの定量的な比較は、 図5aに表示されます。負電荷とすべての変更（軽微な負電荷を持つもともと）なしでチップを搭載したチップは、APTES（-NH 2）で修飾されたチップよりも、これらのペプチドの有意に高い濃縮を示す。 図5bに示すように逆に、正に帯電したMPSチップは、負の正味電荷と、それらのペプチドを回復するための卓越した能力を持っています。 α-エンドルフィンは有意な変化dが表示されませんが約6そのPIへのUE。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/3876/3876fig1.jpg" /> 図1 MPSチップの分別とLMW濃縮の原理。大きな種が毛穴の外に残っている間、サンプル表面にスポッティングした後、LMWのタンパク質やペプチドは、孔内にトラップされ、洗浄工程中に削除されます。濃縮画分を溶出し、MALDIで分析されています。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/3876/3876fig2.jpg" /> 図2メソポーラスシリカ薄膜チップを用いたペプチド濃縮。前に、低質量範囲（900〜10 000 Da）と高質量範囲（3000から70 000 Da）を（a、b）の両方の後MALDI MSプロファイル（C、D）メソポーラスシリカ薄膜の血清処理（ L121、6 nm）の。空白の非多孔性シリカの表面を（E、F）を使用する場合は分子の回復が大幅に削減されます。 <img alt="図3" src=&quot;/ files/ftp_upload/3876/3876fig3.jpg&quot; /&gt; 図3 MPSチップの分子カットオフとサイズに依存する濃縮。細孔の大きさに相関する各MPSチップのカットオフ特性の分子を示すMALDIスペクトルの（a）の拡大図。異なるチップ間のペプチド混合機能の（b）の双方向の階層的クラスタリング。赤や黄色の色の強度は相対的なペプチド濃度を示しています。小さなペプチドは、（900から3500ダから）優先的に小さい細孔を有するチップから回収されながら、大きな細孔は、分子量の大きいペプチド（3600から8500 Daまで）の収穫を強化しました。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/3876/3876fig4.jpg" /> 図4 MPS薄膜と異なるナノ構造の選択的回収の物理的特性評価。 XRDパターン（A、B、C）、TEM（はめ込み、B、C）、前駆体溶液の異なる濃度でプルロニックF127：4.0×10 -3 M（）、6.0×10 -3 M（b）、および8.0×10 -2 M（C）。 （d）の3D立方体および3Dの六角形のF127プロテオームチップ（カブと六角、それぞれ）の選択的なペプチドの回復を示す検出強度のバーグラフ。異なる構造の変更は、選択的濃縮を提示します。 <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3876/3876fig5_lg.jpg"><img alt="図5" src="/files/ftp_upload/3876/3876fig5.jpg" /></a> 図5：異なる表面機能を持つチップのチャージ固有のリカバリ。官能チップ上に選択的にキャプチャされたペプチドの検出のMS強度のバーグラフ。それらの等電点に応じて、ペプチドは、肯定的または否定的にpH 7.0でご利用いただけます。 （a）は正のペプチド（（1）DES-Arg1と、ブラジキニン、（2）ブラジキニン、（3）物質P-アミド、（4）ニューロテンシン、（5）ACTH（1-17）、（6）ACTH（7 - 38））具体的に負に帯電したシュールで濃縮される顔。 （b）負のペプチド（（7）Glu1-フィブリノペプチドA、B、（8）α-エンドルフィン、（9）ACTH（18から39）、（10）インスリン、（11）EGF、（12）インスリン様GFII）がある具体的に正に帯電した表面上に濃縮。 <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3876/3876fig6_lg.jpg"><img alt="図6" src="/files/ftp_upload/3876/3876fig6.jpg" /></a> 図6で分画し、血清の安定化を内蔵しています。 （a）のLMWのペプチドおよびタンパク質の代表的なMALDIプロファイルは、直ちに血清分画（上）後、または室温でのオンチップストレージの3週間（下）の後に溶出した。 （b）は上から下へ：室温で3wk MPSチップの貯蔵の後、新たに分画し、血清や血清を分画し1をレプリケートするために比較して、各複製で検出されたMSピークの平均強度の線形回帰分析。式、CVと決定係数（R 2）示されています。

<ol>
	<li>Wulfkuhle, J. D., Liotta, L. A., Petricoin, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+applications+for+the+early+detection+of+cancer.">Proteomic applications for the early detection of cancer.</a> Nat. Rev. Cancer. 3, 267-275 (2003).</li><li>Etzioni, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+case+for+early+detection.">The case for early detection.</a> Nat. Rev. Cancer. 3, 243-252 (2003).</li><li>Hanash, S. M., Pitteri, S. J., Faca, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mining+the+plasma+proteome+for+cancer+biomarkers.">Mining the plasma proteome for cancer biomarkers.</a> Nature. 452, 571-579 (2008).</li><li>Liotta, L. A., Ferrari, M., Petricoin, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+proteomics:+written+in+blood.">Clinical proteomics: written in blood.</a> Nature. 425, 905-905 (2003).</li><li>Petricoin, E. F., Belluco, C., Araujo, R. P., Liotta, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+blood+peptidome:+a+higher+dimension+of+information+content+for+cancer+biomarker+discovery.">The blood peptidome: a higher dimension of information content for cancer biomarker discovery.</a> Nat. Rev. Cancer. 6, 961-967 (2006).</li><li>Anderson, N. L., Anderson, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+plasma+proteome:+history,+character,+and+diagnostic+prospects.">The human plasma proteome: history, character, and diagnostic prospects.</a> Mol. Cell Proteomics. 1, 845-867 (2002).</li><li>Gorg, A., Weiss, W., Dunn, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+two-dimensional+electrophoresis+technology+for+proteomics.">Current two-dimensional electrophoresis technology for proteomics.</a> Proteomics. 4, 3665-3685 (2004).</li><li>Liu, H., Sadygov, R. G., Yates, J. R., 3rd, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+model+for+random+sampling+and+estimation+of+relative+protein+abundance+in+shotgun+proteomics.">A model for random sampling and estimation of relative protein abundance in shotgun proteomics.</a> Anal. Chem. 76, 4193-4201 (2004).</li><li>Rabilloud, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-dimensional+gel+electrophoresis+in+proteomics:+old,+old+fashioned,+but+it+still+climbs+up+the+mountains.">Two-dimensional gel electrophoresis in proteomics: old, old fashioned, but it still climbs up the mountains.</a> Proteomics. 2, 3-10 (2002).</li><li>Hu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tailoring+of+the+nanotexture+of+mesoporous+silica+films+and+their+functionalized+derivatives+for+selectively+harvesting+low+molecular+weight+protein.">Tailoring of the nanotexture of mesoporous silica films and their functionalized derivatives for selectively harvesting low molecular weight protein.</a> ACS Nano. 4, 439-451 (2010).</li><li>Bouamrani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesoporous+silica+chips+for+selective+enrichment+and+stabilization+of+low+molecular+weight+proteome.">Mesoporous silica chips for selective enrichment and stabilization of low molecular weight proteome.</a> Proteomics. 10, 496-505 (2010).</li></ol>

我々は、開示することは何もありません。

証拠は、循環プロテオームの低分子領域は、病気の早期発見のための診断マーカーの豊富な源であること実装されています。この技術では、様々な孔径、細孔構造と選択的にペプチドと低分子量蛋白質を豊かにするための変更でメソポーラスシリカチップのシリーズを発表した。タンパク質の安定性を評価するために、MPSチップは、ヒト血清とインキュベートし、洗浄後乾燥し、室温で3wkために保存されていました。得られたタンパク質/ペプチドのパターンは、新たに分画した血清（ 図6a）のものと同等であったような統計的分析の結果によって確認され、図6bに示された。平均CVで測定したピーク信号の変動を粗血清の12.7パーセントで分画したサンプル用の14.2パーセントと推定された。限界バリエーションがMALDI装置の内部変動に起因すると示唆されなかったそのON-チップの前処理とストレージは、MSタンパク質プロファイルのいずれかに重大な変化を誘発しなかった。同様の実験は、非多孔質シリコン上で実行されています。シリコン表面上のストレージ後に回収された乾燥血清は、MALDI分析の前にMPSのチップ上に分画した。貧しいMSプロファイルは、メソポーラス表面の安定化の利点を実証し得た。以前に仮定メカニズムと同様に、我々は、ナノ細孔内に閉じ込められたLMW種はプロテアーゼのサイズ排除を通じて、またはナノ細孔の限られたスペースでのタンパク質分解活性の立体阻害による分解から保存されていたと仮定した。 MPSチップベースの手法は、複雑な生物学的流体研究のペプチドおよびLMWタンパク質プロファイリングの強力なツールである可能性があります。 MPSチップは、探索のスクリーニングとバイオのために有利な機能を提供し、多数のサンプルの同時処理を達成するためにスケールアップ生産のため製造し、可能にする安価であるマーカー発見。

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント </td></tr><tr><td>テトラエトキシシラン</td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> 131903 </td><td> 98パーセント</td></tr><tr><td>スピンコーター</td><td>ブルーワー科学</td><td> CEE 200X </td><td></td></tr><tr><td>プラズマアッシャー</td><td>ノードソン月</td><td> AP-600 </td><td></td></tr><tr><td>分光エリプソメーター</td><td> JAウーラム社</td><td> M-2000DI </td><td></td></tr><tr><td> MALDI-TOF </td><td>アプライドバイオシステムズ</td><td>ボイジャー-DE-STR </td><td></td></tr><tr><td> α-シアノ-4 - ヒドロキシ桂皮酸</td><td>シグマアルドリッチ（株） </td><td> C8982 </td><td> MALDI-TOF用のマトリックス</td></tr><tr><td>トランス-3,5 - ジメトキシ-4 - ヒドロキシ桂皮酸</td><td>シグマアルドリッチ（株） </td><td> 85429 </td><td> MALDI-TOF用のマトリックス</td></tr><tr><td>ホットプレートをかき混ぜる</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td> 11から475-30Q </td><td></td></tr><tr><td> CultureWellチャンバーカバーガラス</td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> GBL103350 </td><td> 3 mmの直径。 ×1 mmの深さ、3-10μL、滅菌</td></tr><tr><td>プルロニックF 127 </td><td> BASF </td><td></td><td> PEO 106-PPO 70-PEO 106 </td></tr><tr><td>プルロニックL121 </td><td> BASF </td><td></td><td> PEO 5-PPO 70-PEO 5 </td></tr><tr><td>プルロニックP123 </td><td> BASF </td><td></td><td> PEO 20-PPO 70-PEO 20 </td></tr></tbody></table> 表1物理化学的性質と設計された濃度（分子量およびiso選択されたペプチドとタンパク質の規格の電点）。

low molecular weight protein enrichment on mesoporous silica thin films for biomarker discovery

循環バイオマーカーの同定は、非侵襲的な早期診断と予後のアプローチだけでなく、治療効果のモニタリングのための大きな可能性を保持しています。1〜3または組織や細胞から放出小さなタンパク質で構成される循環する低分子量のプロテオーム（LMWP）大規模なタンパク質のタンパク質分解に由来するペプチド断片が、患者の病態に関連付けられており、おそらく病気の状態を反映しています。これらの潜在的な臨床応用にもかかわらず、4,5されており、質量分析（MS）の使用はLMWPをからプロファイルする生物学的液体は非常にために、血清中のタンパク質およびペプチド濃度の広いダイナミックレンジに挑戦であることが判明した。6サンプル前処理なしで、より高濃度タンパク質のいくつかは、血清/血漿中の低濃度種の検出を不明瞭。そのような二次元ポリアクリルアミドゲル-ELとして、現在のプロテオミクスベースのアプローチ、ectrophoresis（2D-PAGE）とショットガンプロテオミクスの方法は、スループットの低い労働集約型であり、臨床応用のための限られた適合性を提供します。7月9日したがって、より効果的な戦略は、血液からLMWPを分離し、臨床試料のハイスループットスクリーニングを可能にするために必要とされる。 ここでは、特にターゲットとLMWPを豊かにするメソポーラスシリカのチップに基づいて、高速、効率的かつ信頼性の高いマルチ分画システムを提案する。10,11メソポーラスシリカ（MPS）、ナノスケールで調整可能な機能を備えた薄膜はトリブロック共重合体テンプレートの経路を用いて作製した。前駆体溶液の異なるポリマーテンプレートおよびポリマー濃度を用いて、様々な細孔径分布、細孔構造、接続性と表面特性が決定され、低質量のタンパク質の選択的回収に適用した。それらの物理化学的性質に応じて異なるサブクラスに富むペプチドの選択的な解析には専用ます回復と低濃度種の検出の効率化を見据え、。質量分析と統計分析との組み合わせで、我々は、メソポーラスシリカ薄膜のナノ相特性と低質量プロテオーム収穫の特異性と有効性の相関関係を示した。結果はここに複雑な生物学的流体からLMWP収穫のための従来の方法に強力な代替手段を提供するために、ナノテクノロジーベースの技術の可能性を明らかに提示した。材料特性を調整する機能、低コスト生産のための能力のために、サンプルの収集、および分析のために大幅に減少したサンプルの要件のシンプルさと速さは、この小説ナノテクノロジーは、実質的にプロテオミクス、バイオマーカーの研究と臨床プロテオミクスの分野に影響を与えます評価。

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Low Molecular Weight Protein Enrichment on Mesoporous Silica Thin Films for Biomarker Discovery

我々は、ヒト血清からの低分子量タンパク質およびペプチドの選択的回収のためのメソポーラスシリカ薄膜に基づいて技術を開発しました。私たちのメソポーラスチップの物理化学的性質を細かくペプチド濃縮の実質的な制御を提供し、その結果、診断のため血清プロテオームのプロファイリングをするように調整されました。

バイオマーカー探索のためのメソポーラスシリカ薄膜の低分子量蛋白質の濃縮

The identification of circulating biomarkers holds great potential for non invasive approaches in early diagnosis and prognosis, as well as for the ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

13.3K ビュー.  The Methodist Hospital Research Institute. 我々は、ヒト血清からの低分子量タンパク質およびペプチドの選択的回収のためのメソポーラスシリカ薄膜に基づいて技術を開発しました。私たちのメソポーラスチップの物理化学的性質を細かくペプチド濃縮の実質的な制御を提供し、その結果、診断のため血清プロテオームのプロファイリングをするように調整されました。

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Developing Custom Chinese Hamster Ovary-host Cell Protein Assays using Acoustic Membrane Microparticle Technology

Custom assays for unique proteins are often limited to time consuming manual detection and quantitation techniques such as ELISA or Western blots due to the complexity of development on alternate platforms. BioScale's proprietary Acoustic Membrane MicroParticle (AMMP) technology allows sandwich immunoassays to be easily developed for use on the ViBE platform, providing better sensitivity, reproducibility, and automated operation. Provided as an example, this protocol outlines the procedure for developing a custom Chinese Hamster Ovary- Host Cell Protein (CHO-HCP) assay. The general principles outlined here can be followed for the development of a wide variety of immunoassays.
An AMMP assay measures antigen concentration by measuring changes in oscillation frequency caused by the binding of microparticles to the sensor surface to calculate. It consists of four major components: (1) a cartridge that contains a functionalized eight sensor chip (2) antibody labeled magnetic microparticles, (3) hapten tagged antibody that binds to the surface of the functionalized chip (4) samples containing the antigen of interest. BioScale's biosensor is a resonant device that contains eight individual membranes with separate fluidic paths. The membranes change oscillation frequency in response to mass accumulating on the surface and this frequency change is used to quantitate the amount of added mass.
To facilitate use in a wide variety of immunoassays the sensor is functionalized with an anti-hapten antibody. Assay specific antibodies are modified through the covalent conjugation of a hapten tag to one antibody and biotin to the other. The biotin label is used to bind the antibody to streptavidin coupled magnetic beads which, in combination with the hapten-tagged antibody, are used to capture the analyte in a sandwich. The complex binds to the chip through the anti-hapten/hapten interaction. At the end of each assay run the sensors are cleaned with a dilute acid enabling the sequential analysis of columns from a 96-well plate.
Here, we present the method for developing a custom CHO-HCP AMMP assay for bioprocess development. Developing AMMP assays or modifying existing assays into AMMP assays can provide better performance (reproducibility, sensitivity) in complex samples and reduced operator time. The protocol shows the steps for development and the discussion section reviews representative results. For a more in-depth explanation of assay optimization and customization parameters contact BioScale. This kit offers generic bioprocess development assays such as Residual Protein A, Product titer, and CHO-HCP.

Development of custom assays on the ViBE platform for more sensitive, reproducible, automated results in complex matrices is described. The universal cartridge allows assays to be easily adapted for use with custom assays. This versatility enables rapid development and validation of novel assays or automated versions of existing manual assays, exemplified in this video.

アコースティック膜の微粒子技術を使用してカスタムチャイニーズハムスター卵巣-宿主細胞タンパク質のアッセイを開発する

Custom assays for unique proteins are often limited to time consuming manual detection and quantitation techniques such as ELISA or Western blots due to ...

生物工学

Low-Cost Cryo-Light Microscopy Stage Fabrication for Correlated Light/Electron Microscopy

The coupling of cryo-light microscopy (cryo-LM) and cryo-electron microscopy (cryo-EM) poses a number of advantages for understanding cellular 
dynamics and ultrastructure. First, cells can be imaged in a near native environment for both techniques. Second, due to the vitrification process, samples are
 preserved by rapid physical immobilization rather than slow chemical fixation. Third, imaging the same sample with both cryo-LM and cryo-EM provides correlation of
 data from a single cell, rather than a comparison of "representative samples". While these benefits are well known from prior studies, the widespread use of correlative 
 cryo-LM and cryo-EM remains limited due to the expense and complexity of buying or building a suitable cryogenic light microscopy stage. Here we demonstrate the 
 assembly, and use of an inexpensive cryogenic stage that can be fabricated in any lab for less than $40 with parts found at local hardware and grocery stores. This 
 cryo-LM stage is designed for use with reflected light microscopes that are fitted with long working distance air objectives. For correlative cryo-LM and cryo-EM 
 studies, we adapt the use of carbon coated standard 3-mm cryo-EM grids as specimen supports. After adsorbing the sample to the grid, previously established protocols 
 for vitrifying the sample and transferring/handling the grid are followed to permit multi-technique imaging. As a result, this setup allows any laboratory with a 
 reflected light microscope to have access to direct correlative imaging of frozen hydrated samples.

We demonstrate the fabrication of a low-cost cryogenic stage designed to fit most reflected light microscopes. This lab-built cryogenic stage enables efficient and reliable correlative imaging between cryo-light and cryo-electron microscopy.

相関ライト/電子顕微鏡のための低コストクライオ光学顕微鏡のステージの作製

The coupling of cryo-light microscopy (cryo-LM) and cryo-electron microscopy (cryo-EM) poses a number of advantages for understanding cellular 
dynamics ...

Synthesis, Assembly, and Characterization of Monolayer Protected Gold Nanoparticle Films for Protein Monolayer Electrochemistry

Colloidal gold nanoparticles protected with alkanethiolate ligands called monolayer protected gold clusters (MPCs) are synthesized and subsequently incorporated into film assemblies that serve as adsorption platforms for protein monolayer electrochemistry (PME). PME is utilized as the model system for studying electrochemical properties of redox proteins by confining them to an adsorption platform at a modified electrode, which also serves as a redox partner for electron transfer (ET) reactions. Studies have shown that gold nanoparticle film assemblies of this nature provide for a more homogeneous protein adsorption environment and promote ET without distance dependence compared to the more traditional systems modified with alkanethiol self-assembled monolayers (SAM).1-3 In this paper, MPCs functionalized with hexanethiolate ligands are synthesized using a modified Brust reaction4 and characterized with ultraviolet visible (UV-Vis) spectroscopy, transmission electron microscopy (TEM), and proton (1H) nuclear magnetic resonance (NMR). MPC films are assembled on SAM modified gold electrode interfaces by using a "dip cycle" method of alternating MPC layers and dithiol linking molecules. Film growth at gold electrode is tracked electrochemically by measuring changes to the double layer charging current of the system. Analogous films assembled on silane modified glass slides allow for optical monitoring of film growth and cross-sectional TEM analysis provides an estimated film thickness. During film assembly, manipulation of the MPC ligand protection as well as the interparticle linkage mechanism allow for networked films, that are readily adaptable, to interface with redox protein having different adsorption mechanism. For example, Pseudomonas aeruginosa azurin (AZ) can be adsorbed hydrophobically to dithiol-linked films of hexanethiolate MPCs and cytochrome c (cyt c) can be immobilized electrostatically at a carboxylic acid modified MPC interfacial layer. In this report, we focus on the film protocol for the AZ system exclusively. Investigations involving the adsorption of proteins on MPC modified synthetic platforms could further the understanding of interactions between biomolecules and man-made materials, and consequently aid the development of biosensor schemes, ET modeling systems, and synthetic biocompatible materials.5-8

Alkanethiolate stabilized gold colloids known as monolayer protected clusters (MPCs) are synthesized, characterized, and assembled into thin films as an adsorption interface for protein monolayer electrochemistry of simple redox protein like Pseudomonas aeruginosa azurin (AZ) and cytochrome c (cyt c).

合成、組立、および単分子膜のキャラクタリゼーションは、タンパク質単分子層の電気化学のための金ナノ粒子膜を保護

Colloidal gold nanoparticles protected with alkanethiolate ligands called monolayer protected gold clusters (MPCs) are synthesized and subsequently ...

Polymer Microarrays for High Throughput Discovery of Biomaterials

The discovery of novel biomaterials that are optimized for a specific biological application is readily achieved using polymer microarrays, which allows a combinatorial library of materials to be screened in a parallel, high throughput format1. Herein is described the formation and characterization of a polymer microarray using an on-chip photopolymerization technique 2. This involves mixing monomers at varied ratios to produce a library of monomer solutions, transferring the solution to a glass slide format using a robotic printing device and curing with UV irradiation. This format is readily amenable to many biological assays, including stem cell attachment and proliferation, cell sorting and low bacterial adhesion, allowing the ready identification of 'hit' materials that fulfill a specific biological criterion3-5. Furthermore, the use of high throughput surface characterization (HTSC) allows the biological performance to be correlated with physio-chemical properties, hence elucidating the biological-material interaction6. HTSC makes use of water contact angle (WCA) measurements, atomic force microscopy (AFM), X-ray photoelectron spectroscopy (XPS) and time-of-flight secondary ion mass spectrometry (ToF-SIMS). In particular, ToF-SIMS provides a chemically rich analysis of the sample that can be used to correlate the cell response with a molecular moiety. In some cases, the biological performance can be predicted from the ToF-SIMS spectra, demonstrating the chemical dependence of a biological-material interaction, and informing the development of hit materials5,3.

A description of the formation of a polymer microarray using an on-chip photopolymerization technique. The high throughput surface characterization using atomic force microscopy, water contact angle measurements, X-ray photoelectron spectroscopy and time of flight secondary ion mass spectrometry and a cell attachment assay is also described.

バイオマテリアルのハイスループット検出用高分子マイクロアレイ

The discovery of novel biomaterials that are optimized for a specific biological application is readily achieved using polymer microarrays, which allows a ...

Optical Detection of E. coli Bacteria by Mesoporous Silicon Biosensors

A label-free optical biosensor based on a nanostructured porous Si is designed for rapid capture and detection of Escherichia coli K12 bacteria, as a model microorganism. The biosensor relies on direct binding of the target bacteria cells onto its surface, while no pretreatment (e.g.&#160;by cell lysis) of the studied sample is required. A mesoporous Si thin film is used as the optical transducer element of the biosensor. Under white light illumination, the porous layer displays well-resolved Fabry-P&#233;rot fringe patterns in its reflectivity spectrum. Applying a fast Fourier transform (FFT) to reflectivity data results in a single peak. Changes in the intensity of the FFT peak are monitored. Thus, target bacteria capture onto the biosensor surface, through antibody-antigen interactions, induces measurable changes in the intensity of the FFT peaks, allowing for a &#39;real time&#39; observation of bacteria attachment.
The mesoporous Si film, fabricated by an electrochemical anodization process, is conjugated with monoclonal antibodies, specific to the target bacteria. The immobilization, immunoactivity and specificity of the antibodies are confirmed by fluorescent labeling experiments. Once the biosensor is exposed to the target bacteria, the cells are directly captured onto the antibody-modified porous Si surface. These specific capturing events result in intensity changes in the thin-film optical interference spectrum of the biosensor. We demonstrate that these biosensors can detect relatively low bacteria concentrations (detection limit of 104 cells/ml) in less than an hour.

Optical Detection of E. coli Bacteria by Mesoporous Silicon Biosensors

A label-free optical biosensor for rapid bacteria detection is introduced. The biosensor is based on a nanostructured porous Si, which is designed to directly capture the target bacteria cells onto its surface. We use monoclonal antibodies, immobilized onto the porous transducer, as the capture probes. Our studies demonstrate the applicability of these biosensors for the detection of low bacterial concentrations within minutes with no prior sample processing (such as cell lysis).

を光学的に検出<em&gt; E.大腸菌の</emメソポーラスケイ素バイオセンサーによる&gt;バクテリア

A label-free optical biosensor based on a nanostructured porous Si is designed for rapid capture and detection of Escherichia coli K12 bacteria, as a ...

Characteristics of Precipitation-formed Polyethylene Glycol Microgels Are Controlled by Molecular Weight of Reactants

This work describes the formation of poly(ethylene glycol) (PEG) microgels via a photopolymerized precipitation reaction. Precipitation reactions offer several advantages over traditional microsphere fabrication techniques. Contrary to emulsion, suspension, and dispersion techniques, microgels formed by precipitation are of uniform shape and size, i.e.&#160;low polydispersity index, without the use of organic solvents or stabilizers. The mild conditions of the precipitation reaction, customizable properties of the microgels, and low viscosity for injections make them applicable for in vivo purposes. Unlike other fabrication techniques, microgel characteristics can be modified by changing the starting polymer molecular weight. Increasing the starting PEG molecular weight increased microgel diameter and swelling ratio. Further modifications are suggested such as encapsulating molecules during microgel crosslinking. Simple adaptations to the PEG microgel building blocks are explored for future applications of microgels as drug delivery vehicles and tissue engineering scaffolds.

This work describes the formation of poly(ethylene glycol) (PEG) microgels via a photopolymerized precipitation reaction. Increasing the PEG molecular weight increased microgel diameter and swelling ratio. Simple adaptations to the PEG microgel precipitation reaction are explored for future applications of microgels as drug delivery vehicles and tissue engineering scaffolds.

This work describes the formation of poly(ethylene glycol) (PEG) microgels via a photopolymerized precipitation reaction. Precipitation reactions offer ...

Hydrogel Nanoparticle Harvesting of Plasma or Urine for Detecting Low Abundance Proteins

Novel biomarker discovery plays a crucial role in providing more sensitive and specific disease detection. Unfortunately many low-abundance biomarkers that exist in biological fluids cannot be easily detected with mass spectrometry or immunoassays because they are present in very low concentration, are labile, and are often masked by high-abundance proteins such as albumin or immunoglobulin. Bait containing poly(N-isopropylacrylamide) (NIPAm) based nanoparticles are able to overcome these physiological barriers. In one step they are able to capture, concentrate and preserve biomarkers from body fluids. Low-molecular weight analytes enter the core of the nanoparticle and are captured by different organic chemical dyes, which act as high affinity protein baits. The nanoparticles are able to concentrate the proteins of interest by several orders of magnitude. This concentration factor is sufficient to increase the protein level such that the proteins are within the detection limit of current mass spectrometers, western blotting, and immunoassays. Nanoparticles can be incubated with a plethora of biological fluids and they are able to greatly enrich the concentration of low-molecular weight proteins and peptides while excluding albumin and other high-molecular weight proteins. Our data show that a 10,000 fold amplification in the concentration of a particular analyte can be achieved, enabling mass spectrometry and immunoassays to detect previously undetectable biomarkers.

Several pathological biomarkers cannot be easily detected by current techniques because of their low concentration in biological fluids, the presence of degrading enzymes, and large amounts of high molecular weight proteins. Chemically functionalized hydrogel nanoparticles can harvest, preserve and concentrate low abundance proteins enabling the detection of previously undetectable biomarkers.

ハイドロゲルナノ粒子プラズマの収穫や少量のタンパク質を検出するための尿

Novel biomarker discovery plays a crucial role in providing more sensitive and specific disease detection. Unfortunately many low-abundance biomarkers ...

From Fast Fluorescence Imaging to Molecular Diffusion Law on Live Cell Membranes in a Commercial Microscope

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the regulation of many cellular functions. However, due to the fast dynamics and the tiny structures involved, a very high spatio-temporal resolution is required to catch the real behavior of molecules. Here we present the experimental protocol for studying the dynamics of fluorescently-labeled plasma-membrane proteins and lipids in live cells with high spatiotemporal resolution. Notably, this approach doesn&#8217;t need to track each molecule, but it calculates population behavior using all molecules in a given region of the membrane. The starting point is a fast imaging of a given region on the membrane. Afterwards, a complete spatio-temporal autocorrelation function is calculated correlating acquired images at increasing time delays, for example each 2, 3, n repetitions. It is possible to demonstrate that the width of the peak of the spatial autocorrelation function increases at increasing time delay as a function of particle movement due to diffusion. Therefore, fitting of the series of autocorrelation functions enables to extract the actual protein mean square displacement from imaging (iMSD), here presented in the form of apparent diffusivity vs average displacement. This yields a quantitative view of the average dynamics of single molecules with nanometer accuracy. By using a GFP-tagged variant of the Transferrin Receptor (TfR) and an ATTO488 labeled 1-palmitoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (PPE) it is possible to observe the spatiotemporal regulation of protein and lipid diffusion on &#181;m-sized membrane regions in the micro-to-milli-second time range.

Spatial distribution and temporal dynamics of plasma membrane proteins and lipids is a hot topic in biology. Here this issue is addressed by a spatio-temporal image fluctuation analysis that provides conceptually the same physical quantities of single particle tracking, but it uses small molecular labels and standard microscopy setups.

商業顕微鏡でのライブ細胞膜上の分子拡散法への高速蛍光イメージングから

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the ...

Design and Construction of Artificial Extracellular Matrix (aECM) Proteins from Escherichia coli for Skin Tissue Engineering

Recombinant technology is a versatile platform to create novel artificial proteins with tunable properties. For the last decade, many artificial proteins that have incorporated functional domains derived from nature (or created de novo) have been reported. In particular, artificial extracellular matrix (aECM) proteins have been developed; these aECM proteins consist of biological domains taken from fibronectin, laminins and collagens and are combined with structural domains including elastin-like repeats, silk and collagen repeats. To date, aECM proteins have been widely investigated for applications in tissue engineering and wound repair. Recently, Tjin and coworkers developed integrin-specific aECM proteins designed for promoting human skin keratinocyte attachment and propagation. In their work, the aECM proteins incorporate cell binding domains taken from fibronectin, laminin-5 and collagen IV, as well as flanking elastin-like repeats. They demonstrated that the aECM proteins developed in their work were promising candidates for use as substrates in artificial skin. Here, we outline the design and construction of such aECM proteins as well as their purification process using the thermo-responsive characteristics of elastin.

Design and Construction of Artificial Extracellular Matrix aECM Proteins from Escherichia coli for Skin Tissue Engineering

Recombinant technologies have enabled material designers to create novel artificial proteins with customized functionalities for tissue engineering applications. For example, artificial extracellular matrix proteins can be designed to incorporate structural and biological domains derived from native ECMs. Here, we describe the construction and purification of aECM proteins containing elastin-like repeats.

人工細胞外マトリックス（AECM）タンパク質からの設計と構築<em&gt;エシェリヒア·コリ</em&gt;皮膚組織工学のための

Recombinant technology is a versatile platform to create novel artificial proteins with tunable properties. For the last decade, many artificial proteins ...

Microfluidic Genipin Deposition Technique for Extended Culture of Micropatterned Vascular Muscular Thin Films

The chronic nature of vascular disease progression requires the development of experimental techniques that simulate physiologic and pathologic vascular behaviors on disease-relevant time scales. Previously, microcontact printing has been used to fabricate two-dimensional functional arterial mimics through patterning of extracellular matrix protein as guidance cues for tissue organization. Vascular muscular thin films utilized these mimics to assess functional contractility. However, the microcontact printing fabrication technique used typically incorporates hydrophobic PDMS substrates. As the tissue turns over the underlying extracellular matrix, new proteins must undergo a conformational change or denaturing in order to expose hydrophobic amino acid residues to the hydrophobic PDMS surfaces for attachment, resulting in altered matrix protein bioactivity, delamination, and death of the tissues.
Here, we present a microfluidic deposition technique for patterning of the crosslinker compound genipin. Genipin serves as an intermediary between patterned tissues and PDMS substrates, allowing cells to deposit newly-synthesized extracellular matrix protein onto a more hydrophilic surface and remain attached to the PDMS substrates. We also show that extracellular matrix proteins can be patterned directly onto deposited genipin, allowing dictation of engineered tissue structure. Tissues fabricated with this technique show high fidelity in both structural alignment and contractile function of vascular smooth muscle tissue in a vascular muscular thin film model. This technique can be extended using other cell types and provides the framework for future study of chronic tissue- and organ-level functionality.

We present a method for microfluidic deposition of patterned genipin and fibronectin on PDMS substrates, allowing extended viability of vascular smooth muscle cell-dense tissues. This tissue fabrication method is combined with previous vascular muscular thin film technology to measure vascular contractility over disease-relevant time courses.

マイクロパターン血管筋薄膜の拡張文化ためのマイクロ流体ゲニピン堆積技術

The chronic nature of vascular disease progression requires the development of experimental techniques that simulate physiologic and pathologic vascular ...