Esta investigación se llevó a cabo en virtud de USDA-ARS CRIS Proyecto de 5.325 a 42.000-037-00D, y con los resultados de CRADA 58-3K95-7-1198 y TFCA 58-5325-8-419. Los autores agradecen Suterra por el don de la (Z, Z) -11,13-hexadecadienal, B. Higbee de discusiones productivas, y J. Baker, de asistencia técnica.

1. La preparación de compuestos volátiles detectados a partir de la planta huésped de EAG detección <ol><li> Después de la identificación y autentificación de todas las sustancias volátiles a través de GC-MS, el análisis EAG bocanada de cada uno disponible volátil. La selección inicial puede ser un número duplicado bajo de respuestas antenales (N = 3-5) para cada sexo con el fin de lograr una indicación de chemoreceptivity relativa en un corto período de tiempo (Tabla 1). </li><li> Preparar una solución de cada volátil a un 5 mg / ml de concentración en pentano. Selle herméticamente y refrigerar la muestra hasta que esté listo para su uso inmediato (por ejemplo, acetofenona, densidad = 1,03 g / ml, volumen = (0,005 g/1.03 g / ml) x 1000 = 4,85 l de acetofenona en un matraz aforado de 1,0 ml y se diluye hasta 1,0 ml con pentano). </li><li> Justo antes de su análisis EAG, eliminar los viales que contienen el 5 mg / ml de concentración de los volátiles a ensayar y se deja calentar a temperatura ambiente. Mientras tanto, marcar el número apropiado de pipetas Pasteur decorrelacionan con cada volátil a ensayar, y envolver un pequeño trozo de parafina (ca. 15 x 15 mm) sobre la punta de la pipeta. Para las pipetas de detección iniciales de estímulo 10 (N = 4 para cada hombre y mujer) se cargan en el caso de una preparación mal o un obstáculo imprevisto otro. </li><li> Utilizando un par de pinzas, suavemente doblar el disco bioensayo en un medio para facilitar la colocación en la pipeta, a continuación, parcialmente colocar el disco doblado en el extremo grande de la pipeta para que ca. 2-3 mm del disco están expuestos. Alinear las pipetas marcadas y preparado en un soporte de estante. </li><li> Utilizando una pipeta o una jeringa, cargar 10 l (50 mg) de solución volátil en cada disco y permitir 2 minutos antes de pasar completamente la inserción de los discos en la pipeta. Una vez cargado, inmediatamente sellar el extremo de la pipeta con parafilm (ca. 15 x 30 mm). La cantidad de estímulos volátiles para ser cargados y sopló más probable es que varía con las especies de insectos. </li><li> Siguiendo el mismo protocolo que se ha indicado anteriormente, preparar los controles deincluir en cada análisis. Para la carga negativa de control de 10 l de pentano solo en cada disco, espere 2 minutos, cargar en la pipeta de la etiqueta y el sello. Para el control positivo, carga de 10 l (50 mg) en el disco, espere 2 minutos, la carga en la pipeta etiquetado y sellado con parafilm. </li><li> La viabilidad de la preparación de las antenas de insectos más probable es que varían según las especies, pero hemos encontrado que Amyelois transitella antenas suelen permanecer activa y constante por más de 30 minutos después de la escisión con el protocolo descrito. Esta cantidad de tiempo que generalmente se permiten hasta 4-10 muestras volátiles para ser evaluados. Tabla 2 proporciona un ejemplo de los tiempos y las secuencias. </li></ol> 2. Preparación de las antenas de los insectos para el bioensayo EAG <ol><li> El objetivo de este experimento es el análisis de EAG, por lo que la suposición de que cada investigador tendrá acceso a los insectos criados adecuadamente. </li><li> Para este experimento vamos a estudiar 3-4 días old, se aparearon las polillas masculinas y femeninas. Polillas individuales se transfieren a un pequeño recipiente con tapa de plástico del día de análisis. Inmediatamente antes de la bioensayo, la polilla a ensayar se transfiere de cabeza en un aparato de sujeción (es decir, a partir de diversas puntas pipeteador de plástico) y asegurado por detrás. La manipulación de los insectos puede ser visto bajo un bajo consumo de energía estéreo-microscopio para facilitar la escisión. </li><li> Las antenas son objeto de burlas a cabo utilizando una herramienta de alambre en la punta. El titular de tenedor, con una pequeña película de gel de electrodo, se coloca en estrecha proximidad para la transferencia rápida de las antenas. La primera antena se extirpa el uso de tijeras micro y se coloca en el tenedor, asegurando la base de la antena se coloca en la porción no-rojo del tenedor (el electrodo de tierra indiferente). Un conjunto temporizador durante 10 minutos y se inicia la segunda antena se extirpa y se coloca al lado de la primera antena con ambas bases en el mismo lado del tenedor. </li><li> Alternativamente, las antenas pueden quedar asegurada dentro de la holdintubo g, extirpados, entonces suavemente retirado de entre el tubo y el insecto utilizando una herramienta con punta de alambre con una pequeña cantidad de gel en el extremo. </li><li> Antenas se comprueban para asegurar la base y la punta se sumergen en gel de electrodo y no hay burbujas están presentes en el gel. Los extremos y consejos pueden ser ajustados para garantizar la exposición total al gel para electrodos. Se debe tener cuidado para asegurar que el resto de cada antena no está cubierto con gel, garantizando así la máxima área de superficie antenal está expuesto a la calada. </li><li> El tenedor preparado se inserta en la sonda de pre-amplificador y se mantiene bajo un constante flujo de aire húmedo a 200 ml / min durante el tiempo restante del período de espera de 10 minutos. El tiempo especial y EAG veces iniciación se observó (Tabla 2) y 30 segundos antes de la primera bocanada de estímulo, la pipeta que contiene el control positivo está abierta y se coloca en el soporte que se ajusta para dirigir el aire / bocanada flujo 2-3 mm desde el preparado antenas. </li><li> Después de cada experperimento, las polillas de prueba son sacrificados en un ambiente de hielo seco y bien dispuestos. </li><li> Las polillas hembras se diseccionan para comprobar el estado de apareamiento. Los hombres que cohabitan se supone que se han apareado. </li></ol> 3. EAG Protocolo de componentes individuales <ol><li> Respuestas antenales se registran a través del software incluido con AutoSpike el instrumento EAG Syntech. La configuración en la pestaña Propiedades AutoSpike para el canal con la sonda de EAG se ha fijado en una tasa de muestreo de 106,7, NO a la rectificación, y un filtro de 0 a 42 Hz. Por la ficha Filtro, el filtro de EAG está en ON y el punto de corte bajo se ajusta a 0,1 Hz. </li><li> Bocanadas de estímulo son de 1-2 segundos de duración. Un contador de tiempo establecido para un minuto se inicia después de cada bocanada. </li><li> La pipeta prueba volátil próximo está abierta y se coloca en el soporte. La secuencia de los volátiles de ensayo, aleatorizado entre ejecuta para asegurar que no compuestos de ensayo consistente seguir otra prueba volátil, es seguido a continuación (por ejemplo, Tabla 2) cuidadosamente allowing 1 minuto entre cada disparo. </li><li> Para facilitar la lectura de las respuestas EAG, las porciones de los gobernantes se colocan sobre la pantalla del ordenador y el nivel basal hasta el ápice de la señal de deflexión hacia abajo se mide en milímetros y se registra en una hoja de datos (es decir, para el ajuste mV 5, 33 mm = 2,5 mV). El software tiene la capacidad de reproducción de las grabaciones guardadas para su posterior análisis. La conversión de mm a cualquiera mV o amplitud mV se realiza en el análisis de datos más adelante. </li><li> Después de la bocanada final de control positivo (por ejemplo, el registro # 12) se administra, las antenas se retiran, el tenedor se limpia con una toallita de etanol saturado y se deja secar antes de su uso posterior. </li><li> Para aumentar el rendimiento de los ensayos, la escisión de la siguiente serie de antenas puede ser iniciado por un personal de laboratorio de segunda a unos 10 minutos antes del final del experimento actual - después de la cuarta de hojaldre, la segunda prueba volátil de la experiencia actual, según la tabla 2. Esto permitirá FOr el comienzo del experimento siguiente directamente después de los extremos experimento actual. </li><li> Mayor número de repeticiones (a antenas diferentes) puede realizarse en compuestos de interés para proporcionar una mayor validación estadística. </li></ol> 4. Un ejemplo de análisis de los EAG mezclas u otras matrices (Tabla 3) <ol><li> A continuación, las proporciones y los volúmenes de dos mezclas terciarias (3-componente mezclas) se calcula para proporcionar un ejemplo de la combinación de compuestos volátiles que suscitan respuestas de alta EAG (Tabla 4). Los cálculos son para algunas relaciones básicas, una proporción 1:1:1 molar de α-humuleno: 2-undecanona: 2-feniletanol y luego comparar a una relación de mezcla de la segunda 1:02:04. </li><li> Utilizando protocolos similares se describió anteriormente, las mezclas se preparan y etiquetados pipetas Pasteur se cargan junto con los controles necesarios positivos y negativos. </li><li> Las muestras volátiles se inflan a través de antenas de los machos y hembras, y las respuestas se miden y haber iniciado sesióna una hoja de datos (Tabla 3). </li></ol> 5. Los resultados representativos Para la naranja ombligo femenino las siguientes opciones se utilizan: 2 inhalaciones segundo, 10 veces segundo disco, 10 segundos de la ventana, y el 5 de escala de mV. Una desviación negativa es la respuesta típica, sin embargo, el valor absoluto se registra (por ejemplo, -3.400 deflexión mV se registra como 3.400 mV). Una respuesta relativamente débil de la preparación para el control positivo se descarta. Figura 1 proporciona una representación gráfica de una mala respuesta al control positivo por la naranja ombligo. Por ejemplo de un resultado pobre control, la media de respuesta de las hembras antenal a acetofenona es típicamente ca. 2.600 mV (Figura 2), si la preparación sólo dio una respuesta de ca. 1.300 mV que se descarta y se prepara otro par de antenas. Del mismo modo, la respuesta media de los hombres de (Z, Z) -11,13-hexadecadienal era tipicay 3.000 mV, por lo que cualquier respuesta es inferior a 1.500 mV se descartó típicamente. El control positivo al comienzo y al final de cada experimento también proporciona información relativa a la condición de las antenas. Una regla de oro se sigue para la detección rápida es si la respuesta antenal a la nube de la post-control (expediente n º 12, Tabla 2) es menor que el 75% del hojaldre 1 º de la pre-control (registro # 1 , Tabla 2) o menor que el hojaldre 2 ª de la pre-control (registro # 2, Tabla 2) a continuación, el experimento no se utiliza en el análisis de datos debido a la posible degradación de la preparación (Figura 3). Un ejemplo de la primera regla de oro sería el registro # 1 = 2.730 mV y el registro n º 12 = 1680 mV, y la segunda regla de oro si el registro n º 2 = 2.350 mV y el registro n º 12 = 1680 mV, en cada uno de estos casos , los resultados del PREP y el experimento se descarta. Aejemplo representativo de la corrección de los valores de respuesta EAG medidos para el control positivo sería como sigue. <table border="1"><tbody><tr><td> Ejecutar # </td><td> GAE (mV) </td><td> Ejecutar # 2 </td><td> GAE (mV) </td><td> Ejecutar # 3 </td><td> GAE (mV) </td></tr><tr><td> (+) Ctrl </td><td> 2800 </td><td> (+) Ctrl </td><td> 2420 </td><td> (+) Ctrl </td><td> 3030 </td></tr><tr><td> Un Cmpnd </td><td> 3000 </td><td> Un Cmpnd </td><td> 2500 </td><td> Un Cmpnd </td><td> 3440 </td></tr><tr><td> (-) Ctrl </td><td> 530 </td><td> (-) Ctrl </td><td> 755 </td><td> (-) Ctrl </td><td> 910 </td></tr><tr><td> Cmpnd B </td><td> 2400 </td><td> Cmpnd B </td><td> 2000 </td><td> Cmpnd B </td><td> 2560 </td></tr><tr><td> (+) Ctrl </td><td> 2770 </td><td> (+) Ctrl </td><td> 2400 </td><td> (+) Ctrl </td><td> 3020 </td></tr></tbody></table> Utilizando los valores anteriores para un N = 3 experimento, la respuesta de control negativo se resta de cada valor dentro de cada experimento bajo el supuesto de que el control negativo es la respuesta basal antenal a la bocanada mecánica y el disolvente residual. <table border="1"><tbody><tr><td> Run # 1 </td><td> GAE (mV) </td><td> Ejecutar # 2 </td><td> GAE (mV) </td><td> Ejecutar # 3 </td><td> GAE (mV) </td></tr><tr><td> (+) Ctrl </td><td> 2270 </td><td> (+) Ctrl </td><td> 1665 </td><td> (+) Ctrl </td><td> 2120 </td></tr><tr><td> Un Cmpnd </td><td> 2470 </td><td> Un Cmpnd </td><td> 1745 </td><td> Un Cmpnd </td><td> 2530 </td></tr><tr><td> (-) Ctrl </td><td> 0 </td><td> (-) Ctrl </td><td> 0 </td><td> (-) Ctrl </td><td> 0 </td></tr><tr><td> Cmpnd B</td><td> 1870 </td><td> Cmpnd B </td><td> 1245 </td><td> Cmpnd B </td><td> 1650 </td></tr><tr><td> (+) Ctrl </td><td> 2240 </td><td> (+) Ctrl </td><td> 1645 </td><td> (+) Ctrl </td><td> 2110 </td></tr></tbody></table> Los controles positivos para cada experimento a continuación se promediarán y corregido en 1000 mV, teniendo en cuenta la relación para la corrección de 1000 mV. Una hoja de datos (por ejemplo, Excel) puede ser fácilmente manipulado para convertir las respuestas a los datos utilizables. <table border="1"><tbody><tr><td> Run # 1 </td><td> Media (mV) </td><td> Ejecutar # 2 </td><td> Media (mV) </td><td> Ejecutar # 3 </td><td> Media (mV) </td></tr><tr><td> (+) Ctrl </td><td> 2255 </td><td> (+) Ctrl </td><td> 1655 </td><td> (+) Ctrl </td><td> 2115 </td></tr><tr><td> (+) Ctrl adj. </td><td> 1000 (0.443) </td><td> (+) Ctrl adj. </td><td> 1000 (0.604) </td><td> (+) Ctrl adj. </td><td> 1000 (0.473) </td></tr></tbody></table> Multiplicando por la relación de corrección dentro de cada experimento, los valores para el compuesto A y el compuesto B se ajusta entonces. <table border="1"><tbody><tr><td> Run # 1 </td><td> Adj. GAE (mV) </td><td> Ejecutar # 2 </td><td> Adj. GAE (mV) </td><td> Ejecutar # 3 </td><td> Adj. GAE (mV) </td></tr><tr><td> Un Cmpnd </td><td> 1094 </td><td> Un Cmpnd </td><td> 1054 </td><td> Un Cmpnd </td><td> 1197 </td></tr><tr><td> Cmpnd B </td><td> 828 </td><td> Cmpnd B </td><td> 752 </td><td> Cmpnd B </td><td> 780 </td></tr></tbody></table> Los promedios (medias) para cada compuesto se determina a continuación junto con otros datos estadísticos pertinentes y las respuestas EAG para los compuestos ensayados, a continuación, se puede evaluara la candidatura para una mayor investigación. <table border="1"><tbody><tr><td> Compuesto </td><td> GAE (mV) </td><td> N º Corre, N = </td></tr><tr><td> A </td><td> 1115 </td><td> 3 </td></tr><tr><td> B </td><td> 787 </td><td> 3 </td></tr></tbody></table><img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3931/3931fig1.jpg" /> Figura 1. EAG Representante para la respuesta masculina antenal (1180 mV) a la pre-control (1 º de hojaldre control positivo) que se descarta debido a la respuesta antenal pobres después de asegurarse de las antenas tienen un buen contacto con el gel. Las barras azules en las ventanas de la parte inferior representan la hojaldre dos segundos de la volatilidad. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3931/3931fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver más grande la figura</a> . <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3931/3931fig2.jpg" /> <strong&gt; Figura 2. EAG Representante para la respuesta de las hembras antenal (3400 mV) a la 1 ª bocanada de pre-control que se considere apropiada. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3931/3931fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver más grande la figura</a> . <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3931/3931fig3.jpg" /> Figura 3. EAG Representante para la respuesta de las hembras antenal (1680 mV) para el control a posteriori (último control positivo para cada experimento) que se considera pobre, y sugerente de las antenas de la degradación (&lt;75% del 1 de pre-control o &lt; 2 º valor bocanada de pre-control). Para este ejemplo, el 1 º de pre-control de hojaldre era 2.730 mV y 2 º de pre-control de hojaldre era 2350 mV. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3931/3931fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver más grande la figura</a> . <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3931/3931fig4.jpg" /> Figura 4. Representante EAG para la respuesta de las hembras antenal (3800 mV) a la nube de una mezcla volátil y candidato a las mediciones sucesivas de la desviación máxima inicial (3800 mV), la pendiente inicial, durante la duración de hojaldre (0,3 mV = s/1.2 0,25 s / mV), y la pendiente de la duración restante de hojaldre (1,6 s/1.9 mV = 0,84 s / mV). <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3931/3931fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver más grande la figura</a> . <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/3931/3931fig5.jpg" /> Figura 5. Pequeño vaso modificado que contiene una matriz de muestra y los volátiles asociados a ser inflado a través de A. transitella antenas. <img alt="Tabla 1" src="/files/ftp_upload/3931/3931table1.jpg" /> Tabla 1. En sUIT volátiles de emisiones de almendras sin par (2007) y las respuestas EAG determinados por una configuración diferente y menos sensibles en el programa Autospike. <img alt="Tabla 2" src="/files/ftp_upload/3931/3931table2.jpg" /> Tabla 2. Ejemplo de un formulario para el registro de las respuestas antenales hombres y mujeres a los distintos componentes volátiles. <img alt="Tabla 3" src="/files/ftp_upload/3931/3931table3.jpg" /> Tabla 3. Ejemplo de un formulario para el registro de las respuestas de las antenas de ambos sexos a las mezclas volátiles y / o ramos de flores. <img alt="Tabla 4" src="/files/ftp_upload/3931/3931table4.jpg" /> Tabla 4. Ejemplos de preparación de 10 ml de una dosis de 5 mg / ml de solución para dos diferentes proporciones de las mezclas. <img alt="Tabla 5" src="/files/ftp_upload/3931/3931table5.jpg" /> Tabla 5. Ejemplo de formulario para registrar dos consecuenciascutivo inhalaciones individuales de los componentes volátiles a través de antenas de los machos y hembras.

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El autor cuenta con una investigación existente de cooperación y acuerdo de desarrollo con Paramount Farming Company, una compañía con vínculos con Suterra LLC.

El uso de grabaciones electroantenograma como un bioensayo para determinar las respuestas Quimiorecepción de un insecto objetivo es bastante común y numerosos estudios que utilizan GAE como un detector para el efluente de un cromatograma de gases (GC-EAD) se pueden encontrar en la literatura. 9,10 El método demostró proporcionará una detección rápida de cantidades equivalentes de los componentes volátiles con repeticiones altas para la asignación de confianza de la capacidad de respuesta relativa. El...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> Acetofenona </td><td> Alfa-Aesar </td><td> A12727 </td><td> Control positivo Mujer </td></tr><tr><td> (Z, Z) -11,13-Hexadecadienal </td><td> Suterra </td><td></td><td> Control positivo Mujer </td></tr><tr><td> α-humuleno </td><td> Aldrich </td><td> 53675 </td><td> Sesquiterpénicas </td></tr><tr><td> 2-undecanona </td><td> Aldrich </td><td> U1303 </td><td> Derivado de ácido graso </td></tr><tr><td> 2-feniletanol </td><td> Aldrich </td><td> 77861 </td><td> Bencenoide </td></tr><tr><td> Pentano </td><td> EMD </td><td> PX0167-1 </td><td> Solvente </td></tr><tr><td> 4 canales de adquisición de control </td><td> Syntech </td><td> YoCAD-4 </td><td></td></tr><tr><td> GAE sonda, pre-amplificador </td><td> Syntech </td><td> Tipo de PRG-2 </td><td></td></tr><tr><td> Antena titular de la </td><td> Syntech </td><td> Para PRG-2 </td><td> Tenedor de electrodos </td></tr><tr><td> Estímulo del controlador </td><td> Syntech </td><td> CS-55 </td><td> El flujo de aire y bocanadas </td></tr><tr><td> Spectra gel para electrodos </td><td> Parker </td><td> 12-02 </td><td></td></tr><tr><td> Los discos de bioensayo </td><td> Whatman </td><td> 2017-006 </td><td> 6 mm </td></tr><tr><td> Pasteur Pipetas </td><td> VWR </td><td> 14673-010 </td><td> 5 ¾ &quot;(14,6 cm) </td></tr><tr><td> Parafilm M </td><td> Bemis </td><td> AM-992 </td><td></td></tr></tbody></table>

electroantennographic bioassay as a screening tool for host plant volatiles

Volátiles de las plantas juegan un papel importante en las interacciones planta-insecto. Insectos herbívoros utilizan compuestos volátiles de las plantas, conocidas como kairomonas, para localizar su planta hospedera. 1,2 Cuando una planta huésped es un importante daño agronómica de los productos básicos de alimentación por plagas de insectos pueden causar graves pérdidas económicas a los productores. En consecuencia, kairomonas se puede utilizar como atrayentes para atraer o confundir a estos insectos y, por tanto, ofrecer una alternativa ecológica a los plaguicidas para el control de insectos. 3 Desafortunadamente, las plantas pueden emitir un número de sustancias volátiles, con grandes composiciones y proporciones variables de las emisiones que dependen de la fenología de la mercancía o la hora del día. Esto hace que la identificación de componentes biológicamente activos o mezclas de compuestos volátiles de un arduo proceso. Para ayudar a identificar los componentes bioactivos de las emisiones de las plantas hospederas volátiles que emplean el electroantenografía pruebas de laboratorio basado en bioensayos (GAE). GEA es una herramienta eficaz para evaluar y record electrofisiológicamente las respuestas olfativas de un insecto a través de sus receptores antenales. El proceso de selección EAG puede ayudar a reducir el número de sustancias volátiles a prueba para identificar prometedores componentes bioactivos. Sin embargo, los bioensayos EAG sólo proporcionan información sobre la activación de los receptores. No proporciona información sobre el tipo de comportamiento de los insectos el compuesto provoca, lo que podría ser como un tipo de atrayente, repelente o de otra índole de la respuesta conductual. Los compuestos volátiles que provoquen una respuesta significativa de EAG, con respecto a un control positivo adecuado, se suelen tomar en la realización de pruebas de respuestas de comportamiento de la plaga de insectos. El diseño experimental presenta en detalle la metodología empleada a la pantalla a base de almendras volátiles de las plantas hospederas 4,5 mediante la medición de las respuestas electrofisiológicas de las antenas de un adulto el ombligo de insectos plaga la naranja (Amyelois transitella) a los componentes individuales y combinaciones simples de componentes a través de EAG bioensayo. El método utiliza dos exantenas cised colocado a través de un porta-electrodos &quot;tenedor&quot;. El protocolo se ha demostrado aquí se presenta una rápida y de alto rendimiento método estandarizado para la detección de compuestos volátiles. Cada volátil es un conjunto, cantidad constante de estandarizar el nivel de estímulo y permitir así que las respuestas de las antenas es indicativo de la chemoreceptivity relativa. El control negativo ayuda a eliminar la respuesta electrofisiológica tanto a la fuerza disolvente residual y mecánica de la calada. El control positivo (en este ejemplo acetofenona) es un compuesto único que ha suscitado una respuesta coherente desde el ombligo masculino y femenino la naranja (NOW), la polilla. Un estándar semioquímico adicional que proporciona una respuesta coherente y se utiliza para los estudios de bioensayo con el macho AHORA polilla es (Z, Z) -11,13-hexdecadienal, un componente de aldehído de la feromona sexual hembra-producido. 6-8

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Electroantennographic Bioassay as a Screening Tool for Host Plant Volatiles

Un método para rápidamente volátiles de las plantas huésped de pantalla mediante la medición de la respuesta electrofisiológica de la naranja ombligo adulto (<em&gt; Amyelois transitella</em&gt;) A los componentes de antenas individuales y mezclas a través de análisis de electroantenográfico se demuestra.

Bioensayo electroantenográfico como herramienta de detección de compuestos volátiles de las plantas hospederas

Plant volatiles play an important role in plant-insect interactions. Herbivorous insects use plant volatiles, known as kairomones, to locate their host ...

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Research

JoVE Journal

Biology

13.6K vistas.  Agricultural Research Service. Un método para rápidamente volátiles de las plantas huésped de pantalla mediante la medición de la respuesta electrofisiológica de la naranja ombligo adulto ( Amyelois transitella) A los componentes de antenas individuales y mezclas a través de análisis de electroantenográfico se demuestra.

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A &#946;-glucuronidase (GUS) Based Cell Death Assay

We have developed a novel transient plant expression system that simultaneously expresses the reporter gene, &beta;-glucuronidase (GUS), with putative positive or negative regulators of cell death. In this system, N. benthamiana leaves are co-infiltrated with a 35S driven expression cassette containing the gene to be analyzed, and the GUS vector pCAMBIA 2301 using Agrobacterium strain LBA4404 as a vehicle. Because live cells are required for GUS expression to occur, loss of GUS activity is expected when this marker gene is co-expressed with positive regulators of cell death. Equally, increased GUS activity is observed when anti-apoptotic genes are used compared to the vector control. As shown below, we have successfully used this system in our lab to analyze both pro- and anti-death players. These include the plant anti-apoptotic Bcl-2 Associated athanoGene (BAG) family, as well as, known mammalian inducers of cell death, such as BAX. Additionally, we have used this system to analyze the death function of specific truncations within proteins, which could provide clues on the possible post-translational modification/activation of these proteins. Here, we present a rapid and sensitive plant based method, as an initial step in investigating the death function of specific genes.

A &amp;#946;-glucuronidase GUS Based Cell Death Assay

Programmed cell death assays commonly used in mammalian systems such as DNA laddering or TUNEL assays, are often difficult to reproduce in plants. In combination with a GUS reporter system, we propose a rapid, plant based transient assay to analyze the potential death properties of specific genes.

A β-glucuronidasa (GUS), basada en células de ensayo Muerte

We have developed a novel transient plant expression system that simultaneously expresses the reporter gene, &beta;-glucuronidase (GUS), with putative ...

Investigación

Biología

Herbivore-induced Blueberry Volatiles and Intra-plant Signaling

Herbivore-induced plant volatiles (HIPVs) are commonly emitted from plants after herbivore attack1,2. These HIPVs are mainly regulated by the defensive plant hormone jasmonic acid (JA) and its volatile derivative methyl jasmonate (MeJA)3,4,5. Over the past 3 decades researchers have documented that HIPVs can repel or attract herbivores, attract the natural enemies of herbivores, and in some cases they can induce or prime plant defenses prior to herbivore attack. In a recent paper6, I reported that feeding by gypsy moth caterpillars, exogenous MeJA application, and mechanical damage induce the emissions of volatiles from blueberry plants, albeit differently. In addition, blueberry branches respond to HIPVs emitted from neighboring branches of the same plant by increasing the levels of JA and resistance to herbivores (i.e., direct plant defenses), and by priming volatile emissions (i.e., indirect plant defenses). Similar findings have been reported recently for sagebrush7, poplar8, and lima beans9..
Here, I describe a push-pull method for collecting blueberry volatiles induced by herbivore (gypsy moth) feeding, exogenous MeJA application, and mechanical damage. The volatile collection unit consists of a 4 L volatile collection chamber, a 2-piece guillotine, an air delivery system that purifies incoming air, and a vacuum system connected to a trap filled with Super-Q adsorbent to collect volatiles5,6,10. Volatiles collected in Super-Q traps are eluted with dichloromethane and then separated and quantified using Gas Chromatography (GC). This volatile collection method was used n my study6 to investigate the volatile response of undamaged branches to exposure to volatiles from herbivore-damaged branches within blueberry plants. These methods are described here. Briefly, undamaged blueberry branches are exposed to HIPVs from neighboring branches within the same plant. Using the same techniques described above, volatiles emitted from branches after exposure to HIPVs are collected and analyzed.

A push-pull method for collecting plant volatiles is described. The method allows for a comparison of volatiles induced by herbivore feeding, exogenous methyl jasmonate, and mechanical damage. This technique is also used to investigate the volatile response of undamaged branches to exposure to volatiles from herbivore-damaged branches within blueberry plants.

Inducida por herbívoros-Volátiles Blueberry y señalización dentro de la planta

Herbivore-induced plant volatiles (HIPVs) are commonly emitted from plants after herbivore attack1,2.  These HIPVs are mainly regulated by the defensive ...

Fluorescence-microscopy Screening and Next-generation Sequencing: Useful Tools for the Identification of Genes Involved in Organelle Integrity

This protocol describes a fluorescence microscope-based screening of Arabidopsis seedlings and describes how to map recessive mutations that alter the subcellular distribution of a specific tagged fluorescent marker in the secretory pathway. Arabidopsis is a powerful biological model for genetic studies because of its genome size, generation time, and conservation of molecular mechanisms among kingdoms. The array genotyping as an approach to map the mutation in alternative to the traditional method based on molecular markers is advantageous because it is relatively faster and may allow the mapping of several mutants in a really short time frame. This method allows the identification of proteins that can influence the integrity of any organelle in plants. Here, as an example, we propose a screen to map genes important for the integrity of the endoplasmic reticulum (ER). Our approach, however, can be easily extended to other plant cell organelles (for example see1,2), and thus represents an important step toward understanding the molecular basis governing other subcellular structures.

A fundamental quest in cell biology is to define the mechanisms that underlie the identity of the organelles that make eukaryotic cells. Here we propose a method to identify the genes responsible for the morphological and functional integrity of plant organelles using fluorescence microscopy and next-generation sequencing tools.

Fluorescencia microscopia de Selección y secuenciación de próxima generación: Herramientas útiles para la identificación de genes implicados en la integridad de los Orgánulos

This protocol describes a fluorescence microscope-based screening of Arabidopsis seedlings and describes how to map recessive mutations that alter the ...

Using SecM Arrest Sequence as a Tool to Isolate Ribosome Bound Polypeptides

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway that polypeptide chain follows during co-translational folding to achieve its functional form is still an enigma. In order to understand this process and to determine the exact conformation of the co-translational folding intermediates, it is essential to develop techniques that allow the isolation of RNCs carrying nascent chains of predetermined sizes to allow their further structural analysis.
SecM (secretion monitor) is a 170 amino acid E. coli protein that regulates expression of the downstream SecA (secretion driving) ATPase in the secM-secA operon6. Nakatogawa and Ito originally found that a 17 amino acid long sequence (150-FSTPVWISQAQGIRAGP-166) in the C-terminal region of the SecM protein is sufficient and necessary to cause stalling of SecM elongation at Gly165, thereby producing peptidyl-glycyl-tRNA stably bound to the ribosomal P-site7-9. More importantly, it was found that this 17 amino acid long sequence can be fused to the C-terminus of virtually any full-length and/or truncated protein thus allowing the production of RNCs carrying nascent chains of predetermined sizes7. Thus, when fused or inserted into the target protein, SecM stalling sequence produces arrest of the polypeptide chain elongation and generates stable RNCs both in vivo in E. coli cells and in vitro in a cell-free system. Sucrose gradient centrifugation is further utilized to isolate RNCs.
The isolated RNCs can be used to analyze structural and functional features of the co-translational folding intermediates. Recently, this technique has been successfully used to gain insights into the structure of several ribosome bound nascent chains10,11. Here we describe the isolation of bovine Gamma-B Crystallin RNCs fused to SecM and generated in an in vitro translation system.

We describe here a technique that is now routinely used to isolate stably bound ribosome nascent chain complexes (RNCs). This technique takes advantage of the discovery that a 17 amino acid long SecM "arrest sequence" can halt translation elongation in a prokaryotic (E. coli) system, when inserted into (or fused to the C-terminus) of virtually any protein.

Usar secuencias de detención SecM como una herramienta para aislar Ribosome polipéptidos enlazados

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway ...

RNA Catalyst as a Reporter for Screening Drugs against RNA Editing in Trypanosomes

Substantial progress has been made in determining the mechanism of mitochondrial RNA editing in trypanosomes. Similarly, considerable progress has been made in identifying the components of the editosome complex that catalyze RNA editing. However, it is still not clear how those proteins work together. Chemical compounds obtained from a high-throughput screen against the editosome may block or affect one or more steps in the editing cycle. Therefore, the identification of new chemical compounds will generate valuable molecular probes for dissecting the editosome function and assembly. In previous studies, in vitro editing assays were carried out using radio-labeled RNA. These assays are time consuming, inefficient and unsuitable for high-throughput purposes. Here, a homogenous fluorescence-based &#8220;mix and measure&#8221; hammerhead ribozyme in vitro reporter assay to monitor RNA editing, is presented. Only as a consequence of RNA editing of the hammerhead ribozyme a fluorescence resonance energy transfer (FRET) oligoribonucleotide substrate undergoes cleavage. This in turn results in separation of the fluorophore from the quencher thereby producing a signal. In contrast, when the editosome function is inhibited, the fluorescence signal will be quenched. This is a highly sensitive and simple assay that should be generally applicable to monitor in vitro RNA editing or high throughput screening of chemicals that can inhibit the editosome function.

A highly sensitive ribozyme-based assay, applicable to high-throughput screening of chemicals targeting the unique process of RNA editing in trypanosomatid pathogens, is described in this paper. Inhibitors can be used as tools for hypothesis-driven analysis of the RNA editing process and ultimately as therapeutics.

RNA catalizador como reportero para rastrear fármacos contra ARN de edición en tripanosomas

Substantial progress has been made in determining the mechanism of mitochondrial RNA editing in trypanosomes. Similarly, considerable progress has been ...

A Simple Bioassay for the Evaluation of Vascular Endothelial Growth Factors

The analysis of receptor tyrosine kinases and their interacting ligands involved in vascular biology is often challenging due to the constitutive expression of families of related receptors, a broad range of related ligands and the difficulty of dealing with primary cultures of specialized endothelial cells. Here we describe a bioassay for the detection of ligands to the vascular endothelial growth factor receptor-2 (VEGFR-2), a key transducer of signals that promote angiogenesis and lymphangiogenesis. A cDNA encoding a fusion of the extracellular (ligand-binding) region of VEGFR-2 with the transmembrane and cytoplasmic regions of the erythropoietin receptor (EpoR) is expressed in the factor-dependent cell line Ba/F3. This cell line grows in the presence of interleukin-3 (IL-3) and withdrawal of this factor results in death of the cells within 24 hr. Expression of the VEGFR-2/EpoR receptor fusion provides an alternative mechanism to promote survival and potentially proliferation of stably transfected Ba/F3 cells in the presence of a ligand capable of binding and cross-linking the extracellular portion of the fusion protein (i.e., one that can cross-link the VEGFR-2 extracellular region). The assay can be performed in two ways: a semi-quantitative approach in which small volumes of ligand and cells permit a rapid result in 24 hr, and a quantitative approach involving surrogate markers of a viable cell number. The assay is relatively easy to perform, is highly responsive to known VEGFR-2 ligands and can accommodate extracellular inhibitors of VEGFR-2 signaling such as monoclonal antibodies to the receptor or ligands, and soluble ligand traps.

We describe a simple cell-based bioassay for detecting, quantifying and monitoring the activity of members of the vascular endothelial growth factor family of ligands. The assay uses chimeric receptors expressed in a factor-dependent cell line to provide a semi-quantitative or quantitative assessment of receptor binding and cross-linking by the ligand.

Un ensayo biológico simple para la Evaluación de Factores de Crecimiento Endotelial Vascular

The analysis of receptor tyrosine kinases and their interacting ligands involved in vascular biology is often challenging due to the constitutive ...

Laser-assisted Microdissection (LAM) as a Tool for Transcriptional Profiling of Individual Cell Types

The understanding of developmental processes at the molecular level requires insights into transcriptional regulation, and thus the transcriptome, at the level of individual cell types. While the methods described here are generally applicable to a wide range of species and cell types, our research focuses on plant reproduction. Plant cultivation and seed production is of crucial importance for human and animal nutrition. A detailed understanding of the regulatory networks that govern the formation of the reproductive lineage (germline) and ultimately of seeds is a precondition for the targeted manipulation of plant reproduction. In particular, the engineering of apomixis (asexual reproduction through seeds) into crop plants promises great improvements, as it leads to the formation of clonal seeds that are genetically identical to the mother plant. Consequently, the cell types of the female germline are of major importance for the understanding and engineering of apomixis. However, as the corresponding cells are deeply embedded within the floral tissues, they are very difficult to access for experimental analyses, including cell-type specific transcriptomics. To overcome this limitation, sections of individual cells can be isolated by laser-assisted microdissection (LAM). While LAM in combination with transcriptional profiling allows the identification of genes and pathways active in any cell type with high specificity, establishing a suitable protocol can be challenging. Specifically, the quality of RNA obtained after LAM can be compromised, especially when small, single cells are targeted. To circumvent this problem, we have established a workflow for LAM that reproducibly results in high RNA quality that is well suitable for transcriptomics, as exemplified here by the isolation of cells of the female germline in apomictic Boechera. In this protocol, procedures are described for tissue preparation and LAM, also with regard to RNA extraction and quality control.

Laser-assisted Microdissection LAM as a Tool for Transcriptional Profiling of Individual Cell Types

Here we present a protocol for laser-assisted microdissection of specific plant cell types for transcriptional profiling. While the protocol is suitable for different species and cell types, the focus is on highly inaccessible cells of the female germline important for sexual and apomictic reproduction in the crucifer genus Boechera.

Asistida por láser microdisección (LAM) como herramienta para la transcripción de perfiles de distintos tipos de células

The understanding of developmental processes at the molecular level requires insights into transcriptional regulation, and thus the transcriptome, at the ...

A Plate Competition Assay As a Quick Preliminary Assessment of Disease Suppression

The goal was to develop and optimize a simple, affordable, and effective bioassay to detect disease suppressive ability of a specific compost against soilborne fungus Rhizoctonia solani. R. solani is a pathogen of a wide range of plant hosts worldwide. The fungus survives in soils as a saprophyte and grows rapidly on simple water agar media. The plate assay is a rapid method to compare composts for their ability to slow the growth of R. solani. The assay also correlates well with suppression of other soilborne fungal pathogens that survive as saprophytes in soils such as Alternaria early blights, Fusarium wilt, Phytophthora root rot, and Pythium root rot.

Presented is a protocol for a plate competition assay to identify whether a specific compost is likely to contain bacteria and fungi that suppress growth of Rhizoctonia solani.

Un análisis de la competencia la placa como una evaluación preliminar rápida de supresión de la enfermedad

The goal was to develop and optimize a simple, affordable, and effective bioassay to detect disease suppressive ability of a specific compost against ...

Transposon-insertion Sequencing as a Tool to Elucidate Bacterial Colonization Factors in a Burkholderia gladioli Symbiont of Lagria villosa Beetles

Inferring the function of genes by manipulating their activity is an essential tool for understanding the genetic underpinnings of most biological processes. Advances in molecular microbiology have seen the emergence of diverse mutagenesis techniques for the manipulation of genes. Among them, transposon-insertion sequencing (Tn-seq) is a valuable tool to simultaneously assess the functionality of many candidate genes in an untargeted way. The technique has been key to identify&#160;molecular mechanisms for the colonization of eukaryotic hosts in several pathogenic microbes and a few beneficial symbionts.
Here, Tn-seq is established as a method to identify colonization factors in a mutualistic Burkholderia gladioli symbiont of the beetle Lagria villosa. By conjugation, Tn5 transposon-mediated insertion of an antibiotic-resistance cassette is&#160;carried out at random genomic locations in B. gladioli. To identify the effect of gene disruptions on the ability of the bacteria to colonize the beetle host, the generated B. gladioli transposon-mutant library is inoculated on the beetle eggs, while a control is grown in vitro in a liquid culture medium. After allowing sufficient time for colonization, DNA is extracted from the in vivo and in vitro grown libraries. Following a DNA library preparation protocol, the DNA samples are prepared for transposon-insertion sequencing. DNA fragments that contain the transposon-insert edge and flanking bacterial DNA are selected, and the mutation sites are determined by sequencing away from the transposon-insert edge. Finally, by analyzing and comparing the frequencies of each mutant between the in vivo and in vitro libraries, the importance of specific symbiont genes during beetle colonization can be predicted.

Transposon-insertion Sequencing as a Tool to Elucidate Bacterial Colonization Factors in a Burkholderia gladioli Symbiont of Lagria villosa Beetles

This is an adapted method for identifying candidate insect colonization factors in a Burkholderia beneficial symbiont. The beetle host is infected with a random mutant library generated via transposon mutagenesis, and library complexity after colonization is compared to a control grown in vitro.

Secuenciación de transposon-inserción como herramienta para dilucidar factores de colonización bacteriana en un simbionte de gladiolos de Burkholderia de escarabajos lagria villosa

Inferring the function of genes by manipulating their activity is an essential tool for understanding the genetic underpinnings of most biological ...

Detecting Virus and Salivary Proteins of a Leafhopper Vector in the Plant Host

Insect vectors horizontally transmit many plant viruses of agricultural importance. More than one-half of plant viruses are transmitted by hemipteran insects that have piercing-sucking mouthparts. During viral transmission, the insect saliva bridges the virus-vector-host because the saliva vectors viruses, and the insect proteins, trigger or suppress the immune response of plants from insects into plant hosts. The identification and functional analyses of salivary proteins are becoming a new area of focus in the research field of arbovirus-host interactions. This protocol provides a system to detect proteins in the saliva of leafhoppers using the plant host. The leafhopper vector Nephotettix cincticeps infected with rice dwarf virus (RDV) serves as an example. The vitellogenin and major outer capsid protein P8 of RDV vectored by the saliva of N. cincticeps can be detected simultaneously in the rice plant that N. cincticeps feeds on. This method is applicable for testing the salivary proteins that are transiently retained in the plant host after insect feeding. It is believed that this system of detection will benefit the study of hemipteran-virus-plant or hemipteran-plant interactions.

This protocol demonstrates how to use the plant host to detect salivary proteins of leafhopper and plant viral proteins released by leafhopper vectors.

Detección de virus y proteínas salivales de un vector saltahojas en el huésped vegetal

Insect vectors horizontally transmit many plant viruses of agricultural importance. More than one-half of plant viruses are transmitted by hemipteran ...