그리고 Tulane 고혈압과 NIH 교부금에 의해 재정 지원 우수 신장 센터 P20RR017659-08 (PI :이 작품은 루이지애나 LEQSF (2009-12)-RD-A-19 (WL Murfee PI)의 국가 Regents위원회에 의해 지원되었다 : L. 가브리엘 Navar).

1. 수술의 설정 노트 <ol><li> 수술에 앞서 수술 용품 및 악기를 소독. 각 쥐​​를위한 무균 수술에 사용되는 소모품은 계기의 배치를위한 무균 표면으로 걸 포함 시켜요되는 한 드레이프를 포함, 중앙의 X 1.5에서 0.5에 대해 미리 인하 구멍과 하나 드레이프가 쥐 위에 삽입되어야합니다 그리고 거즈. 드레이프의 사전 절단 구멍이 시궁창에 만든 절개로 정렬합니다. 수술에 필요한 악기는 봉합 재료를 절단하는 데 사용되는 가위 1 표준 쌍, 두 포셉 및 봉합사의 취급과 300 명 그들의 창과위한 미세 바늘 홀더, 그리고 칼날이있는 메스를 포함합니다. 우리는 특정 외과 재료 및 도구의 테이블에서 우리 실험실에서 사용되는 일반적인 도구를 나열했습니다. 그러나 최종 도구를 선택하면 실험자 환경 설정에 따라 달라집니다. </li><li> 수술 공간을 준비합니다. 보장하기 위해 손난로 아래 100 ML 0.9 % 멸균 식염수 주머니를 놓고 그 접촉 w에서 오는 염분ith 장간막 조직은 약 37 미리 예열되어 ° C. 식염수의 대안으로, 당신은 울리는의 솔루션 또는 다른 생리 버퍼를 사용할 수 있습니다. exteriorization 절차 동안에 쉽게 액세스할 수 무균 드레이프를 소독 수술기구와 물품을 펼쳐 놓고. 또한 무균 면화 팁 applicators과 봉합의 해당 3 종류 (4-0, 5-0 및 7-0)이 필요합니다. 반드시 패키지가 자료를 멸균 처리하여 액세스할 수 있도록 미리 열립니다 만듭니다. 마지막으로, 적어도 5 분 동안 100 %의 에탄올에 immersing하여 미리 수정 플라스틱 무대를 소독. 무대 중앙에 (그림 1)에서 잘라 타원형의 구멍이있는 100mm 배양 접시입니다. Dremel 도구는 초기에 확인하고, 필요한 경우 구멍을 넓혀 사용할 수 있습니다. 구멍이 만들어진 후, 자른 비닐의 가장자리가 다른 곡물의 모래 종이를 사용하여 매끄럽게 만들어집니다. 단계는 다음 중 하나를 불활성 모델링 점토 (현지 공예품 가게에서 구입한) 또는 silic은 마지막으로 씻어되고접착제를 제기하고 부드러운 표면을 제공하기 위해 구멍의 가장자리에 추가됩니다. 조직과 연락을하기 전에하는 단계는 충분히 멸균 식염수에 씻어서해야합니다. </li><li> angiogenesis의이 모델에 대해서는 일반적으로 성인 남성의 Wistar 쥐 (350 ± 25g)을 사용합니다. 다른 쥐의 변종 및 연령대 사용할 수 있습니다. 저희 연구실에서는 쥐가 케타민 (80 밀리그램 / kg BW), xylazine (8 밀리그램 / kg BW) 및 아트로 핀 (0.08 밀리그램 / kg BW)와 근육내 주사를 통해 anesthetized 있습니다. 약 5 분 후 마취 효과가 확인되고 쥐의 복부 피부는 면도있다. </li></ol> 2. 쥐의 장간막의 Exteriorization 모델 <ol><li> 체온을 유지하기 위해 가열 패드에 미치는 뒷면 anesthetized 쥐를 둡니다. 무균 기술은 수술하는 동안 사용됩니다. 멸균 장갑을 착용하고 악기와 물품이 쥐의 조직 이외의 비 멸균 표면을 연락하는 것을 허용하지 않습니다. </li><li> 잎사귀 usi을 번갈아 가며 함께 복부 영역을 청소하십시오NG 70 % 이소 프로필 및 요오드에 배어 멸균 거즈. </li><li> 메스 블레이드를 사용하여 피부에 따라 소형 (약 0.75 인치) 세로 절개하고 흉골 아래 linea 알바 약 1 인치를 확인하십시오. </li><li> 개구부는 절개와 일치되도록 복부 절을 통해 사전 컷 드레이프를 놓습니다. </li><li> 부드럽게 절개 주위에 압력을 적용합니다. 이것은 보통 쉽게 확인할 수 있도록 충분히 작은 창자의 노출이 발생할 것입니다. </li><li> 면화 팁 applicators를 사용하여 부드럽게 작은 창자의 부분을 끄집어하고 회장을 찾습니다. 장간막을 꺼냈다되면서, 그것은 부드럽게 플라스틱 단계 (그림 2)에 포함 시켜요한다. </li><li> 6-8 vascularized의 mesenteric 창을 확인합니다. mesenteric 창이 작은 창자 (그림 2)을 먹이 동맥 / 정맥 쌍 사이에있는 얇은 반투명 막으로 정의됩니다. </li><li> exteriorization의 시작 시간을 기록합니다. mesente를 남겨주세요공예 섹션은 20 분 동안 exteriorized. exteriorization 기간 동안 간헐적으로 조직이 포장되어 남아 밖으로 건조하지 않도록 배양 접시에있는 염분을 보충하기 위해 멸균 주사기 (5 ML)을 사용합니다. </li><li> 20 분 노출 시간 동안 살균 7-0 봉합사로이 중앙에 위치 mesenteric 창을 표시합니다. 표식이 소장 근처 지방 지역에하여야한다. </li><li> 복강에 장간막의 exteriorized 지역을 반환합니다. </li><li> 중단 패턴에서 5-0 monofilament의 봉합과 함께 복부 근육을 닫습니다. </li><li> 중단 패턴에서 4-0 monofilament의 봉합과 피부를 닫습니다. </li><li> 70 % isopropoyl 및 요오드에 배어 멸균 거즈를 사용하여 잎사귀 교대로 봉합 지역을 닦아주십시오. </li><li> 쥐의 두 눈에 안구 윤활제 젤 뿌리 더군요. 눈을 윤활의 목적은 수술 및 복구하는 동안 각막의 탈수를 방지하는 것입니다. 안구 윤활제의 응용 프로그램이 적용되어야외과 개입의 시작 이었읍니다. 필요하다면, 복구를 위해 자사의 창구로 쥐를 반환하기 전에 안구 윤활제를 다시 적용합니다. </li></ol> 3. 조직 수확 및 고정 <ol><li> 관심 포스트 자극 당일 마취와 쥐를 안락사. 저희 연구실에서는 쥐가 beuthanasia의 intracardiac 주입을 통해 euthanized 후 근육내 케타민 (80 밀리그램 / kg BW), xylazine (8 밀리그램 / kg BW) 및 아트로 핀 (0.8 밀리그램 / kg BW)와 사출 및 경유 anesthetized 있습니다. Beuthanasia는 신속하고 고통없이 안락사에 사용할 수 pentobarbital 나트륨 / phenytoin 솔루션입니다. 0.2 ML - 쥐에 따라 저희 연구실은 일반적으로 0.1 넣을 꺼야. </li><li> 복강를 다시 열고 부드럽게 작은 창자를 제거하고 두 표시된 창을 찾습니다. </li><li> 포셉 및 마이크로 가위를 사용하여 exteriorized mesenteric 창을 각을 잘라 버릴거야. 지방마다 창의 테두리를 포함 시키면 나중에 조직은 현미경 슬라이드에 확산을위한 유리한 것입니다. 바로, PBS의 각 창에 젖어. 절단하면, 윈도우의 작성 잠재 혈액을 최소화하기 위해 창문 지방 국경 내에 동맥 / 정맥 쌍을 통해 절단되지 않도록하려고합니다. 또한 창자 내용의 결과 창에 문의하는 창자를 통해 절단 최소화. </li><li> 적극적으로 청구 현미경 슬라이드에 조직을 확산하기 위해 집게를 사용하십시오. 두 조직은 슬라이드마다 설치할 수 있습니다. </li><li> 조직이 부분적으로 건조하고 메스 블레이드는 과잉 지방을 제거를 사용하도록 허용합니다. </li><li> 휴지는 이제 수정되어야 준비가 된 것입니다. 일반적인 고정 방법을 사용할 수 있습니다. 저희 연구실에서는 일반적으로 30 분 동안 메탄올 (-20 ℃)​​에 슬라이드를 고정시킨다. 성공적인 상표는 또한 떼어낸 조직으로 수행되었습니다. 고정 방법은 선호하는 항체에 달려 있습니다. </li></ol> 4. 조직 Immunolabeling <ol><li> 조직은 일반적으로 지금 immunohistochemistry에 대한 항체 당 지시에 따라 분류 할 수 있습니다. 역할을 식별에서 우리의 관심을 감안할 때angiogenesis 동안 혈관 pericytes 때문에, 저희 연구실은 일반적으로 내피와 perivascular 세포 10, 12, 13 레이블. microvascular 네트워크의 계층 구조를 따라 내피 세포를 확인하는 유용한 라벨 방지 PECAM 항체 또는 BSI-렉틴입니다. 해당 조직에서 사용 Perivascular 세포 마커 NG2, desmin, SM-α actin, PDFGRβ하고, 클래스 III β-tubulin이 포함됩니다. 아래 섹션 3.3에서 우리는 colorimetric 및 형광 PECAM의 immunolabeling 프로토콜에 대해 프로토콜을 나열했습니다. </li><li> 초기 일차 항체 배양에 앞서, 슬라이드 초과 완충 용액을 제거하는 건조 진공 있습니다. 또한, 조직은 처음에는 멀리 조직에서 항체 솔루션의 통제 흐름을 방지하기 위해 왁스 펜으로 설명되어 있습니다. 마지막으로, 모든 레이블링 단계 세척 단계 뒤에있다. 단계를 씻는 경우, 슬라이드는 염색법 개랑 내부에 배치됩니다. 완충 용액은 세척 기간 동안 3 번 교환을하고 있습니다. </li><li> 내피 세포 항체 라벨링 절차 : &lt;P 클래스 = &quot;jove_step&quot;&gt; PECAM Colorimetric Lableing <ol><li> 일차 항체 배양 : 각 조직의 꼭대기에 약 100-200 ML 일차 항체 솔루션 (항체 완충액으로 희석 1:200 마우스 단클론 biotinylated CD31 항체 (PBS + 2퍼센트 BSA의 0.1 %의 사포닌)) 똑, 전체 조직이 있는지 확인 항체 용액으로 덮여. 상온에서 1 시간 배양. </li><li> 30 분 PBS 0.1 %의 사포닌과 조직 씻으십시오. </li><li> 차 항체 보육 : 똑 이차 항체 용액 (벡터 Laboratories의 VECTASTAIN 엘리트 ABC 솔루션, streptavidin 퍼옥시데이즈 이차 항체 용액) 조직의 꼭대기에서. 1 시간 정도 실온에서 품어. </li><li> 30 분 PBS 0.1 %의 사포닌과 조직 씻으십시오. </li><li> 15 분 동안 벡터 노바 레드와 조직을 품어. 그런 다음 물로 조직이 떠오 릅니다. </li><li> 마운트 슬라이드 : 95 %의 에탄올에서 물놀이 슬라이드 10 배. 잠그다 2 분 동안 100 %의 에탄올에 슬라이드. 또 100 % 에탄올에 잠그다 슬라이드하므로2 분 대한 lution. 그럼 이분 각각 연속 100 % 크실렌 솔루션에 잠그다 슬라이드. VectaMount의 얇은 레이어와 coverslip으로 조직을 건조하고 커버하도록 허용합니다. </li></ol> PECAM 형광 라벨 <ol><li> 일차 항체 배양 : 각 조직의 꼭대기에 약 100-200 ML 일차 항체 솔루션 (항체 완충액으로 희석 1:200 마우스 단클론 biotinylated CD31 항체 (PBS + 2퍼센트 BSA의 0.1 %의 사포닌)) 똑, 전체 조직이 있는지 확인 항체 용액으로 덮여. 상온에서 1 시간 배양. </li><li> 30 분 PBS 0.1 %의 사포닌과 조직 씻으십시오. </li><li> 차 항체 보육 :. 조직의 꼭대기에서 똑 이차 항체 솔루션 ((1:100 Streptavidin-CY3가 (PBS + 2퍼센트 BSA의 0.1 %의 사포닌) 항체 완충액으로 희석) 1 시간 동안 실온에서 품어. </li><li> 30 분 PBS 0.1 %의 사포닌과 조직 씻으십시오. </li><li> 마운트 슬라이드 : 조직의 꼭대기에서 글리세롤과 함께 50:50 PBS를 똑. 엄호커버 슬립으로. 그런 다음, 커버 슬립 및 슬라이드 사이의 격차를 봉인 매니큐어가 손톱도 사용. </li></ol></li></ol> 5. 대표 결과 immunohistochemically PECAM에 대한 레이블이 붙은 쥐의 장간막 조직의 대표 이미지는 그림 3에 표시됩니다. PECAM 라벨은 microvascular 네트워크를 리모델링의 계층 구조를 따라 모든 선박 유형을 식별하고 특정 시간 지점 포스트 자극에 angiogenic 통계를 계량하는 데 사용할 수 있습니다. PECAM 라벨은 또한 arterioles 대 venules의 결정을 허용합니다. 수유 arterioles 일반적으로 이점 venules (그림 4)에 비해 더 작은 직경과 길쭉한 내피 세포 형태를 나타냅니다. 모세 혈관과 모세 새싹들은 혈관의 직경 및 네트워크 내의 상대 위치를 기반으로 확인할 수 있습니다. 리모델링 네트워크의 일반적인 특성은 증가 돋아 모세관, 선박 밀도, vascularized 지역 및 venular tortuos 포함ity. 다양한 angiogenic 통계 부량는 네트워크의 성장 (그림 5)의 시간 코스를 식별합니다. 3 일 및 5 일째와 10 일째에 의해 unstimulated 수준으로 돌아갑니다 간의 기존 선박, 봉우리에서 돋아 모세관. 돋아의이 일시적 증가는 혈관 밀도와 vascularized 지역의 증가 뒤에있다. 이 모델의 큰 혈관의 리모델링에 대한 증거로서, arteriole과 venule 세그먼트의 숫자도 시간에 걸쳐 증가한다. 저희 연구실에서는이 모델이 개조 과정 10, 11 중 특정 시점에서 세포 phenotypic 변화를 식별하는 데 사용되었습니다. 예를 들어, 클래스 III β-tubulin은 angiogenic 혈관을 따라 pericytes (그림 6)를 식별합니다. unstimulated 조직에서, 클래스 III β-tubulin 표현은 신경 다릅니다. 대조적으로 돋아 모세관의 정상 동안, 클래스 III β-tubulin은 perivascular 세포에 의해 표현된다. 이러한 유형의결과의 angiogenic 과정에 참여 소설 셀 유형을 식별하려면이 간단하고 강력한 angiogenic 모델의 사용을 강조 표시합니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/3954/3954fig1.jpg" /> 그림 1. 플라스틱 무대 전후 수정의 이미지. 미리 수정된 무대 100mm 배양 접시입니다. 수정 중앙에 타원형의 구멍 잘라내기, 제기, 부드러운 표면의 생성을위한 구멍의 가장자리 모델링 찰흙이나 실리콘 접착제의 후속 또한 포함됩니다. 이것은 표면 exteriorized mesenteric 창이의 superfusion을 용이하게 내부 경계를 제공합니다. 스케일 바는 1cm입니다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/3954/3954fig2.jpg" /> 그림 2. exteriorized mesenteric 지역의 이미지. Mesenteric 창문은 작은 창자를주고 동맥 / 정맥 쌍 사이의 얇은 반투명의 세포막으로 정의됩니다. exteriorization 동안시간, mesenteric 지역은 뻗어 및 수정된 배양 접시 안에 식염수로 포장되어 있습니다. 불활성 노란색 모델링 클레이는 사전 컷 구멍을 통해 뽑았되는 장간막에 대한 매끄러운 표면을 제공합니다. 스케일 바는 1cm입니다. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/3954/3954fig3.jpg" /> 그림 3. unstimulated 조직 및 조직 3과 장간막 10 일 포스트 exteriorization에서 mesenteric microvascular 네트워크의 대표 이미지. PECAM 라벨이 arterioles (), venules (V)과 모세 혈관 (C)을 포함한 microvascular 네트워크의 계층 구조를 식별. 게시 자극은 microvascular 네트워크 모세관 돋아 (화살표 머리)와 혈관 밀도의 증가를 표시합니다. 스케일 바는 100 μm의입니다. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/3954/3954fig4.jpg" /> 성인 쥐 mesenteric의 microvascular 네트워크 내에서 arteriole / venule 쌍 그림 4. 대표 이미지의. 두 이미지에서 arterioles ()은 작은 상대적인 직경 길쭉한 내피 세포 형태학에 근거 venules (V)에서 구분 할 수 있습니다. 스케일 바는 20 μm의 수 있습니다. <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/3954/3954fig5.jpg" /> 그림 5. microvascular 성장 포스트 장간막의 exteriorization의 시간 코스 이상의 angiogenic 통계 대표 부량. 조직 면적 당) 혈관 공간이 있습니다. 혈관 면적 당 모세관 새싹 B) 번호. 혈관 면적 당 C) 총 혈관 길이. * unstimulated 그룹에 비해 상당한 차이를 나타냅니다. 통계 비교는 던의 시험 다음 편도 ANOVA를 사용하여 만들어 졌 었죠. (P &lt;0.05). 유엔 unstimulated 나타냅니다. <img alt="그림 6" src="/files/ftp_upload/3954/3954fig6.jpg" /> 그림 6. 3, 10시 unstimulated 조직 및 조직의 mesenteric microvascular 네트워크 대표 형광 이미지일 장간막의 exteriorization을 게시할 수 있습니다. Immunofluorescent PECAM 라벨 (빨간색)은 내피 세포를 식별하고, 클래스 III β-tubulin 라벨 (녹색)는 신경 (화살표 머리)와 perivascular 세포 (화살표) 식별합니다. Perivascular 세포는 transiently 돋아 모세관 중에 클래스 III β-tubulin을 upregulate. unstimulated microvascular 네트워크에서는, 클래스 III β-tubulin은 신경 구체적이고 perivascular 세포를 식별하지 않습니다. 삼일 포스트 자극, 클래스 III β-tubulin은 긍정적 microvessels 따라 perivascular 세포를 표시합니다. 10 일째함으로써, 클래스 III β-tubulin 표현 패턴 unstimulated 시나리오로 돌아갑니다 시작한다. 스케일 바는 50 μm의입니다. <img alt="그림 7" src="/files/ftp_upload/3954/3954fig7.jpg" /> 그림 7. 장간막의 exteriorization에 의해 자극을 microvascular 네트워크 성장하는 동안 추적 미리 표시된 로컬로 적용 세포의 가능성을 지원하는 이미지. 세포 mesenter 이상 superfused되었습니다20 분 exteriorization 기간 동안 IC 창. 일일 수술 후, DiI 라벨 세포 (적색)은 PECAM 긍정 microvessels (녹색)와 여자 초점 평면에서 관찰되었다. DiI 분류 골수 세포, B) 예 morphologies를 반올림하고 늘어나지 출전. 어떤 경우에는 (화살표) 세포 microvessels 따라 늘어나지되었다. C) DiI의 클러스터의 예 (화살표) 새싹 모세관의 끝부분 근처 mesenchymal 줄기 세포를 분류. 스케일 바는 50 μm의 (), 및 20 μm의 (B, C)입니다.

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우리는 공개 할게 없다.

exteriorization 모델은 2006 년에보고되었으며 angiogenesis 4-7의 이전 기계적 상해 쥐의 장간막 모델에서 적응하고 쥐의 장간막 9 활용할 잘 설립 IP 사출 모델로 비슷한 결과를 생산하고있다. 20 분 exteriorization 시간은 실험적으로 강력한 angiogenic 응답을 생산하기로 결정했다. 이 기간은 변경될 수 있지만, 그것은 기계론의 연구와 세포 혈통 연구에 대한 외인성 세포의 직접적인 응용 프로그램에 대한 angiogenic 억제제의 로컬 응용 4있게 않습니다. mesenteric 조직을 리모델링으로 세포 정관의 가능성은 사전 분류 골수 세포 및 mesenchymal 줄기 세포 (그림 7)을 사용하여 저희 연구실에서는 예비 연구 의해 인간의 지방 파생 stromal 세포 주입의 IP 14 운명을 조사의 성공을 지원합니다 . 저희 연구실에서는 pericyte의 중독을 식별하는 데이 모델을 사용했을angiogenic 응답 10 시간 코스 이상과 같은 고혈압 12과 같은 병적인 조건, 동안 angiogenic 가능성을 평가하기위한 otypic 변경됩니다. angiogenic 응답 및이 모델과 관련된 세포 표현형 변화는 또한 만성 hypoxia 노출 10, 11 등 다른 쥐의 mesenteric angiogenic 모델로 볼 수 있습니다. exteriorization 모델의 한계는 angiogenesis의 정확한 실행 메커니즘을 알 수있다는 것입니다. 장간막의 Exteriorization는 마스트 세포 degranulation 및 증가 히스타민 수준 6으로 연결되고, 아직 추가 조사가 더 많은 통찰력을 얻기 위해 필요합니다. angiogenic 자극은 microvascular 네트워크 계층에 걸쳐 강력한 개조 응답을 생산, 의심할 여지없이 다중 계승이다. 알 수없는 메커니즘이 모델의 주요 비판 남아 있지만, 그 재현성과 단순 세포 역학 invol을 식별하는 것이 매력적본질적으로 복잡한 모세관 돋아 과정에 ved. 모델의 재현성은 저희 연구실 10, 12에서 이전에 다음 ID로 출판 과정에서 여러 쥐의 변종에 걸쳐 microvascular 네트워크의 성장 (남성 Wistar과 여성의 Sprague-Dawley)의 시간 코스 이상의 비교 angiogenic 통계에 의해 지원됩니다. 이후, 성인 쥐의 mesenteric 조직의 대다수 vascularized이며, 모델은 또한 동물에 따라 검사 여러 조직을 허용합니다. 마우스 mesenteric 창이 덜 네이티브 vascularization을 가지고 있으며, 우리의 경험으로 볼 때 일반적으로 관찰할 분기 네트워크 부족으로 아쉽게도,이 모델은 유전자의 마우스 모델에 분명히 적용되지 않습니다. 미래의 응용 프로그램은 특정 시간 지점에서 내부 생체 현미경을 사용하여 angiogenesis 동안 혈관 기능의 조사 및 lymphangiogenesis와 neurogenesis에 참여 관련 핸드폰 역학 조사를 포함합니다. mesenteric 창문마다 고유의 vascularization의 범위는 rou 것으로 보인다지만나이 ghly 비례, 우리는 4-5 주 된 젊고 같은 남성의 Wistar 쥐에게 microvascular 네트워크를 분기 관찰했습니다. 이러한 관찰 exteriorization 모델도 연령대에 걸쳐 angiogenic 차이를 비교 적용할 수 있다고 제안합니다.

<table border="1"><tbody><tr><td> 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 추가 코멘트 </td></tr><tr><td> 싸다 </td><td> 추기경 건강 </td><td> 4012 </td><td> 12 &quot;x12&quot;바이오 쉴드 정기적인 살균 비밀에 </td></tr><tr><td> Noyes 마이크로 가위 </td><td> Roboz 외과 악기 </td><td> RS-5677 </td><td> Noyes 마이크로 봄 가위 분석 해 봅시다; 스트레이트, 샤프-의한 포인트, 13mm 절단 가장자리, 0.25mm 팁 폭, 4 1 / 2 &quot;전체 길이 </td></tr><tr><td> Graefe Forcep </td><td> Roboz 외과 악기 </td><td> RS-5135 </td><td> 집게 분석 해 봅시다 마이크로, 톱니, 완만한 곡선, 0.8mm 팁 폭, 4 &quot;길이 </td></tr><tr><td> Graefe Forcep </td><td> Roboz 외과 악기 </td><td> RS-5130 </td><td> 마이크로 분석 해 봅시다 집게, 톱니, 스트레이트, 0.8mm 팁 폭, 4 &quot;길이 </td></TR&gt; <tr><td> 4-0 봉합사 </td><td> ETHICON </td><td> 699G </td><td> (1.5 메트릭) ETHILON 나일론 봉합사 블랙 Monofilament </td></tr><tr><td> 5-0 봉합사 </td><td> ETHICON </td><td> 8556 </td><td> (1.0 메트릭) PROLENE Polyprolene 봉합해 블루 Monofilament </td></tr><tr><td> 7-0 봉합사 </td><td> ETHICON </td><td> 1647G </td><td> (0.5 메트릭) ETHILON 나일론 봉합사 블랙 Monofilament </td></tr><tr><td> Castroviejo 마이크로 니들 홀더 </td><td> 파인 과학 도구 </td><td> 12060-02 </td><td> 팁 폭 : 0.6mm 5mm : 길이 클램핑 길이 : 9cm 스트레이트 팁 </td></tr><tr><td> Castroviejo 니들 홀더 </td><td> 파인 과학 도구 </td><td> 12565-14 </td><td> 팁 모양 : 스트레이트 팁 폭 : 1.5mm 클램핑 길이 : 10mm 가위 없음 : 없음 잠금 : 예 길이 : 14cm 톱니 : 예 </td></tr><tr><td> 메스 핸들 </td><td> 로보Z 외과 악기 </td><td> RS-9843 </td><td> 메스 핸들, # 3, 솔리드, 4 &quot;길이 </td></tr><tr><td> 멸균 외과 블레이드 </td><td> 신시내티 외과 </td><td> 0110 </td><td> 스테인레스 스틸, 10 사이즈 </td></tr><tr><td> 페트리 요리 </td><td> 피셔 과학 </td><td> 08-757-13 </td><td> Slippable Beveled 릿지, </td></tr></tbody></table> 특정 외과 재료 및 도구의 표. <table border="1"><tbody><tr><td> 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 추가 코멘트 </td></tr><tr><td> Beuthanasia </td><td> Schering - 북두칠성 동물 건강 주식 회사 연합 (MWI 수의학 공급 주문할) </td><td> MWI # : 011168 </td><td> 주성분 : 100mL 당, 390 밀리그램 pentobarbital 나트륨, 50mg phenytoin 나트륨 </td></tr><tr><td> 케타민을 </td><td> 포트 닷지 동물 건강 (MWI 수의학 공급 주문할) </td><td> MWI # : 000680 </td><td> Kateset 100 MG / ML </td></tr><tr><td> Xylazine </td><td> 로이드. 주식 회사 (MWI 수의학 공급 주문할) </td><td> MWI # : 009307 </td><td> 100 MG / ML을 Anased </td></tr><tr><td> 식염 </td><td> Hospira 주식 회사 </td><td> 94-217-JT </td><td></td></tr><tr><td> PBS </td><td> 시그마 </td><td> 011M8207 </td><td></td></tr><tr><td> 사포닌 </td><td> 시그마 </td><td> BCBB4080 </td><td></td></tr><tr><td> PECAM (CD31) </td><td> BD Pharmingen </td><td> 553,371 </td><td></td></tr><tr><td> Streptavidin-CY3 </td><td> 잭슨 ImmunoResearch </td><td> 016-160-084 </td><td></td></tr><tr><td> BSA </td><td> 잭슨 ImmunoResearch </td><td> 096,555 </td><td></td></tr><tr><td> VECTASTAIN 엘리트 ABC </td><td> 벡터 연구소 </td><td> PK-6100 </td><td></td></tr><tr><td> 벡터 노바 레드 </td><td> 벡터 연구소 </td><td> SK-4800 </td><td></td></tr><tr><td> VectaMount </td><td> 벡터 연구소 </td><td> H-500 </td><td></td></tr></tbody></table> 특정 시약의 표

rat mesentery exteriorization: a model for investigating the cellular dynamics involved in angiogenesis

Microvacular 네트워크 성장과 개조는 상처 치유, 염증, 당뇨 망막 병증, 종양의 성장 및 다른 질병 조건 1, 2의 중요한 측면입니다. 네트워크 성장은 일반적으로 기존의 혈관에서 새로운 혈관의 성장으로 정의 angiogenesis에 기인한다. angiogenic 과정은 직접 perivascular 셀 코팅 및 선박 확대의 모세관 취득으로 정의, arteriogenesis 연결되어 있습니다. 말할 필요도없이, angiogenesis 과정이 복잡하고 세포 및 분자 수준 3에서 여러 선수들이 포함됩니다. microvascular 네트워크가 성장 방법을 이해하는 것이 angiogenesis의 시간 코스 이상의 네트워크 계층에 따라 공간적 및 시간적 역학을 식별합니다. 이 정보는 혈관의 성장을 조작 겨냥한 요법의 발전을 위해 중요합니다. 이 문서에 설명되어 exteriorization 모델 stimu을위한 간단하고 재현성 모델을 나타냅니다쥐의 장간막에서 angiogenesis를 lating. 이것은 쥐의 장간막 4-7의 상처 - 치유 모델에서 적응하고, 프로 - angiogenic 대리인 8, 9의 IP 주사를 통해 장간막에서 angiogenesis를 자극하는 대안입니다되었다. 그것이 최소한의 외과적인 개입이 필요하며 단일로 전체 microvascular 네트워크의 2 차원 시각화를 허용 조직의 비교적 짧은 시간 과정을 통해 모세관 콩나물, 혈관 영역과 혈관 밀도의 극적인, 재현성 증가를 생산하기 때문에 exteriorization 모델은 매력적입니다 세포 수준. 자극 성장은 외국 angiogenic 분자의 간섭없이 생리적 환경에서 자연 angiogenic 반응을 반영합니다. immunohistochemical 레이블링 방법을 사용하면,이 모델은 angiogenesis에 관여 소설 셀룰러 이벤트를 식별에 매우 유용하게 입증되었습니다. 수사관들은 쉽게 시간 SP와 리모델링의 시간 코스 중에 angiogenic 통계를 상호 연관 수이러한 셀룰러 phenotypic 변경이나 세포 상호 작용에 4, 5, 7, 10, 11 등 ecific 역학.

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Rat Mesentery Exteriorization: A Model for Investigating the Cellular Dynamics Involved in Angiogenesis

이 문서에서는 쥐의 장간막에 angiogenesis을 자극하기위한 간단한 모델을 설명합니다. 모델은 아래로 단일 세포 수준까지 전체 microvascular 네트워크의 얼굴 시각화 중이다있게 조직에서 비교적 짧은 시간 코스 이상의 모세관 돋아, 혈관 영역과 혈관 밀도의 극적인 증가를 생성합니다.

쥐의 장간막의 Exteriorization : Angiogenesis에 관련된 세포 역학을 조사하기위한 모델

Microvacular network growth and remodeling are critical aspects of wound healing, inflammation, diabetic retinopathy, tumor growth and other disease ...

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Research

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Biology

19.0K 조회수.  Tulane University. 이 문서에서는 쥐의 장간막에 angiogenesis을 자극하기위한 간단한 모델을 설명합니다. 모델은 아래로 단일 세포 수준까지 전체 microvascular 네트워크의 얼굴 시각화 중이다있게 조직에서 비교적 짧은 시간 코스 이상의 모세관 돋아, 혈관 영역과 혈관 밀도의 극적인 증가를 생성합니다.

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Christopher Hughes:  An in vitro model for the Study of Angiogenesis (Interview)

Christopher C.W. Hughes describes the utility of his culture system for studying angiogenesis in vitro.  He explains the importance of fibroblasts that secrete a critical, yet unidentified, soluble factor that allow endothelial cells to form vessels in culture that branch, form proper lumens, and undergo anastamosis.

Christopher Hughes:  An in vitro model for the Study of Angiogenesis Interview

Christopher C.W. Hughes describes the utility of his culture system for studying angiogenesis in vitro. He explains the importance of fibroblasts that secrete a critical, yet unidentified, soluble factor that allow endothelial cells to form vessels in culture that branch, form proper lumens, and undergo anastamosis.

크리스토퍼 휴즈 : Angiogenesis 연구를위한 체외 모델 (인터뷰)

Christopher C.W. Hughes describes the utility of his culture system for studying angiogenesis in vitro.  He explains the importance of fibroblasts that ...

연구

생물학

Rat Mesentery Angiogenesis Assay

The adult rat mesentery window angiogenesis assay is biologically appropriate and is exceptionally well suited to the 
study of sprouting angiogenesis in vivo [see review papers], which is the dominating form of angiogenesis in human tumors and non-tumor 
tissues, as discussed in invited review papers1,2. Angiogenesis induced in the membranous mesenteric parts by intraperitoneal (i.p.) injection of a pro-angiogenic factor can be modulated
by subcutaneous (s.c.), intravenous (i.v.) or oral (p.o.) treatment with modifying agents of choice. Each membranous part of the mesentery is 
translucent and framed by fatty tissue, giving it a window-like appearance.
The assay has the following advantageous features: (i) the test tissue is natively vascularized, albeit 
sparsely, and since it is extremely thin, the microvessel network is virtually two-dimensional, which allows the entire network 
to be assessed microscopically in situ; (ii) in adult rats the test tissue lacks significant physiologic angiogenesis, which characterizes
 most normal adult mammalian tissues; the degree of native vascularization is, however, correlated with age, as discussed in1; 
(iii) the negligible level of trauma-induced angiogenesis ensures high sensitivity; (iv) the 
assay replicates the clinical situation, as the angiogenesis-modulating test drugs are administered systemically and the responses 
observed reflect the net effect of all the metabolic, cellular, and molecular alterations induced by the treatment; (v) the assay 
allows assessments of objective, quantitative, unbiased variables of microvascular spatial extension, density, and network pattern 
formation, as well as of capillary sprouting, thereby enabling robust statistical analyses of the dose-effect and molecular 
structure-activity relationships; and (vi) the assay reveals with high sensitivity the toxic or harmful effects of treatments in 
terms of decreased rate of physiologic body-weight gain, as adult rats grow robustly.
Mast-cell-mediated angiogenesis was first demonstrated using this assay3,4. The model demonstrates a high level of 
discrimination regarding dosage-effect relationships and the measured effects of systemically administered chemically or functionally closely related drugs and proteins, 
including: (i) low-dosage, metronomically administered standard chemotherapeutics that yield diverse, drug-specific effects (i.e., 
angiogenesis-suppressive, neutral or angiogenesis-stimulating activities5); (ii) natural iron-unsaturated human lactoferrin, which stimulates 
VEGF-A-mediated angiogenesis6, and natural iron-unsaturated bovine lactoferrin, which inhibits VEGF-A-mediated angiogenesis7; and (iii) 
low-molecular-weight heparin fractions produced by various means8,9. Moreover, the assay is highly suited to studies of the combined 
effects on angiogenesis of agents that are administered systemically in a concurrent or sequential fashion.
The idea of making this video originated from the late Dr. Judah Folkman when he visited our laboratory and witnessed the methodology being demonstrated.
Review papers (invited) discussing and appraising the assay
Norrby, K. In vivo models of angiogenesis. J. Cell. Mol. Med. 10, 588-612 (2006).
Norrby, K. Drug testing with angiogenesis models. Expert Opin. Drug. Discov. 3, 533-549 (2008).

Normal adult vascularized mammalian tissue that lacks physiologic angiogenesis and that has not been exposed to surgical intervention is used to study: (i) the initiation and development of angiogenesis following intraperitoneal administration of test agents; and (ii) modification of angiogenesis following systemic administration of selected test agents.

쥐 장간막의 Angiogenesis 분석

The adult rat mesentery window angiogenesis assay is biologically appropriate and is exceptionally well suited to the 
study of sprouting angiogenesis in ...

Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans

Double-strand RNA-mediated interference (RNAi) is an effective strategy to knock down target gene expression1-3. It has been applied to many model systems including plants, invertebrates and vertebrates. There are various methods to achieve RNAi in vivo4,5. For example, the target gene may be transformed into an RNAi vector, and then either permanently or transiently transformed into cell lines or primary cells to achieve gene knockdown effects; alternatively synthesized double-strand oligonucleotides from specific target genes (RNAi oligos) may be transiently transformed into cell lines or primary cells to silence target genes; or synthesized double-strand RNA molecules may be microinjected into an organism. Since the nematode C. elegans uses bacteria as a food source, feeding the animals with bacteria expressing double-strand RNA against target genes provides a viable strategy6. Here we present an RNAi feeding method to score body size phenotype. Body size in C. elegans is regulated primarily by the TGF- &beta; - like ligand DBL-1, so this assay is appropriate for identification of TGF-&beta; signaling components7. We used different strains including two RNAi hypersensitive strains to repeat the RNAi feeding experiments. Our results showed that rrf-3 strain gave us the best expected RNAi phenotype. The method is easy to perform, reproducible, and easily quantified. Furthermore, our protocol minimizes the use of specialized equipment, so it is suitable for smaller laboratories or those at predominantly undergraduate institutions.

Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans

We demonstrate how to use the RNAi feeding technique to knock down target genes and score body size phenotype in C. elegans. This method could be used for a large scale screen to identify potential genetic components of interest, such as those involved in body size regulation by DBL-1/TGF-&beta; signaling.

선충류의 바디 크기 규정에 참여 유전자에 대한 화면으로 RNA로 인한 간섭 수유 전략을 사용하여<em&gt; C. elegans</em

Double-strand RNA-mediated interference (RNAi) is an effective strategy to knock down target gene expression1-3. It has been applied to many model systems ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the function and regulation of protein folding was studied in vitro, in isolated tissue culture cells and in unicellular organisms. Recent studies have uncovered links between protein homeostasis (proteostasis), metabolism, development, aging, and temperature-sensing. These findings have led to the development of new tools for monitoring protein folding in the model metazoan organism Caenorhabditis elegans. In our laboratory, we combine behavioral assays, imaging and biochemical approaches using temperature-sensitive or naturally occurring metastable proteins as sensors of the folding environment to monitor protein misfolding. Behavioral assays that are associated with the misfolding of a specific protein provide a simple and powerful readout for protein folding, allowing for the fast screening of genes and conditions that modulate folding. Likewise, such misfolding can be associated with protein mislocalization in the cell. Monitoring protein localization can, therefore, highlight changes in cellular folding capacity occurring in different tissues, at various stages of development and in the face of changing conditions. Finally, using biochemical tools ex vivo, we can directly monitor protein stability and conformation. Thus, by combining behavioral assays, imaging and biochemical techniques, we are able to monitor protein misfolding at the resolution of the organism, the cell, and the protein, respectively.

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

To study the relationship between protein homeostasis, stress and aging, we monitored changes in protein folding by following protein dysfunction, protein localization in the cell and protein stability at the organismal, cellular and protein levels, using the genetically tractable metazoan Caenorhabditis elegans as a model system.

사용<em&gt; 예쁜 꼬마 선충</em&gt; 다세포 생물의 단백질 항상성을 연구하는 모델 시스템으로

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

One-channel Cell-attached Patch-clamp Recording

Ion channel proteins are universal devices for fast communication across biological membranes. The temporal signature of the ionic flux they generate depends on properties intrinsic to each channel protein as well as the mechanism by which it is generated and controlled and represents an important area of current research. Information about the operational dynamics of ion channel proteins can be obtained by observing long stretches of current produced by a single molecule. Described here is a protocol for obtaining one-channel cell-attached patch-clamp current recordings for a ligand gated ion channel, the NMDA receptor, expressed heterologously in HEK293 cells or natively in cortical neurons. Also provided are instructions on how to adapt the method to other ion channels of interest by presenting the example of the mechano-sensitive channel PIEZO1. This method can provide data regarding the channel&#8217;s conductance properties and the temporal sequence of open-closed conformations that make up the channel&#8217;s activation mechanism, thus helping to understand their functions in health and disease.

Described here is a procedure for obtaining long stretches of current recording from one ion channel with the cell-attached patch-clamp technique. This method allows for observing, in real time, the pattern of open-close channel conformations that underlie the biological signal. These data inform about channel properties in undisturbed biological membranes.

1 채널의 세포 부착 된 패치 클램프 녹음

Ion channel proteins are universal devices for fast communication across biological membranes. The temporal signature of the ionic flux they generate ...

Microperfusion Technique to Investigate Regulation of Microvessel Permeability in Rat Mesentery

Experiments to measure the permeability properties of individually perfused microvessels provide a bridge between investigation of molecular and cellular mechanisms regulating vascular permeability in cultured endothelial cell monolayers and the functional exchange properties of whole microvascular beds. A method to cannulate and perfuse venular microvessels of rat mesentery and measure the hydraulic conductivity of the microvessel wall is described. The main equipment needed includes an intravital microscope with a large modified stage that supports micromanipulators to position three different microtools: (1) a beveled glass micropipette to cannulate and perfuse the microvessel; (2) a glass micro-occluder to transiently block perfusion and enable measurement of transvascular water flow movement at a measured hydrostatic pressure, and (3) a blunt glass rod to stabilize the mesenteric tissue at the site of cannulation. The modified Landis micro-occlusion technique uses red cells suspended in the artificial perfusate as markers of transvascular fluid movement, and also enables repeated measurements of these flows as experimental conditions are changed and hydrostatic and colloid osmotic pressure difference across the microvessels are carefully controlled. Measurements of hydraulic conductivity first using a control perfusate, then after re-cannulation of the same microvessel with the test perfusates enable paired comparisons of the microvessel response under these well-controlled conditions. Attempts to extend the method to microvessels in the mesentery of mice with genetic modifications expected to modify vascular permeability were severely limited because of the absence of long straight and unbranched microvessels in the mouse mesentery, but the recent availability of the rats with similar genetic modifications using the CRISPR/Cas9 technology is expected to open new areas of investigation where the methods described herein can be applied.

The modified Landis technique enables paired measurement of the hydraulic conductivity of individual microvessels in the mesentery of normal and genetically modified rats under control and test conditions using microperfusion techniques. It provides a convenient method to evaluate mechanisms that regulate microvessel permeability and transvascular exchange under physiological conditions.

Microperfusion 기술은 쥐 장간막에서 미세 혈관 투과성의 규정을 조사하기 위해

Experiments to measure the permeability properties of individually perfused microvessels provide a bridge between investigation of molecular and cellular ...

A Simple Bioassay for the Evaluation of Vascular Endothelial Growth Factors

The analysis of receptor tyrosine kinases and their interacting ligands involved in vascular biology is often challenging due to the constitutive expression of families of related receptors, a broad range of related ligands and the difficulty of dealing with primary cultures of specialized endothelial cells. Here we describe a bioassay for the detection of ligands to the vascular endothelial growth factor receptor-2 (VEGFR-2), a key transducer of signals that promote angiogenesis and lymphangiogenesis. A cDNA encoding a fusion of the extracellular (ligand-binding) region of VEGFR-2 with the transmembrane and cytoplasmic regions of the erythropoietin receptor (EpoR) is expressed in the factor-dependent cell line Ba/F3. This cell line grows in the presence of interleukin-3 (IL-3) and withdrawal of this factor results in death of the cells within 24 hr. Expression of the VEGFR-2/EpoR receptor fusion provides an alternative mechanism to promote survival and potentially proliferation of stably transfected Ba/F3 cells in the presence of a ligand capable of binding and cross-linking the extracellular portion of the fusion protein (i.e., one that can cross-link the VEGFR-2 extracellular region). The assay can be performed in two ways: a semi-quantitative approach in which small volumes of ligand and cells permit a rapid result in 24 hr, and a quantitative approach involving surrogate markers of a viable cell number. The assay is relatively easy to perform, is highly responsive to known VEGFR-2 ligands and can accommodate extracellular inhibitors of VEGFR-2 signaling such as monoclonal antibodies to the receptor or ligands, and soluble ligand traps.

We describe a simple cell-based bioassay for detecting, quantifying and monitoring the activity of members of the vascular endothelial growth factor family of ligands. The assay uses chimeric receptors expressed in a factor-dependent cell line to provide a semi-quantitative or quantitative assessment of receptor binding and cross-linking by the ligand.

혈관 내피 성장 인자의 평가에 대한 간단한 생물 검정

The analysis of receptor tyrosine kinases and their interacting ligands involved in vascular biology is often challenging due to the constitutive ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes within individual endothelial cells (ECs). These processes are critical for homeostatic maintenance such as wound healing, and are also crucial in promoting tumor growth and metastasis. EC morphology is defined by the organization of the cytoskeleton, a tightly regulated system of actin and microtubule (MT) dynamics that is known to control EC branching, polarity and directional migration, essential components of angiogenesis. To study MT dynamics, we used high-resolution fluorescence microscopy coupled with computational image analysis of fluorescently-labeled MT plus-ends to investigate MT growth dynamics and the regulation of EC branching morphology and directional migration. Time-lapse imaging of living Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) was performed following transfection with fluorescently-labeled MT End Binding protein 3 (EB3) and Mitotic Centromere Associated Kinesin (MCAK)-specific cDNA constructs to evaluate effects on MT dynamics. PlusTipTracker software was used to track EB3-labeled MT plus ends in order to measure MT growth speeds and MT growth lifetimes in time-lapse images. This methodology allows for the study of MT dynamics and the identification of how localized regulation of MT dynamics within sub-cellular regions contributes to the angiogenic processes of EC branching and migration.

Protocols for Human Umbilical Vein Endothelial Cell (HUVEC) culture, transient transfection of fluorescently-labeled markers of microtubule growth, live-cell imaging and automated analysis of interphase microtubule growth dynamics are detailed.

고해상도 시간 경과 이미징 및 생활 인간 제대 정맥 내피 세포의 미세 소관 역학의 자동 분석

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

The Assembly and Application of 'Shear Rings': A Novel Endothelial Model for Orbital, Unidirectional and Periodic Fluid Flow and Shear Stress

Deviations from normal levels and patterns of vascular fluid shear play important roles in vascular physiology and pathophysiology by inducing adaptive as well as pathological changes in endothelial phenotype and gene expression. In particular, maladaptive effects of periodic, unidirectional flow induced shear stress can trigger a variety of effects on several vascular cell types, particularly endothelial cells. While by now endothelial cells from diverse anatomic origins have been cultured, in-depth analyses of their responses to fluid shear have been hampered by the relative complexity of shear models (e.g., parallel plate flow chamber, cone and plate flow model). While these all represent excellent approaches, such models are technically complicated and suffer from drawbacks including relatively lengthy and complex setup time, low surface areas, requirements for pumps and pressurization often requiring sealants and gaskets, creating challenges to both maintenance of sterility and an inability to run multiple experiments. However, if higher throughput models of flow and shear were available, greater progress on vascular endothelial shear responses, particularly periodic shear research at the molecular level, might be more rapidly advanced. Here, we describe the construction and use of shear rings: a novel, simple-to-assemble, and inexpensive tissue culture model with a relatively large surface area that easily allows for a high number of experimental replicates in unidirectional, periodic shear stress studies on endothelial cells.

The Assembly and Application of &#039;Shear Rings&#039;: A Novel Endothelial Model for Orbital, Unidirectional and Periodic Fluid Flow and Shear Stress

Different levels and patterns of fluid shear are known to modulate endothelial gene expression, phenotype and susceptibility to disease. We discuss the assembly and use of 'shear rings': a model that produces unidirectional, periodic shear stress patterns. Shear rings are simple to assemble, economical and can produce high cell yields.

총회와 &#39;전단 반지&#39;의 응용 프로그램 : 궤도, 단방향 및 정기 유체 흐름 및 전단 응력에 대한 소설 내피 모델

Deviations from normal levels and patterns of vascular fluid shear play important roles in vascular physiology and pathophysiology by inducing adaptive as ...

Mass Spectrometry Analysis to Identify Ubiquitylation of EYFP-tagged CENP-A (EYFP-CENP-A)

Studying the structure and the dynamics of kinetochores and centromeres is important in understanding chromosomal instability (CIN) and cancer progression. How the chromosomal location and function of a centromere (i.e., centromere identity) are determined and participate in accurate chromosome segregation is a fundamental question. CENP-A is proposed to be the non-DNA indicator (epigenetic mark) of centromere identity, and CENP-A ubiquitylation is required for CENP-A deposition at the centromere, inherited through dimerization between cell division, and indispensable to cell viability.
Here we describe mass spectrometry analysis to identify ubiquitylation of EYFP-CENP-A K124R mutant suggesting that ubiquitylation at a different lysine is induced because of the EYFP tagging in the CENP-A K124R mutant protein. Lysine 306 (K306) ubiquitylation in EYFP-CENP-A K124R was successfully identified, which corresponds to lysine 56 (K56) in CENP-A through mass spectrometry analysis. A caveat is discussed in the use of GFP/EYFP or the tagging of high molecular weight protein as a tool to analyze the function of a protein. Current technical limit is also discussed for the detection of ubiquitylated bands, identification of site-specific ubiquitylation(s), and visualization of ubiquitylation in living cells or a specific single cell during the whole cell cycle.
The method of mass spectrometry analysis presented here can be applied to human CENP-A protein with different tags and other centromere-kinetochore proteins. These combinatory methods consisting of several assays/analyses could be recommended for researchers who are interested in identifying functional roles of ubiquitylation.

Mass Spectrometry Analysis to Identify Ubiquitylation of EYFP-tagged CENP-A EYFP-CENP-A

CENP-A ubiquitylation is an important requirement for CENP-A deposition at the centromere, inherited through dimerization between cell division, and indispensable to cell viability. Here we describe mass spectrometry analysis to identify ubiquitylation of EYFP-tagged CENP-A (EYFP-CENP-A) protein.