Questo lavoro è stato sostenuto dal Board of Regents dello Stato della Louisiana LEQSF (2009-12)-RD-A-19 (PI: WL Murfee) e la Tulane e Centro Ipertensione renale di Eccellenza finanziato dal NIH concessione P20RR017659-08 (PI : L. Gabriel Navar).

1. Set-Up Notes Procedura chirurgica <ol><li> Prima della chirurgia sterilizzare gli strumenti chirurgici e forniture. Forniture utilizzati per la procedura chirurgica sterile per ciascun ratto includono 1 pellicola di essere disposti come una superficie sterile per il collocamento di strumenti, un telo con un foro pretagliato in circa 0,5 x 1,5 nel nel centro per essere posizionato sul ratto , e garza. Il foro pretagliato sul telo si allinea con l&#39;incisione fatta sul ratto. Gli strumenti necessari per l&#39;intervento chirurgico comprendono 1 paio di forbici norma da utilizzare per tagliare materiale di sutura, due pinze e un porta ago sottile per la movimentazione e presa della sutura, un bisturi e con una lama. Abbiamo elencato i comuni strumenti utilizzati dal nostro laboratorio nella tabella di specifici materiali e strumenti chirurgici. Tuttavia, strumento di selezione finale dipende dalle preferenze sperimentatore. </li><li> Preparare lo spazio chirurgico. Inserire un mL 100 0,9% sacca salina sterile sotto un cuscinetto riscaldante per garantire che la soluzione salina che viene in contatto wesima il tessuto mesenterico viene preriscaldata a circa 37 ° C. In alternativa alla soluzione salina, è possibile utilizzare la soluzione di Ringer o altro tampone fisiologico. Lay out sterilizzati gli strumenti chirurgici e forniture su un telino sterile per un facile accesso durante la procedura di esteriorizzazione. Inoltre, avrete bisogno di cotton-fioc sterili applicatori e gli opportuni 3 tipi di suture (4-0, 5-0 e 7-0). Crea pacchetti sicuri sono già aperti in modo che i materiali possono essere raggiunti con la manipolazione sterile. Infine, disinfettare la pre-modificato fase plastica immergendolo in etanolo al 100% per almeno 5 minuti. Lo stadio è di 100 millimetri capsula Petri con un foro ellittico tagliato al centro (Figura 1). Uno strumento Dremel può essere usato per fare inizialmente e, se necessario, allargare il foro. Dopo che il foro viene effettuato, i bordi della plastica taglio sono realizzati liscia con carta abrasiva di grani diversi. Il palco è poi lavato e, infine, sia plastilina inerte (acquistato da un negozio di artigianato locale) o Silicil collante viene aggiunto al bordo del foro per fornire una posizione sollevata, superficie liscia. Prima di contatto con il tessuto, la fase dovrà essere adeguatamente lavate con soluzione fisiologica sterile. </li><li> Per questo modello di angiogenesi, si utilizzano in genere ratti maschi adulti Wistar (350 ± 25 g). Altri ceppi di ratto ed età possono essere utilizzati. Nel nostro laboratorio, i ratti vengono anestetizzati mediante iniezione intramuscolare di ketamina (80 mg / kg di peso corporeo), xilazina (8 mg / kg di peso corporeo) e atropina (0,08 mg / kg di peso corporeo). Dopo circa 5 minuti, l&#39;effetto di anestesia è confermata e la pelle addominale del ratto viene rasato. </li></ol> 2. Rat mesentere Modello Esteriorizzazione <ol><li> Posizionare il ratto anestetizzato sulla sua schiena su un tappetino di riscaldamento per mantenere la temperatura corporea. Tecniche asettiche vengono utilizzati durante la procedura chirurgica. Indossare guanti sterili e non consentono di strumenti e forniture a contatto con superfici diverse da quelle dei tessuti di ratto non sterili. </li><li> Pulire zona addominale con un&#39;alternanza di salviette USIng la garza sterile imbevuta nel 70% isopropilico e iodio. </li><li> Usando il bisturi, fare un piccolo (circa 0,75 cm) incisione longitudinale lungo la pelle e poi la linea alba di circa 1 cm sotto lo sterno. </li><li> Posizionare il pre-taglio telo sul tratto addominale in modo che l&#39;apertura si allinea con l&#39;incisione. </li><li> Esercitare una leggera pressione attorno l&#39;incisione. Ciò solitamente comporta l&#39;esposizione del piccolo intestino abbastanza per essere facilmente identificato. </li><li> Utilizzando gli applicatori di cotone punta, estrarre delicatamente una sezione dell&#39;intestino tenue e individuare l&#39;ileo. Poiché il mesentere viene estratta, esso dovrebbe essere leggermente spiegate in fase plastica (Figura 2). </li><li> Identificare 6-8 finestre mesenteriche vascolarizzati. Una finestra mesenterica è definita come la membrana sottile trasparente tra le dell&#39;arteria / vena coppie di alimentazione del piccolo intestino (Figura 2). </li><li> Registrare l&#39;ora di inizio del esteriorizzazione. Lasciare la mesenteRy sezione esteriorizzato per 20 minuti. Durante il periodo esteriorizzazione, utilizzare una siringa sterile (5 mL) per ricostituire la soluzione salina in modo intermittente nella capsula Petri per garantire che il tessuto rimanga immersa e non si secca. </li><li> Durante i 20 minuti di tempo di esposizione, segnano le 2 finestre mesenterici situati in posizione centrale con sutura sterile 7-0. I segni dovrebbero essere nella zona grasso vicino l&#39;intestino. </li><li> Ritorna la regione esteriorizzato del mesentere alla cavità addominale. </li><li> Chiudere il muscolo addominale con 5-0 sutura monofilamento in pattern interrotto. </li><li> Chiudere la pelle con sutura monofilamento 4-0 nel modello interrotto. </li><li> Pulire l&#39;area suturata con alternanza di salviette con la garza sterile imbevuta nel 70% isopropoyl e iodio. </li><li> Stendere gel lubrificante occhio entrambi gli occhi del ratto. Lo scopo di lubrificare l&#39;occhio è per prevenire l&#39;essiccamento della cornea durante la procedura chirurgica e il recupero. L&#39;applicazione di lubrificante oculare deve essere applicatoprima dell&#39;inizio di un intervento chirurgico. Se necessario, ri-applicare il lubrificante occhi prima di restituire il ratto alla sua gabbia per il recupero. </li></ol> 3. Tissue Raccolta e Fixation <ol><li> Il giorno dopo stimolazione interesse, anestetizzare e euthanize il ratto. Nel nostro laboratorio, i ratti vengono anestetizzati mediante iniezione intramuscolare di ketamina (80 mg / kg di peso corporeo), xilazina (8 mg / kg di peso corporeo) e atropina (0,8 mg / kg di peso corporeo) e poi l&#39;eutanasia mediante iniezione intracardiaca di beuthanasia. Beuthanasia è un pentobarbital di sodio / fenitoina soluzione che può essere utilizzato per l&#39;eutanasia rapida e indolore. Per ratto nostro laboratorio inietta in genere 0,1 - 0,2 ml. </li><li> Riaprire la cavità addominale e rimuovere delicatamente l&#39;intestino tenue e individuare i due segnalati finestre. </li><li> Tagliare ciascuna delle finestre mesenterici esteriorizzato con una pinzetta e micro-forbici. Compreso un bordo di grasso per ogni finestra è vantaggioso per il tessuto dopo la diffusione su vetrini da microscopio. Immediatamente, Immergere ogni finestra in PBS. Durante il taglio, cercare di evitare di tagliare attraverso l&#39;arteria / vena coppie all&#39;interno del bordo grasso delle finestre per ridurre al minimo il potenziale sangue riempimento delle finestre. Inoltre, minimizzare il taglio attraverso l&#39;intestino che risulta in contatto con il contenuto intestinale finestre. </li><li> Utilizzare pinze per diffondere tessuti su vetrini con carica positiva. Due tessuti possono essere montati per vetrino. </li><li> Lasciare asciugare i tessuti parzialmente e con una lama da bisturi rimuovere il grasso in eccesso. </li><li> I tessuti sono ora pronta per essere fissata. Tipici metodi di fissaggio possono essere usati. Nel nostro laboratorio, che comunemente fissare gli scivoli in metanolo (-20 ° C) per 30 min. L&#39;etichettatura di successo è stato eseguito anche con i tessuti non fissati. Metodi di fissaggio potrebbe dipendere il tuo preferito anticorpi. </li></ol> 4. Tissue immunomarcatura <ol><li> I tessuti in genere possono ora essere etichettati secondo le istruzioni per anticorpi per immunoistochimica. Dato il nostro interesse per identificare i ruolidi periciti vascolari durante l&#39;angiogenesi, il nostro laboratorio etichetta comunemente per le cellule endoteliali e perivascolari 10, 12, 13. Etichette utili per identificare le cellule endoteliali lungo la gerarchia delle reti microvascolari sono un anti-anticorpo o BSI PECAM-lectina. Marcatori cellulari perivascolari utilizzati in questo tessuto sono NG2, desmina, SM-α actina, PDFGRβ, e la classe III β-tubulina. Sotto, nella sezione 3.3, abbiamo elencato i protocolli per i protocolli PECAM colorimetriche e fluorescenti immunomarcatura. </li><li> Prima della prima incubazione anticorpo primario, vetrini sono essiccato sotto vuoto per rimuovere l&#39;eccesso di soluzione tampone. Inoltre, i tessuti sono inizialmente descritto con una penna cera per impedire flusso incontrollato di soluzioni anticorpo lontano dal tessuto. Infine, tutte le fasi di etichettatura sono seguiti da fasi di lavaggio. Per le fasi di lavaggio, i vetrini sono collocati all&#39;interno di contenitori per i lavaggi. La soluzione tampone viene scambiato 3 volte durante la durata di lavaggio. </li><li> Anticorpi delle cellule endoteliali delle procedure in materia di etichettatura: &lt;p class = &quot;jove_step&quot;&gt; PECAM colorimetrico Lableing <ol><li> Incubazione primaria: Drip circa 100-200 mL soluzione di anticorpo primario (1:200 monoclonale di topo biotinilato CD31 anticorpo diluito in un tampone di anticorpi (saponina 0,1% in PBS + 2% BSA)) sulla parte superiore per ogni tessuto, assicurarsi che il tessuto intero è coperto con soluzione di anticorpo. Incubazione per 1 ora a temperatura ambiente. </li><li> Lavare tessuti con saponina PBS 0,1% per 30 minuti. </li><li> Incubazione anticorpo secondario: soluzione di anticorpi Drip secondario (Vectastain Elite soluzione ABC da Vector Laboratories, una streptavidina perossidasi secondaria soluzione di anticorpi) sulla parte superiore dei tessuti. Incubare a temperatura ambiente per 1 ora. </li><li> Lavare tessuti con saponina PBS 0,1% per 30 minuti. </li><li> Incubare tessuti con Vector Red Nova per 15 minuti. Poi salire i tessuti con acqua. </li><li> Diapositive Mount: Immergere i vetrini in etanolo al 95% 10 volte. Immergere i vetrini in etanolo al 100% per 2 minuti. Immergere i vetrini in un altro modo di etanolo al 100%luzione per 2 minuti. Poi Immergere i vetrini in soluzioni consecutivi xilene 100% per 2 minuti ciascuno. Lasciare asciugare e coprire i tessuti con uno strato sottile di VectaMount e un coprioggetto. </li></ol> PECAM fluorescente Labeling <ol><li> Incubazione primaria: Drip circa 100-200 mL soluzione di anticorpo primario (1:200 monoclonale di topo biotinilato CD31 anticorpo diluito in un tampone di anticorpi (saponina 0,1% in PBS + 2% BSA)) sulla parte superiore per ogni tessuto, assicurarsi che il tessuto intero è coperto con soluzione di anticorpo. Incubazione per 1 ora a temperatura ambiente. </li><li> Lavare tessuti con saponina PBS 0,1% per 30 minuti. </li><li> Incubazione anticorpo secondario:. Soluzione di anticorpo secondario Drip ((1:100 streptavidina-CY3 diluito in tampone di anticorpo (0,1 saponina% in PBS + 2% BSA)) sulla sommità di tessuti Incubare a temperatura ambiente per 1 ora. </li><li> Lavare tessuti con saponina PBS 0,1% per 30 minuti. </li><li> Diapositive: Mount Drip 50:50 PBS con glicerolo in cima dei tessuti. Coprirecon polizza di copertura. Quindi, utilizzare smalto per sigillare il divario tra coprioggetto e scivolo. </li></ol></li></ol> 5. Risultati rappresentativi Immagini rappresentative di tessuti mesentere ratto immunoistochimicamente etichettati per PECAM sono mostrati in Figura 3. PECAM etichettatura identifica tutti i tipi di navi lungo la gerarchia di rimodellamento reti microvascolari e può essere usato per quantificare metriche angiogenici al momento specifico dopo stimolazione punti. PECAM etichettatura permette inoltre per la determinazione delle arteriole rispetto delle venule. Arteriole di alimentazione tipicamente presentano diametri più piccoli e di forma allungata morfologia delle cellule endoteliali rispetto a venule coppie (Figura 4). Capillari e germogli capillari possono essere identificati in base alla loro diametro del vaso e posizione relativa all&#39;interno di una rete. Caratteristiche tipiche delle reti rimodellamento comprendono un aumento capillare germinazione, la densità di navi, per zona vascolarizzata e tortuoso venularelità. Quantificazione di vari parametri angiogenici identifica l&#39;andamento nel tempo di crescita di rete (Figura 5). Capillare spuntano da vasi preesistenti, picchi tra il giorno 3 e il 5 ° giorno e ritorna al livello non stimolato dal 10 ° giorno. Questo aumento transitorio della germinazione è seguita da un aumento della densità vascolare e zona vascolarizzata. Come prova per il rimodellamento dei grandi vasi in questo modello, il numero di segmenti arteriole e venule aumenta anche nel corso del tempo. Nel nostro laboratorio, questo modello è stato utilizzato per identificare cellulari variazioni fenotipiche al punto nel tempo specifico durante questo processo di rimodellamento 10, 11. Ad esempio, classe III β-tubulina identifica periciti lungo vasi angiogenici (Figura 6). In tessuti non stimolate, classe III β-tubulina espressione è specifica del nervo. Al contrario, durante il picco di germinazione capillare, classe III β-tubulina è espresso da cellule perivascolari. Questo tipodel risultato evidenzia l&#39;uso di questo modello semplice e robusto angiogenico di identificare nuovi tipi di cellule coinvolte nel processo angiogenico. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3954/3954fig1.jpg" /> Figura 1. Immagini della fase plastica pre-e post-modifica. La fase di pre-modificato è un piatto di 100 millimetri Petri. Le modifiche comprendono un taglio ellittica foro al centro e la successiva aggiunta di creta o colla silicio al bordo del foro per la creazione di una sollevata, superficie liscia. Questa superficie fornisce un limite interno che facilita superfusione delle finestre mesenteriche esteriorizzato. Bar La scala è 1 cm. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3954/3954fig2.jpg" /> Figura 2. Immagine della regione mesenterica esteriorizzato. Finestre mesenteriche sono definite come le membrane sottili traslucide tra l&#39;arteria / vena coppie alimentano il piccolo intestino. Durante l&#39;esteriorizzazionedurata, la regione mesenterici è disposto e immersa in soluzione salina all&#39;interno di una capsula Petri modificato. Inerte plastilina giallo fornisce una superficie liscia per il mesentere per essere tirato attraverso il foro pretagliato. Bar La scala è 1 cm. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3954/3954fig3.jpg" /> Figura 3. Immagini rappresentative dei mesenterici reti microvascolari non stimolate dai tessuti e tessuti a 3 e 10 giorni dopo l&#39;esteriorizzazione del mesentere. PECAM etichettatura individuato la gerarchia delle reti microvascolari compreso, arteriole (A), venule (V) e capillari (C). Stimolazione Post, reti microvascolari visualizzato un aumento della germinazione capillare (punte di freccia) e la densità nave. Barra della scala è di 100 micron. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3954/3954fig4.jpg" /> Immagini rappresentative Figura 4. Di arteriole / venule coppie di adulti all&#39;interno della rete microvascolare mesenterica di rattos. In entrambe le immagini, arteriole (A) può essere differenziata da venule (V) basato su un diametro minore rispetto allungata e la morfologia delle cellule endoteliali. Barre di scala sono 20 micron. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/3954/3954fig5.jpg" /> Figura 5. Quantificazione Rappresentante di metriche angiogenici nel corso del tempo microvascolare esteriorizzazione mesentere messaggio crescita. A) nell&#39;area vascolare per area di tessuto. B) Numero di germogli di capillari per area vascolare. C) Lunghezza totale vascolare per area vascolare. * Rappresenta una differenza significativa rispetto al gruppo non stimolato. Confronti statistici sono stati realizzati con un One-Way ANOVA seguita dal test di Dunn. (P &lt;0,05). Delle Nazioni Unite rappresenta non stimolato. <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/3954/3954fig6.jpg" /> Figura 6. Rappresentativi immagini fluorescenti di mesenterici reti microvascolari non stimolate dai tessuti e tessuti a 3 e 10giorni dopo l&#39;esteriorizzazione del mesentere. Immunofluorescenza PECAM etichettatura (rosso) identifica le cellule endoteliali, e la classe III β-tubulina etichettatura (verde) identifica i nervi (punte di freccia) e cellule perivascolari (frecce). Cellule perivascolari transitoriamente upregulate classe III β-tubulina durante la germinazione capillare. In stimolate reti microvascolari, classe III β-tubulina è nervo specifico e non identificare le cellule perivascolari. 3 giorni dopo la stimolazione, classe III β-tubulina etichetta positivamente cellule perivascolari lungo microvasi. Di giorno 10, classe III β-tubulina modello di espressione inizia a ritornare allo scenario non stimolato. Barra della scala è di 50 micron. <img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/3954/3954fig7.jpg" /> Figura 7. Immagini che sostengono la fattibilità di monitoraggio pre-etichettati cellule localmente applicati durante la crescita della rete microvascolare stimolata dalla esteriorizzazione mesentere. Le cellule sono state superfuso sopra mesenteric finestre durante il periodo di 20 minuti l&#39;esteriorizzazione. 1 giorno post-operatorio, Dii cellule marcate (rosso) sono stati osservati nel piano focale con dame PECAM positivo microvasi (verde). A, B) Esempi di cellule del midollo osseo Dii marcate esporre arrotondata e allungata morfologie. In alcuni casi (frecce) le cellule sono state allungata lungo microvasi. C) Esempio di un cluster di DII marcato cellule staminali mesenchimali in prossimità della punta di un capillare germoglio (freccia). Barre di scala sono 50 micron (A), e 20 micron (B, C).

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Non abbiamo nulla da rivelare.

Il modello di esteriorizzazione è stato segnalato nel 2006 e adattato da precedenti modelli meccanici mesentere ratto lesioni dell&#39;angiogenesi 4-7 e produce risultati simili a quelli già consolidati modelli ad iniezione ip che sfruttano il ratto mesentere 9. Il tempo di esteriorizzazione 20 minuti è stato determinato sperimentalmente per produrre una robusta risposta angiogenica. Durante questo periodo di tempo può essere variata, lo fa permettere l&#39;applicazione locale di inibitori angiogenici 4 per studi meccanicistici e l&#39;applicazione diretta di cellule esogene per gli studi linea cellulare. Fattibilità di incorporazione cella in rimodellamento tissutale mesenterica è supportata da studi preliminari nel nostro laboratorio utilizzando pre-etichettati cellule del midollo osseo e cellule staminali mesenchimali (figura 7), e dal successo di indagare il destino dell&#39;essere umano derivate da tessuto adiposo cellule stromali iniezione ip 14 . Nel nostro laboratorio, abbiamo usato questo modello per identificare Phen pericitiotypic modifiche nel corso del tempo di risposta angiogenica 10 e valutare il potenziale angiogenico in condizioni patologiche, quali ipertensione 12. La risposta angiogenica e le modifiche fenotipo delle cellule associate a questo modello può essere osservato anche in altri modelli mesenteriche del ratto angiogenici tra cui l&#39;esposizione cronica ipossia 10, 11. Un limite del modello di esteriorizzazione è che l&#39;esatto meccanismo di innesco di angiogenesi sono sconosciuti. Esteriorizzazione del mesentere è stato collegato a degranulazione dei mastociti e aumento dei livelli di istamina 6, ma sono necessarie ulteriori ricerche per ottenere un quadro più chiaro. Lo stimolo angiogenico è indubbiamente multi-fattoriale, producendo una risposta forte rimodellamento attraverso la gerarchia di una rete microvascolare. Mentre i meccanismi sconosciuti rimangono una critica importante di questo modello, la sua riproducibilità e la semplicità lo rendono interessante per l&#39;identificazione dinamica del cellulare coinved nel intrinsecamente complesso processo di germinazione capillare. La riproducibilità del modello è supportato da comparabili metriche angiogenici nel corso tempo di crescita di rete microvascolare in ceppi multipli di ratto (Wistar maschi e femmina Sprague-Dawley) in studi pubblicati in precedenza dal nostro laboratorio 10, 12. Poiché, la maggior parte dei tessuti adulti mesenterici ratto sono vascolarizzati, il modello consente anche per diversi tessuti da esaminare per animale. Purtroppo, questo modello non è ovviamente applicabile ai modelli murini genetici come finestre mesenterici mouse hanno meno vascolarizzazione nativa e, nella nostra esperienza, comunemente osservabili mancano reti ramificate. Le applicazioni future includono l&#39;indagine di funzionalità nave durante l&#39;angiogenesi con intra-vital microscopia in punti temporali specifici e l&#39;indagine delle relative dinamiche cellulari coinvolti in linfoangiogenesi e neurogenesi. Anche se il grado di vascolarizzazione nativa per finestra mesenterica sembra essere roughly proporzionale con l&#39;età, abbiamo osservato ramificazione reti microvascolari in ratti maschi Wistar di appena 4-5 settimane di età. Queste osservazioni suggeriscono che il modello esteriorizzazione potrebbe essere applicata anche per confrontare le differenze angiogeniche attraverso età.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Ulteriori commenti </td></tr><tr><td> Drappo </td><td> Cardinal Health </td><td> 4012 </td><td> 12 &quot;x12&quot; Bio-Shield Sterilizzazione Regular Wraps </td></tr><tr><td> Noyes Micro Scissor </td><td> Roboz strumento chirurgico </td><td> RS-5677 </td><td> Noyes Micro Forbici per dissezione di primavera; Diritti, Sharp-Blunt punti; tagliente 13 millimetri, larghezza Tip 0.25mm, 4 1/2 &quot;Lunghezza totale </td></tr><tr><td> Graefe Pinza </td><td> Roboz strumento chirurgico </td><td> RS-5135 </td><td> Micro Pinza dissezione, seghettato, leggera curva; Larghezza Tip 0.8mm; 4 &quot;Length </td></tr><tr><td> Graefe Pinza </td><td> Roboz strumento chirurgico </td><td> RS-5130 </td><td> Micro dissettore; dentellate, diritte, larghezza Tip 0.8mm; 4 &quot;Lunghezza </td></tr&gt; <tr><td> Filo di sutura 4-0 </td><td> ETHICON </td><td> 699G </td><td> (1,5 metrico) ETHILON sutura monofilamento in nylon nero </td></tr><tr><td> 5-0 sutura </td><td> ETHICON </td><td> 8556 </td><td> (1,0 metrico) PROLENE Polyprolene Blu sutura monofilamento </td></tr><tr><td> 7-0 sutura </td><td> ETHICON </td><td> 1647G </td><td> (0,5 metrico) ETHILON sutura monofilamento in nylon nero </td></tr><tr><td> Porta aghi Castroviejo Micro </td><td> Strumenti di Scienze Belle </td><td> 12060-02 </td><td> Suggerimento Larghezza: 0,6 millimetri Lunghezza di serraggio: 5mm Lunghezza: 9cm Punta dritta </td></tr><tr><td> Porta aghi Castroviejo </td><td> Strumenti di Scienze Belle </td><td> 12565-14 </td><td> Forma punta: Etero Suggerimento Larghezza: 1,5 mm Lunghezza di serraggio: 10mm Forbici: No Blocco: Sì Lunghezza: 14cm Seghettato: Sì </td></tr><tr><td> Manico bisturi </td><td> Roboz strumento chirurgico </td><td> RS-9843 </td><td> Scalpel Handle, # 3; Solid, 4 &quot;Length </td></tr><tr><td> Sterile lama chirurgica </td><td> Cincinnati chirurgico </td><td> 0110 </td><td> Acciaio; Size 10 </td></tr><tr><td> Petri Dish </td><td> Fisher Scientific </td><td> 08-757-13 </td><td> Ridge smussata, Slippable </td></tr></tbody></table> Tabella di specifici materiali e strumenti chirurgici. <table border="1"><tbody><tr><td> Nome </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Ulteriori commenti </td></tr><tr><td> Beuthanasia </td><td> Schering-Plough Animal Health Corp. Union (ordinati da alimentazione MWI Veterinaria) </td><td> MWI #: 011168 </td><td> Ingrediente attivo: Per 100 ml, 390 mg di sodio pentobarbital, sodio 50mg fenitoina </td></tr><tr><td> Ketamina </td><td> Fort Dodge Animal Health (ordinati da alimentazione MWI Veterinaria) </td><td> MWI #: 000680 </td><td> Kateset 100 mg / ml </td></tr><tr><td> Xilazina </td><td> LLOYD. Inc. (Ordinati da alimentazione MWI Veterinaria) </td><td> MWI #: 009307 </td><td> Anased 100 mg / ml </td></tr><tr><td> Salino </td><td> Hospira Inc. </td><td> 94-217-JT </td><td></td></tr><tr><td> PBS </td><td> SIGMA </td><td> 011M8207 </td><td></td></tr><tr><td> Saponina </td><td> Sigma </td><td> BCBB4080 </td><td></td></tr><tr><td> PECAM (CD31) </td><td> BD Pharmingen </td><td> 553371 </td><td></td></tr><tr><td> Streptavidina-CY3 </td><td> Jackson ImmunoResearch </td><td> 016-160-084 </td><td></td></tr><tr><td> BSA </td><td> Jackson ImmunoResearch </td><td> 096555 </td><td></td></tr><tr><td> Vectastain Elite ABC </td><td> Vector Laboratories </td><td> PK-6100 </td><td></td></tr><tr><td> Vector Nova Red </td><td> Vector Laboratories </td><td> SK-4800 </td><td></td></tr><tr><td> VectaMount </td><td> Vector Laboratories </td><td> H-500 </td><td></td></tr></tbody></table> Tabella di reagenti specifici

rat mesentery exteriorization: a model for investigating the cellular dynamics involved in angiogenesis

Crescita della rete Microvacular e il rimodellamento sono aspetti critici di guarigione delle ferite, l&#39;infiammazione, retinopatia diabetica, la crescita del tumore e le condizioni di altre malattie 1, 2. Crescita di rete è comunemente attribuito angiogenesi, definita come la crescita di nuovi vasi da vasi preesistenti. L&#39;angiogenesi è inoltre direttamente collegata arteriogenesi, definito come l&#39;acquisizione capillare di un rivestimento cellula perivascolare e allargamento vaso. Inutile dire, l&#39;angiogenesi è complessa e coinvolge più giocatori a livello cellulare e molecolare 3. La comprensione di come una rete microvascolare cresce richiede identificare le dinamiche spaziali e temporali lungo la gerarchia di una rete nel corso del tempo angiogenesi. Queste informazioni sono importanti per lo sviluppo di terapie mirate a manipolare crescita dei vasi. Il modello esteriorizzazione descritto in questo articolo rappresenta un modello semplice e riproducibile per stimolarelante angiogenesi nel mesentere ratto. E &#39;stato adattato da modelli di guarigione delle ferite nel ratto mesentere 4-7, ed è una alternativa per stimolare l&#39;angiogenesi nel mesentere tramite iniezioni ip di pro-angiogenici agenti 8, 9. Il modello esteriorizzazione è interessante perché richiede un minimo intervento chirurgico e produce drammatiche, aumenti riproducibili in germogli capillari, zona vascolare e la densità vascolare in un corso di tempo relativamente breve in un tessuto che permette la visualizzazione bidimensionale di reti microvascolari interi fino a singola Level Cell. La crescita riflette naturali stimolato risposte angiogenici in un ambiente fisiologico, senza interferenza di stranieri molecole angiogenici. Utilizzando i metodi immunoistochimici etichettatura, questo modello è stato dimostrato estremamente utile per identificare nuovi eventi cellulari coinvolti nell&#39;angiogenesi. Gli investigatori può facilmente correlare le metriche angiogenici nel corso del tempo rimodellamento con tempo specific dinamiche, quali cellulari modificazioni fenotipiche o interazioni cellulari 4, 5, 7, 10, 11.

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Rat Mesentery Exteriorization: A Model for Investigating the Cellular Dynamics Involved in Angiogenesis

Questo articolo descrive un semplice modello per stimolare l&#39;angiogenesi nel mesentere ratto. Il modello produce aumenti drammatici nel capillare germinazione, zona vascolare e densità vascolare in un corso di tempo relativamente breve in un tessuto che permette la visualizzazione en faccia di intere reti microvascolari fino al livello di singola cellula.

Rat Esteriorizzazione mesentere: un modello per indagare le dinamiche cellulari coinvolti nell&#39;angiogenesi

Microvacular network growth and remodeling are critical aspects of wound healing, inflammation, diabetic retinopathy, tumor growth and other disease ...

rat-mesentery-exteriorization-model-for-investigating-cellular

Research

JoVE Journal

Biology

19.0K Views.  Tulane University. Questo articolo descrive un semplice modello per stimolare l'angiogenesi nel mesentere ratto. Il modello produce aumenti drammatici nel capillare germinazione, zona vascolare e densità vascolare in un corso di tempo relativamente breve in un tessuto che permette la visualizzazione en faccia di intere reti microvascolari fino al livello di singola cellula.

Video: Rat Mesentery Exteriorization: A Model for Investigating the Cellular Dynamics Involved in Angiogenesis

Christopher Hughes:  An in vitro model for the Study of Angiogenesis (Interview)

Christopher C.W. Hughes describes the utility of his culture system for studying angiogenesis in vitro.  He explains the importance of fibroblasts that secrete a critical, yet unidentified, soluble factor that allow endothelial cells to form vessels in culture that branch, form proper lumens, and undergo anastamosis.

Christopher Hughes:  An in vitro model for the Study of Angiogenesis Interview

Christopher C.W. Hughes describes the utility of his culture system for studying angiogenesis in vitro. He explains the importance of fibroblasts that secrete a critical, yet unidentified, soluble factor that allow endothelial cells to form vessels in culture that branch, form proper lumens, and undergo anastamosis.

Christopher Hughes: un modello in vitro per lo studio dell&#39;angiogenesi (Intervista)

Christopher C.W. Hughes describes the utility of his culture system for studying angiogenesis in vitro.  He explains the importance of fibroblasts that ...

Ricerca

Biologia

Rat Mesentery Angiogenesis Assay

The adult rat mesentery window angiogenesis assay is biologically appropriate and is exceptionally well suited to the 
study of sprouting angiogenesis in vivo [see review papers], which is the dominating form of angiogenesis in human tumors and non-tumor 
tissues, as discussed in invited review papers1,2. Angiogenesis induced in the membranous mesenteric parts by intraperitoneal (i.p.) injection of a pro-angiogenic factor can be modulated
by subcutaneous (s.c.), intravenous (i.v.) or oral (p.o.) treatment with modifying agents of choice. Each membranous part of the mesentery is 
translucent and framed by fatty tissue, giving it a window-like appearance.
The assay has the following advantageous features: (i) the test tissue is natively vascularized, albeit 
sparsely, and since it is extremely thin, the microvessel network is virtually two-dimensional, which allows the entire network 
to be assessed microscopically in situ; (ii) in adult rats the test tissue lacks significant physiologic angiogenesis, which characterizes
 most normal adult mammalian tissues; the degree of native vascularization is, however, correlated with age, as discussed in1; 
(iii) the negligible level of trauma-induced angiogenesis ensures high sensitivity; (iv) the 
assay replicates the clinical situation, as the angiogenesis-modulating test drugs are administered systemically and the responses 
observed reflect the net effect of all the metabolic, cellular, and molecular alterations induced by the treatment; (v) the assay 
allows assessments of objective, quantitative, unbiased variables of microvascular spatial extension, density, and network pattern 
formation, as well as of capillary sprouting, thereby enabling robust statistical analyses of the dose-effect and molecular 
structure-activity relationships; and (vi) the assay reveals with high sensitivity the toxic or harmful effects of treatments in 
terms of decreased rate of physiologic body-weight gain, as adult rats grow robustly.
Mast-cell-mediated angiogenesis was first demonstrated using this assay3,4. The model demonstrates a high level of 
discrimination regarding dosage-effect relationships and the measured effects of systemically administered chemically or functionally closely related drugs and proteins, 
including: (i) low-dosage, metronomically administered standard chemotherapeutics that yield diverse, drug-specific effects (i.e., 
angiogenesis-suppressive, neutral or angiogenesis-stimulating activities5); (ii) natural iron-unsaturated human lactoferrin, which stimulates 
VEGF-A-mediated angiogenesis6, and natural iron-unsaturated bovine lactoferrin, which inhibits VEGF-A-mediated angiogenesis7; and (iii) 
low-molecular-weight heparin fractions produced by various means8,9. Moreover, the assay is highly suited to studies of the combined 
effects on angiogenesis of agents that are administered systemically in a concurrent or sequential fashion.
The idea of making this video originated from the late Dr. Judah Folkman when he visited our laboratory and witnessed the methodology being demonstrated.
Review papers (invited) discussing and appraising the assay
Norrby, K. In vivo models of angiogenesis. J. Cell. Mol. Med. 10, 588-612 (2006).
Norrby, K. Drug testing with angiogenesis models. Expert Opin. Drug. Discov. 3, 533-549 (2008).

Normal adult vascularized mammalian tissue that lacks physiologic angiogenesis and that has not been exposed to surgical intervention is used to study: (i) the initiation and development of angiogenesis following intraperitoneal administration of test agents; and (ii) modification of angiogenesis following systemic administration of selected test agents.

Rat mesentere angiogenesi Assay

The adult rat mesentery window angiogenesis assay is biologically appropriate and is exceptionally well suited to the 
study of sprouting angiogenesis in ...

Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans

Double-strand RNA-mediated interference (RNAi) is an effective strategy to knock down target gene expression1-3. It has been applied to many model systems including plants, invertebrates and vertebrates. There are various methods to achieve RNAi in vivo4,5. For example, the target gene may be transformed into an RNAi vector, and then either permanently or transiently transformed into cell lines or primary cells to achieve gene knockdown effects; alternatively synthesized double-strand oligonucleotides from specific target genes (RNAi oligos) may be transiently transformed into cell lines or primary cells to silence target genes; or synthesized double-strand RNA molecules may be microinjected into an organism. Since the nematode C. elegans uses bacteria as a food source, feeding the animals with bacteria expressing double-strand RNA against target genes provides a viable strategy6. Here we present an RNAi feeding method to score body size phenotype. Body size in C. elegans is regulated primarily by the TGF- &beta; - like ligand DBL-1, so this assay is appropriate for identification of TGF-&beta; signaling components7. We used different strains including two RNAi hypersensitive strains to repeat the RNAi feeding experiments. Our results showed that rrf-3 strain gave us the best expected RNAi phenotype. The method is easy to perform, reproducible, and easily quantified. Furthermore, our protocol minimizes the use of specialized equipment, so it is suitable for smaller laboratories or those at predominantly undergraduate institutions.

Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans

We demonstrate how to use the RNAi feeding technique to knock down target genes and score body size phenotype in C. elegans. This method could be used for a large scale screen to identify potential genetic components of interest, such as those involved in body size regulation by DBL-1/TGF-&beta; signaling.

Utilizzo di RNA-mediata strategia di alimentazione di interferenza secondo schermo per geni coinvolti nella regolazione Dimensione del corpo nel nematode<em&gt; C. elegans</em

Double-strand RNA-mediated interference (RNAi) is an effective strategy to knock down target gene expression1-3. It has been applied to many model systems ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the function and regulation of protein folding was studied in vitro, in isolated tissue culture cells and in unicellular organisms. Recent studies have uncovered links between protein homeostasis (proteostasis), metabolism, development, aging, and temperature-sensing. These findings have led to the development of new tools for monitoring protein folding in the model metazoan organism Caenorhabditis elegans. In our laboratory, we combine behavioral assays, imaging and biochemical approaches using temperature-sensitive or naturally occurring metastable proteins as sensors of the folding environment to monitor protein misfolding. Behavioral assays that are associated with the misfolding of a specific protein provide a simple and powerful readout for protein folding, allowing for the fast screening of genes and conditions that modulate folding. Likewise, such misfolding can be associated with protein mislocalization in the cell. Monitoring protein localization can, therefore, highlight changes in cellular folding capacity occurring in different tissues, at various stages of development and in the face of changing conditions. Finally, using biochemical tools ex vivo, we can directly monitor protein stability and conformation. Thus, by combining behavioral assays, imaging and biochemical techniques, we are able to monitor protein misfolding at the resolution of the organism, the cell, and the protein, respectively.

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

To study the relationship between protein homeostasis, stress and aging, we monitored changes in protein folding by following protein dysfunction, protein localization in the cell and protein stability at the organismal, cellular and protein levels, using the genetically tractable metazoan Caenorhabditis elegans as a model system.

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

One-channel Cell-attached Patch-clamp Recording

Ion channel proteins are universal devices for fast communication across biological membranes. The temporal signature of the ionic flux they generate depends on properties intrinsic to each channel protein as well as the mechanism by which it is generated and controlled and represents an important area of current research. Information about the operational dynamics of ion channel proteins can be obtained by observing long stretches of current produced by a single molecule. Described here is a protocol for obtaining one-channel cell-attached patch-clamp current recordings for a ligand gated ion channel, the NMDA receptor, expressed heterologously in HEK293 cells or natively in cortical neurons. Also provided are instructions on how to adapt the method to other ion channels of interest by presenting the example of the mechano-sensitive channel PIEZO1. This method can provide data regarding the channel&#8217;s conductance properties and the temporal sequence of open-closed conformations that make up the channel&#8217;s activation mechanism, thus helping to understand their functions in health and disease.

Described here is a procedure for obtaining long stretches of current recording from one ion channel with the cell-attached patch-clamp technique. This method allows for observing, in real time, the pattern of open-close channel conformations that underlie the biological signal. These data inform about channel properties in undisturbed biological membranes.

Un canale Cell-allegato patch-clamp registrazione

Ion channel proteins are universal devices for fast communication across biological membranes. The temporal signature of the ionic flux they generate ...

Microperfusion Technique to Investigate Regulation of Microvessel Permeability in Rat Mesentery

Experiments to measure the permeability properties of individually perfused microvessels provide a bridge between investigation of molecular and cellular mechanisms regulating vascular permeability in cultured endothelial cell monolayers and the functional exchange properties of whole microvascular beds. A method to cannulate and perfuse venular microvessels of rat mesentery and measure the hydraulic conductivity of the microvessel wall is described. The main equipment needed includes an intravital microscope with a large modified stage that supports micromanipulators to position three different microtools: (1) a beveled glass micropipette to cannulate and perfuse the microvessel; (2) a glass micro-occluder to transiently block perfusion and enable measurement of transvascular water flow movement at a measured hydrostatic pressure, and (3) a blunt glass rod to stabilize the mesenteric tissue at the site of cannulation. The modified Landis micro-occlusion technique uses red cells suspended in the artificial perfusate as markers of transvascular fluid movement, and also enables repeated measurements of these flows as experimental conditions are changed and hydrostatic and colloid osmotic pressure difference across the microvessels are carefully controlled. Measurements of hydraulic conductivity first using a control perfusate, then after re-cannulation of the same microvessel with the test perfusates enable paired comparisons of the microvessel response under these well-controlled conditions. Attempts to extend the method to microvessels in the mesentery of mice with genetic modifications expected to modify vascular permeability were severely limited because of the absence of long straight and unbranched microvessels in the mouse mesentery, but the recent availability of the rats with similar genetic modifications using the CRISPR/Cas9 technology is expected to open new areas of investigation where the methods described herein can be applied.

The modified Landis technique enables paired measurement of the hydraulic conductivity of individual microvessels in the mesentery of normal and genetically modified rats under control and test conditions using microperfusion techniques. It provides a convenient method to evaluate mechanisms that regulate microvessel permeability and transvascular exchange under physiological conditions.

Microperfusione Tecnica per Indagare regolamento di microvasi permeabilità a Rat mesentere

Experiments to measure the permeability properties of individually perfused microvessels provide a bridge between investigation of molecular and cellular ...

A Simple Bioassay for the Evaluation of Vascular Endothelial Growth Factors

The analysis of receptor tyrosine kinases and their interacting ligands involved in vascular biology is often challenging due to the constitutive expression of families of related receptors, a broad range of related ligands and the difficulty of dealing with primary cultures of specialized endothelial cells. Here we describe a bioassay for the detection of ligands to the vascular endothelial growth factor receptor-2 (VEGFR-2), a key transducer of signals that promote angiogenesis and lymphangiogenesis. A cDNA encoding a fusion of the extracellular (ligand-binding) region of VEGFR-2 with the transmembrane and cytoplasmic regions of the erythropoietin receptor (EpoR) is expressed in the factor-dependent cell line Ba/F3. This cell line grows in the presence of interleukin-3 (IL-3) and withdrawal of this factor results in death of the cells within 24 hr. Expression of the VEGFR-2/EpoR receptor fusion provides an alternative mechanism to promote survival and potentially proliferation of stably transfected Ba/F3 cells in the presence of a ligand capable of binding and cross-linking the extracellular portion of the fusion protein (i.e., one that can cross-link the VEGFR-2 extracellular region). The assay can be performed in two ways: a semi-quantitative approach in which small volumes of ligand and cells permit a rapid result in 24 hr, and a quantitative approach involving surrogate markers of a viable cell number. The assay is relatively easy to perform, is highly responsive to known VEGFR-2 ligands and can accommodate extracellular inhibitors of VEGFR-2 signaling such as monoclonal antibodies to the receptor or ligands, and soluble ligand traps.

We describe a simple cell-based bioassay for detecting, quantifying and monitoring the activity of members of the vascular endothelial growth factor family of ligands. The assay uses chimeric receptors expressed in a factor-dependent cell line to provide a semi-quantitative or quantitative assessment of receptor binding and cross-linking by the ligand.

Un saggio biologico semplice per la valutazione dei fattori di crescita dell&#39;endotelio vascolare

The analysis of receptor tyrosine kinases and their interacting ligands involved in vascular biology is often challenging due to the constitutive ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes within individual endothelial cells (ECs). These processes are critical for homeostatic maintenance such as wound healing, and are also crucial in promoting tumor growth and metastasis. EC morphology is defined by the organization of the cytoskeleton, a tightly regulated system of actin and microtubule (MT) dynamics that is known to control EC branching, polarity and directional migration, essential components of angiogenesis. To study MT dynamics, we used high-resolution fluorescence microscopy coupled with computational image analysis of fluorescently-labeled MT plus-ends to investigate MT growth dynamics and the regulation of EC branching morphology and directional migration. Time-lapse imaging of living Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) was performed following transfection with fluorescently-labeled MT End Binding protein 3 (EB3) and Mitotic Centromere Associated Kinesin (MCAK)-specific cDNA constructs to evaluate effects on MT dynamics. PlusTipTracker software was used to track EB3-labeled MT plus ends in order to measure MT growth speeds and MT growth lifetimes in time-lapse images. This methodology allows for the study of MT dynamics and the identification of how localized regulation of MT dynamics within sub-cellular regions contributes to the angiogenic processes of EC branching and migration.

Protocols for Human Umbilical Vein Endothelial Cell (HUVEC) culture, transient transfection of fluorescently-labeled markers of microtubule growth, live-cell imaging and automated analysis of interphase microtubule growth dynamics are detailed.

Ad alta risoluzione Time-lapse imaging e analisi automatizzata dei microtubuli Dynamics in Living ombelicale umano cellule endoteliali Vena

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

The Assembly and Application of 'Shear Rings': A Novel Endothelial Model for Orbital, Unidirectional and Periodic Fluid Flow and Shear Stress

Deviations from normal levels and patterns of vascular fluid shear play important roles in vascular physiology and pathophysiology by inducing adaptive as well as pathological changes in endothelial phenotype and gene expression. In particular, maladaptive effects of periodic, unidirectional flow induced shear stress can trigger a variety of effects on several vascular cell types, particularly endothelial cells. While by now endothelial cells from diverse anatomic origins have been cultured, in-depth analyses of their responses to fluid shear have been hampered by the relative complexity of shear models (e.g., parallel plate flow chamber, cone and plate flow model). While these all represent excellent approaches, such models are technically complicated and suffer from drawbacks including relatively lengthy and complex setup time, low surface areas, requirements for pumps and pressurization often requiring sealants and gaskets, creating challenges to both maintenance of sterility and an inability to run multiple experiments. However, if higher throughput models of flow and shear were available, greater progress on vascular endothelial shear responses, particularly periodic shear research at the molecular level, might be more rapidly advanced. Here, we describe the construction and use of shear rings: a novel, simple-to-assemble, and inexpensive tissue culture model with a relatively large surface area that easily allows for a high number of experimental replicates in unidirectional, periodic shear stress studies on endothelial cells.

The Assembly and Application of &#039;Shear Rings&#039;: A Novel Endothelial Model for Orbital, Unidirectional and Periodic Fluid Flow and Shear Stress

Different levels and patterns of fluid shear are known to modulate endothelial gene expression, phenotype and susceptibility to disease. We discuss the assembly and use of 'shear rings': a model that produces unidirectional, periodic shear stress patterns. Shear rings are simple to assemble, economical and can produce high cell yields.

L&#39;Assemblea e l&#39;applicazione di &quot;Shear Anelli &#39;: A Novel endoteliale modello per Orbital, unidirezionale e periodica del fluido di flusso e lo stress di taglio

Deviations from normal levels and patterns of vascular fluid shear play important roles in vascular physiology and pathophysiology by inducing adaptive as ...

Mass Spectrometry Analysis to Identify Ubiquitylation of EYFP-tagged CENP-A (EYFP-CENP-A)

Studying the structure and the dynamics of kinetochores and centromeres is important in understanding chromosomal instability (CIN) and cancer progression. How the chromosomal location and function of a centromere (i.e., centromere identity) are determined and participate in accurate chromosome segregation is a fundamental question. CENP-A is proposed to be the non-DNA indicator (epigenetic mark) of centromere identity, and CENP-A ubiquitylation is required for CENP-A deposition at the centromere, inherited through dimerization between cell division, and indispensable to cell viability.
Here we describe mass spectrometry analysis to identify ubiquitylation of EYFP-CENP-A K124R mutant suggesting that ubiquitylation at a different lysine is induced because of the EYFP tagging in the CENP-A K124R mutant protein. Lysine 306 (K306) ubiquitylation in EYFP-CENP-A K124R was successfully identified, which corresponds to lysine 56 (K56) in CENP-A through mass spectrometry analysis. A caveat is discussed in the use of GFP/EYFP or the tagging of high molecular weight protein as a tool to analyze the function of a protein. Current technical limit is also discussed for the detection of ubiquitylated bands, identification of site-specific ubiquitylation(s), and visualization of ubiquitylation in living cells or a specific single cell during the whole cell cycle.
The method of mass spectrometry analysis presented here can be applied to human CENP-A protein with different tags and other centromere-kinetochore proteins. These combinatory methods consisting of several assays/analyses could be recommended for researchers who are interested in identifying functional roles of ubiquitylation.

Mass Spectrometry Analysis to Identify Ubiquitylation of EYFP-tagged CENP-A EYFP-CENP-A

CENP-A ubiquitylation is an important requirement for CENP-A deposition at the centromere, inherited through dimerization between cell division, and indispensable to cell viability. Here we describe mass spectrometry analysis to identify ubiquitylation of EYFP-tagged CENP-A (EYFP-CENP-A) protein.