This work was supported by National Institutes of Health (National Institute of Neurological Disorders and Stroke) Grant 1R01NS060757-01 and by the E.L. Lindseth endowed chair to Dominique M. Durand. We thank Dr. Andrew M. Rollins&#8217; laboratory for the help on the OCT imaging.

NOTA: Animal protocolos experimentales fueron revisados ​​y aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales institucional de la universidad. Ratones CD1 de cualquier sexo a la edad de P10 a P20 se utilizan en este estudio. 1. Soluciones de Cirugía Experimental y grabación <ol><li> Preparar tampón normal de líquido cefalorraquídeo artificial (LCRa) que contiene (mM): NaCl 124, KCl 3,75, KH 2 PO 4 1,25, MgSO 4 2, NaHCO3 26, dextrosa 10, y CaCl 2 2. Utilice esta LCRa normal para la recuperación del tejido después de la disección, así como para el sistema de lavado al comienzo del experimento. </li><li> Preparar LCRa sacarosa que se utiliza durante la disección hipocampo y contiene (mM): Sacarosa 220, KCl 2,95, NaH 2 PO 4 1,3, MgSO4 2, NaHCO3 26, dextrosa 10, y CaCl 2 2. Con el fin de inducir la actividad epileptiforme en la preparación intacta tejido del hipocampo, añadir 4-aminopiridina (4-AP) a LCRa normal ala concentración de 100 mM. </li></ol> 2. Procedimiento quirúrgico para la Intacto Preparación Hippocampus <ol><li> Caiga isoflurano (1 ml) a la cámara en el fondo de un frasco de vidrio desecador (No.1 en Materiales y Equipos Específicos) y use una toalla de papel ordinario para cubrir la superficie de la etapa de fondo para que el animal no se interpone en contacto con el líquido. Luego, coloque el ratón CD1 en el frasco y cierre la tapa. Mantenga el animal en el frasco cerrado durante aproximadamente 1 min a 2 min. Cuando la frecuencia de la respiración es de aproximadamente uno por segundo, quite el ratón de la jarra. </li><li> Coloque el ratón en el escenario de la cirugía y decapitar con unas tijeras adecuadas. Inmediatamente después de la decapitación, coloque la cabeza en la enfriado con hielo (3-4 ° C), LCRa sacarosa oxigenada durante aproximadamente 30 seg. </li><li> Con unas tijeras finas (No.5 en Materiales y Equipos Específicos) para eliminar la piel en la parte superior del cráneo y de cortar el cráneo a lo largo de la línea media de la cabeza, así como en los dos extremos cercanos al tempolóbulo ral. Use pinzas (No. 6 en Materiales y Equipos Específicos) para pelar el cráneo corte hacia cada lado de la cabeza con el fin de exponer el cerebro. </li><li> Inserte una espátula de laboratorio micro (No. 8 en Materiales y Equipos Específicos) en el espacio entre los lóbulos parietales del cerebro y el cráneo de pelar cuidadosamente el cerebro desde la parte inferior del cráneo y luego colóquelo en un helado preparado (3 -4 ° C) fase quirúrgica cubierta con papel filtro húmedo (No.2 en Materiales y equipos específicos). Retire el cerebelo con una hoja enfriada con hielo y separar los dos hemisferios mediante la reducción de la línea media del cerebro. Luego, coloque los dos hemisferios separados en un vaso de precipitados lleno con el LCRa sacarosa enfriado con hielo burbujeado con 95% de O2 / 5% de CO 2. </li><li> Tome la mitad del hemisferio y el lugar en el escenario de papel de filtro helada. Coloque toallas de papel normal o papel de filtro alrededor del cerebro para aspirar la solución extra. Utilice dos herramientas de pipeta de vidrio pulido al fuego (No. 10 en Materiales yEquipo) para separar la corteza del resto de la parte central del cerebro. </li><li> Después de que el hipocampo se expone desde el interior de la corteza y se puso la etapa de enfriado en hielo, colocar dos o tres gotas de helado sacarosa LCRa sobre el tejido y luego eliminar la solución adicional alrededor del hipocampo. Cortar las conexiones con la corteza en los dos extremos del hipocampo. Entonces, diseccionar el hipocampo de cerebro con las herramientas de vidrio pulidas al fuego y retirar la parte restante del cerebro. </li><li> Separe todo el hipocampo con el lado de alveus y surco del hipocampo hacia abajo. Caen rápidamente dos o tres gotas de helado sacarosa LCRa sobre el tejido de nuevo y eliminar la solución adicional alrededor del tejido usando un trozo de toalla de papel. Utilice una herramienta de vidrio pulida al fuego a entregar todo el hipocampo para exponer el surco (Figura 1B, C). </li><li> Bajo el microscopio óptico normal, insertar una aguja de vidrio hecho a medida (Nº 11 en específico MateriALS y Equipo) en un extremo del surco y cortar las conexiones de fibra, de giro dentado (DG) para subiculum o el campo CA1, a lo largo de la dirección del surco (Figura 1C). Aplicar una hoja helada para recortar los extremos del tabique y temporales del hipocampo si es necesario. Inserte un asa de alambre de metal por encargo (No. 12 en Materiales y Equipos Específicos) en el surco de corte y tire sobre la DG lejos del tejido mientras sujeta el extremo subiculum / CA1 del hipocampo mediante una herramienta de vidrio pulido fuego (Figura 1D) . </li><li> Siguiendo el procedimiento de despliegue anteriormente, añadir otros dos o tres gotas de la sacarosa LCRa enfriado con hielo sobre el tejido y eliminar la solución adicional alrededor del tejido. A continuación, recortar el hipocampo desplegada con la hoja enfriada con hielo en los bordes (Figura 1E) y coloque la preparación por una espátula en la cámara de recuperación de llenado con LCRa normal y burbujeado con 95% de O2 / 5% de CO 2 a RT (alrededor 25 ° C). Dejarel tejido hipocampo desplegada para recuperar aproximadamente 1 hr antes de colocarlo en la cámara de grabación. </li><li> Tome el otro hemisferio del cerebro y lo utilizan para ir a través de los pasos 2,5 a 2,9. Por lo general, tomar alrededor de 1 a 2 min para terminar todo el procedimiento para desplegar una sola hipocampo y gota fría con hielo sacarosa LCRa continuamente para mantener el tejido oxigenada e hidratada. </li></ol> Configuración 3. Sistema Experimental <ol><li> Pegue un PMEA fabricado a medida en un paquete de pin grid array (PGA) y utilizar micro unión de cables para conectar cada pad de un solo microelectrodos a la almohadilla de un alfiler en el envase (Figura 3B). Luego, inserte el paquete en la toma de una placa de circuito a medida 13. </li><li> Conectar individualmente cada microelectrodo a sus filtros de paso de banda con frecuencia de corte de 1 Hz a 4 KHz y amplificadores con ganancia de 100 en la placa de circuito por encargo 13. Digitalizar la salida analógica de la tarjeta de circuitos por un D conv / Asistema dosificando, y adquirir y almacenar los datos en un ordenador. </li><li> Pegar una cámara de registro de plástico o hechos a medida alrededor de la matriz con tubos de entrada y salida para el flujo de la solución (Figura 4A). Use por lo menos dos botellas para mantener diferentes soluciones en el sistema, y ​​unirse a y controlar el tubo de salida de las botellas por una válvula de tri. Conectar la salida de la válvula tri a un sistema de tubos con una cámara de goteo IV que está guiando la solución en la cámara de grabación. </li><li> Entre la válvula tri-y la entrada de la cámara de grabación, añadir un calentador eléctrico para calentar la solución a una temperatura controlada (35 ° C) antes de que la solución se guía a la cámara de grabación. Coloque la salida de la cámara de grabación para un tubo de vacío para recoger la solución en un matraz conectado tubo de vacío. No reciclar cualquier solución en cualquier experimento en este estudio. </li></ol> 4. Colocación del Desplegado Hippocampus en el PMEA para registrar la actividad neuronal </p&gt; <ol><li> Para preparar el montaje experimental, llenar una botella con LCRa normal y otra botella con 4-AP LCRa. En las dos botellas, burbuja 95% de O2 / 5% de CO 2 desde el comienzo de cada experimento. Utilice un conector tri-válvula para controlar qué solución será seleccionado durante un experimento. Conectar un tubo de vacío en la salida de la cámara para bombear la solución en un recipiente de polvo. Calentar la tubería antes de entregarlo a la cámara de grabación y mantener la solución a un nivel de temperatura controlada (35 ° C). </li><li> Cuando la entrada y salida de la cámara de grabación están cerradas, usar un gotero pipeta de vidrio por encargo para transferir y colocar el hipocampo desplegada en la cámara de grabación. Bajo el microscopio, posicionar el hipocampo desplegada con un cepillo pequeño regular de pintura mientras que el tejido está flotando en la solución. Coloque el hipocampo desplegada con el lado de alveus abajo, área CA3 apuntando en dirección opuesta, y el campo CA1 apuntando hacia el investigador. </li&gt; <li> Aspirar con cuidado la solución en la cámara utilizando una pipeta de vacío desde el borde de la cámara de grabación para bajar el nivel de la solución hasta que la cámara se seca y el tejido se hace descender sobre la matriz. Luego, coloque un anclaje de tejidos hecho a medida (Figura 4) (Nº 14 en Materiales y Equipos Específicos) en la parte superior del tejido para mantener el hipocampo desplegada sobre la matriz. Ponga unas gotas de solución en la cámara de registro para volver a llenarlo, y poco a poco abrir la entrada y la salida para ajustar la velocidad de flujo a aproximadamente dos gotas por segundo en la cámara de goteo IV. </li><li> Incubar el tejido en la cámara de registro con LCRa normal para alrededor de 1 min para recuperar, a continuación, conmutar el suministro de la solución de 4-AP LCRa disuelto y ajustar la velocidad de flujo correctamente. Incubar el tejido en 4-AP disuelto LCRa durante aproximadamente 5 a 10 minutos y luego el investigador podría iniciar el software para grabar la señal cuando aparece la actividad espontánea. </li></ol> 5. Extracción de laEl tejido de la PMEA Después de un experimento <ol><li> Controlar el anclaje de tejidos por un micromanipulador y levantar gradualmente el tejido de la cámara de registro. Apagar tanto de entrada y salida para detener el flujo en la cámara de grabación. La cámara de registro debe estar llena con solución o añadir unas gotas de solución para llenar la cámara si la cámara de grabación no está lleno. </li><li> Utilice un pincel pequeño levantar cada esquina del tejido. Si el tejido no está flotando en la solución, a continuación, emplear el tubo de vacío para secar la cámara cuidadosamente con el tejido todavía sentado en la matriz. A continuación, abra cuidadosamente la entrada para volver a llenar la cámara gradualmente y cerrar la entrada para detener el flujo cuando la cámara de grabación está lleno. Aplicar el pincel pequeño para levantar cada esquina del tejido de nuevo. </li><li> Repita el paso 5.2 hasta que el tejido se separa de la matriz y flotando en la solución. Si el tejido está flotando en la solución, a continuación, utilizar el tubo de vacío para aspirar el pañuelo. Abrir tque fluya en la entrada y abrir el vacío en la toma de corriente. Lave el sistema con agua destilada y secarlo. </li></ol>

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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high+aspect+ratio+microelectrode+array+for+mapping+neural+activity+in+vitro.">A high aspect ratio microelectrode array for mapping neural activity in vitro.</a> J Neurosci Methods. 204 (2), 296-305 (2012).</li><li>Schechter, L. 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The authors have nothing to disclose.

El desarrollo de la preparación hipocampo desplegada, donde los ejes longitudinales y transversales del hipocampo se conservan en combinación con una matriz de microelectrodos penetrante, proporciona una poderosa herramienta para investigar las conexiones anatomía o propagación neuronal en el hipocampo 7. Este procedimiento de despliegue es también aplicable para el estudio de hipocampo en ratones adultos. Estudios recientes con esta preparación mostraron que la actividad epileptiforme inducida-4-AP pod...

La comprensión de la conducción neural o la propagación de señales neuronales es crucial para la determinación del mecanismo de la comunicación neural tanto en la función normal y condiciones patológicas en el cerebro 1-3. El hipocampo es una de las estructuras más ampliamente estudiados en el cerebro, ya que juega papel fundamental en varias funciones cerebrales como la memoria, y el seguimiento espacial y participa en varios cambios patológicos que afectan drásticamente el comportamiento, así 1,6. Aunque, el hipocampo exhibe una organización compleja, los diferentes elementos de su estructura se pueden identificar y acceder en la preparación rebanada 4-6 fácilmente. En la dirección transversal del hipocampo, la actividad neural se conoce para propagar a través de la vía de tri-sináptica que comprenden el giro dentado (DG), CA3, CA1 andsubiculum 4,5. Se cree que la transmisión sináptica y la conducción axonal juegan un papel importante para communicatien este circuito transversal 4,6. Sin embargo, la propagación de la señal neural tiene lugar tanto en direcciones transversal y longitudinal 4,6. Esto implica que el hipocampo no puede ser completamente investigó mediante el uso de preparaciones rebanada que limitan la observación a una dirección de propagación particular 4. El corte longitudinal se desarrolló para investigar las vías axonales lo largo del eje longitudinal 5. Los investigadores han observado gamma y oscilaciones theta-conducta específica predominantemente a lo largo del ejes transversal y longitudinal respectivamente 6. Estos comportamientos se han estudiado por separado, pero el acceso simultáneo a las dos direcciones es crucial para entender estos comportamientos. Incluso con el desarrollo de la preparación hipocampo intacto, es difícil controlar la propagación a lo largo de todo el tejido debido a la estructura plegada de la hipocampo 4. El hipocampo desplegada proporciona acceso a las neuronas envasadosen una forma de un plano de dos dimensiones 7,8 capa de células. Desplegando el giro dentado (DG) (Figura 1), el hipocampo adopta una forma aplanada con una configuración rectangular en la que tanto transversal y conexiones longitudinales permanecen intactos con la capa de células piramidales dispuestos en una lámina bidimensional que contiene tanto CA3 y CA1, dejando una pieza plana de tejido neural que se puede utilizar para investigar la propagación neural (Figura 2) 8. La actividad neuronal puede entonces ser monitoreado con pipetas de vidrio individuales, arrays de microelectrodos, electrodos de estimulación, así como colorantes sensibles al voltaje (VSD) 3,7,8. Además, el indicador de tensión codificado genéticamente de ratones transgénicos se puede utilizar para rastrear el patrón de propagación 9. La configuración plana de la red del hipocampo desplegada es muy adecuado para la grabación método óptico sino también para una matriz de microelectrodos. Ma mayoría de las matrices disponibles en el mercado están fabricados con electrodos perfil plano o baja y puede registrar la actividad neuronal en los dos cortes de tejido y las neuronas cultivadas 10-12. Sin embargo, la relación señal-ruido (SNR) disminuye cuando las señales se obtienen de un tejido intacto desde el soma de las neuronas se encuentra más profunda en el tejido. Se requieren conjuntos de electrodos microelectrodos con altas relaciones de aspecto para mejorar la SNR. Para este efecto, una matriz de microelectrodos penetrante (PMEA) se ha desarrollado en nuestro laboratorio, y proporciona la capacidad para sondar directamente en el tejido mediante la inserción de espigas 64 con un diámetro de 20 micras y 200 micras de altura en el hipocampo desplegadas 7,13 . Esta matriz de microelectrodos tiene mayor SNR en comparación con la formación de imágenes colorante sensible al voltaje y la SNR se mantiene estable durante un experimento 7,13. La combinación de la preparación del hipocampo desplegada y la PMEA proporciona una nueva manera de invertirIgate la propagación neural sobre un plano de dos dimensiones. Los experimentos utilizando esta técnica ya han dado resultados significativos sobre los mecanismos de propagación de la señal neuronal en el hipocampo mediante el cual la actividad neuronal puede propagarse independientemente de las sinapsis sinápticas o eléctricos 7.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>desiccator jar</td>
			<td>LABRECYCLERS Inc.</td>
			<td>5410</td>
			<td>Place regular paper towels at the bottome of the jar for animal anesthesia use.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A blade and Custome made surgical stage for unfolding hippocampus</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>A petri dish is place upside down (in the center) in the ice with a wet filter paper place on top of it.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom made tissue recovery chamber</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Plastic tubes were glued with plastic mesh at the bottom and bubbled with 95% O2/ 5% CO2 in the aCSF.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight Operating&#160;Scissors</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S17336B&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; Medco Instruments No.:81995&#160;</td>
			<td>This scissors is used to&#160;&#160; decapitate the mice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Integra Miltex Goldman-Fox&#160;Scissors</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-460-517&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; MILTEX INC&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; No.:5-SC-320</td>
			<td>This scissors is used to cut the skull of the mice.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miltex 
			Hysterectomy Forceps</td>
			<td>Claflin Medical equipment</td>
			<td>CESS-722033-00001</td>
			<td>This Forceps is used to peel the cut skull to expose the brain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Spatula</td>
			<td>Cardinal Health</td>
			<td></td>
			<td>This micro spatula is used to tranfer the whole brain of a semisphere into the recorering chamber.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Frey Scientific Stainless Steel Semi-Micro Spatula</td>
			<td>Cardinal Health</td>
			<td></td>
			<td>this semi micro spatula is used to tranfer the unfolded hippocampus into the glucose aCSF in the recovering chamber.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>small paint brush</td>
			<td>Lowe&#39;s</td>
			<td>tem #:&#160;105657&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; Model #:&#160;90219</td>
			<td>The one with the smallest size in a normal paint brush package</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fire polished glass help tool</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>This tool was fire polished and made from the regular Pasteur glass pipettes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom made glass needle</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>This tool was fire polished and made from the regular Pasteur glass pipettes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom made glass tool with a metal wire loop</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>This tool was fire polished and made from the regular Pasteur glass pipettes with a reshaped metal wire loop.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom made glass solution dropper</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>This tool was&#160; made from the regular Pasteur glass pipettes with its tips cut and a rubber head attached with the cut end.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom made tissue anchor</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Nylon fiber mesh was glued on a insulated copper wire ring. The tissue anchor was hold by an micromanipulator.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom fabricated microelectrode array</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>More detail about the array please refer to&#160; Kibler, et al, 2011.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom made filter and amplifiers circuits for the array</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>More detail about the array please refer to&#160; Kibler, et al, 2011.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data acquisition processor 3400a</td>
			<td>Microstar Laboratories</td>
			<td>N/A</td>
			<td>This is a complete data acquisition system with A/D converter.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

neural activity propagation in an unfolded hippocampal preparation with a penetrating micro-electrode array

Este protocolo describe un método para preparar un nuevo en preparación hipocampo plana vitro combinado con una matriz de micro-mecanizado para mapear la actividad neuronal en el hipocampo. La preparación de cortes de hipocampo transversal es la preparación del tejido más común para estudiar la electrofisiología hipocampo. Una rebanada del hipocampo longitudinal también se desarrolló con el fin de investigar las conexiones longitudinales en el hipocampo. El hipocampo del ratón intactas también se pueden mantener in vitro debido a su grosor permite la difusión adecuada de oxígeno. Sin embargo, estas tres preparaciones no proporcionan acceso directo a la propagación de los nervios ya que algunos de los tejidos es falta o doblada. El hipocampo intacto desplegada proporciona tanto transversal y conexiones longitudinales en una configuración plana para el acceso directo al tejido para analizar la extensión completa de propagación de la señal en el hipocampo in vitro. Con el fin de controlar con eficacia la actividad neuronal de tque la capa de células, una costumbre hizo penetrar matriz de micro-electrodo (PMEA) se fabricó y se aplica al hipocampo desplegada. El PMEA con 64 electrodos de 200 m de altura podría registrar la actividad neuronal en el interior de el hipocampo del ratón. La combinación única de una preparación del hipocampo desplegada y la PMEA proporciona una nueva herramienta in-vitro para estudiar la velocidad y la dirección de propagación de la actividad neuronal en las dos dimensiones regiones CA1-CA3 del hipocampo con una elevada relación señal a ruido.

Los datos mostrados en las figuras aquí se registraron en la preparación hipocampo desplegada con 4-AP (100 mM) LCRa añadido durante la incubación del tejido en la cámara de registro a TA (25 ° C). Normalmente la actividad comienza a los 5 minutos, pero en algunos tejidos del hipocampo de los animales de más edad puede tomar más tiempo. El disparo neuronal inducida por 4-AP observada con el PMEA es el mismo que se informó anteriormente 14,15. Dado que los electrodos tienen una altura de 200 m, las pu...

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Neural Activity Propagation in an Unfolded Hippocampal Preparation with a Penetrating Micro-electrode Array

Hemos desarrollado un hipocampo desplegada in vitro que conserva CA1-CA3 variedad de neuronas. En combinación con la matriz de micro-electrodo de penetración, la actividad neural puede ser monitoreado en ambas las orientaciones longitudinales y transversales. Este método proporciona ventajas sobre las preparaciones de cortes de hipocampo como la propagación en todo el hipocampo se pueden grabar simultáneamente.

Actividad neural propagación en una preparación del hipocampo Desplegado con un penetrante Micro-electrodo de matriz

This protocol describes a method for preparing a new in vitro flat hippocampus preparation combined with a micro-machined array to map neural activity in ...

neural-activity-propagation-an-unfolded-hippocampal-preparation-with

Research

JoVE Journal

Neuroscience

8.3K vistas.  Case Western Reserve University.  Hemos desarrollado un hipocampo desplegada in vitro que conserva CA1-CA3 variedad de neuronas. En combinación con la matriz de micro-electrodo de penetración, la actividad neural puede ser monitoreado en ambas las orientaciones longitudinales y transversales. Este método proporciona ventajas sobre las preparaciones de cortes de hipocampo como la propagación en todo el hipocampo se pueden grabar simultáneamente. 

Video: Neural Activity Propagation in an Unfolded Hippocampal Preparation with a Penetrating Micro-electrode Array

Growth and Differentiation of Adult Hippocampal Arctic Ground Squirrel Neural Stem Cells

Arctic ground squirrels (Urocitellus parryii, AGS) are unique in their ability to hibernate with a core body temperature near or below freezing 1. These animals also resist ischemic injury to the brain in vivo 2,3 and oxygen-glucose deprivation in vitro 4,5. These unique qualities provided the impetus to isolate AGS neurons to examine inherent neuronal characteristics that could account for the capacity of AGS neurons to resist injury and cell death caused by ischemia and extremely cold temperatures. Identifying proteins or gene targets that allow for the distinctive properties of these cells could aid in the discovery of effective therapies for a number of ischemic indications and for the study of cold tolerance. Adult AGS hippocampus contains neural stem cells that continue to proliferate, allowing for easy expansion of these stem cells in culture. We describe here methods by which researchers can utilize these stem cells and differentiated neurons for any number of purposes. By closely following these steps the AGS neural stem cells can be expanded through two passages or more and then differentiated to a culture high in TUJ1-positive neurons (~50%) without utilizing toxic chemicals to minimize the number of dividing cells. Ischemia induces neurogenesis 6 and neurogenesis which proceeds via MEK/ERK and PI3K/Akt survival signaling pathways contributes to ischemia resistance in vivo7 and in vitro 8 (Kelleher-Anderson, Drew et al., in preparation). Further characterization of these unique neural cells can advance on many fronts, using some or all of these methods.

Neural stem cells were prepared from the hippocampus of adult non-hibernating yearling Arctic ground squirrels (AGS). These neural stem cells can be expanded through numerous passages, differentiated and maintained as a nearly 50:50 neuron to glial culture.

Crecimiento y diferenciación de las células del hipocampo adulto ardilla de tierra del Ártico troncales nerviosas

Arctic ground squirrels (Urocitellus parryii, AGS) are unique in their ability to hibernate with a core body temperature near or below freezing 1. These ...

Investigación

Neurociencias

Neural-Colony Forming Cell Assay: An Assay To Discriminate Bona Fide Neural Stem Cells from Neural Progenitor Cells

The neurosphere assay (NSA) is one of the most frequently used methods to isolate, expand and also calculate the frequency of neural stem cells (NSCs). Furthermore, this serum-free culture system has also been employed to expand stem cells and determine their frequency from a variety of tumors and normal tissues. It has been shown recently that a one-to-one relationship does not exist between neurosphere formation and NSCs. This suggests that the NSA as currently applied, overestimates the frequency of NSCs in a mixed population of neural precursor cells isolated from both the embryonic and adult mammalian brain. This video practically demonstrates a novel collagen based semi- solid assay, the neural-colony forming cell assay (N-CFCA), which has the ability to discriminate stem from progenitor cells based on their long-term proliferative potential, and thus provides a method to enumerate NSC frequency. In the N-CFCA, colonies &ge;2 mm in diameter are derived from cells that meet all the functional criteria of a NSC, while colonies &lt; 2mm are derived from progenitors. The N-CFCA procedure can be used for cells prepared from different sources including primary and cultured adult or embryonic mouse CNS cells. Here we use cells prepared from passage one neurospheres generated from embryonic day 14 mice brain to perform N-CFCA. The cultures are replenished with proliferation medium every seven days for three weeks to allow the plated cells to exhibit their full proliferative potential and then the frequency of neural progenitor and bona fide neural stem cells is calculated respectively by counting the number of colonies that are &lt; 2mm and the ones that are &ge;2mm in reference to the number of cells that were initially plated.

This video protocol demonstrates how to discriminate and enumerate bona fide neural stem cells in a mixed population of neural precursor cells using the neural colony-forming cell assay.

Neural formadoras de colonias ensayo de células: un ensayo para discriminar Bona Fide células troncales nerviosas de células progenitoras neurales

The neurosphere assay (NSA) is one of the most frequently used methods to isolate, expand and also calculate the frequency of neural stem cells (NSCs). ...

Preparation of an Awake Mouse for Recording Neural Responses and Injecting Tracers

It is well known that anesthesia alters neural response properties in various regions of the brain.13. In the auditory system, fundamental response properties of brainstem neurons including threshold, frequency specificity, and inhibitory sidebands are altered in significant ways under anesthesia1-2. These observations prompted physiologists to seek ways to record from single neurons without the contaminating effects of anesthesia. One result was a decerebrate preparation, where the brainstem was completely transected at the level of the midbrain4. The drawbacks of this preparation are a formidable surgery, the elimination of descending projections from the forebrain, and an inability to use sensory stimulation to examine structures above the midbrain. A different strategy has been to implant electrode arrays chronically to record from single neurons and multiunit clusters while the animal is awake and/or behaving5,6. These techniques however are not compatible with injecting tracer dyes after first electrophysiologically characterizing a brain structure. To avoid altering neural response properties with anesthetics while recording electrophysiological response properties from single neurons, we have adapted a head restraint technique long used in bats7-9 to mouse10-12. Using this method, we are able to conduct electrophysiological recordings over several days in the unanesthetized mouse. At the end of the recording sessions, we can then inject a dye to reconstruct electrode positions and recording sites or inject a tracer so that pathways to and from the recording loci can be determined. This method allows for well isolated single neuron recordings over multiple days without the use anesthetics.

Electrophysiological characterization of neuronal responses is important for understanding brain function and for guiding the placement of dyes for pathway tracing. However, many studies are performed in anesthetized animals. To understand brain function without anesthetics, we developed a method to record neuronal response properties and inject dyes in awake mouse.

Preparación de un ratón para la grabación de Despierta respuestas neuronales y de inyección de trazadores

It is well known that anesthesia alters neural response properties in various regions of the brain.13.  In the auditory system, fundamental response ...

Optical Recording of Suprathreshold Neural Activity with Single-cell and Single-spike Resolution

Signaling of information in the vertebrate central nervous system is often carried by populations of neurons rather than individual neurons. Also propagation of suprathreshold spiking activity involves populations of neurons. Empirical studies addressing cortical function directly thus require recordings from populations of neurons with high resolution. Here we describe an optical method and a deconvolution algorithm to record neural activity from up to 100 neurons with single-cell and single-spike resolution. This method relies on detection of the transient increases in intracellular somatic calcium concentration associated with suprathreshold electrical spikes (action potentials) in cortical neurons. High temporal resolution of the optical recordings is achieved by a fast random-access scanning technique using acousto-optical deflectors (AODs)1. Two-photon excitation of the calcium-sensitive dye results in high spatial resolution in opaque brain tissue2. Reconstruction of spikes from the fluorescence calcium recordings is achieved by a maximum-likelihood method. Simultaneous electrophysiological and optical recordings indicate that our method reliably detects spikes (&gt;97% spike detection efficiency), has a low rate of false positive spike detection (&lt; 0.003 spikes/sec), and a high temporal precision (about 3 msec) 3. This optical method of spike detection can be used to record neural activity in vitro and in anesthetized animals in vivo3,4.

Understanding the function of the vertebrate central nervous system requires recordings from many neurons because cortical function arises on the level of populations of neurons. Here we describe an optical method to record suprathreshold neural activity with single-cell and single-spike resolution, dithered random-access scanning. This method records somatic fluorescence calcium signals from up to 100 neurons with high temporal resolution. A maximum-likelihood algorithm deconvolves the underlying suprathreshold neural activity from the somatic fluorescence calcium signals. This method reliably detects spikes with high detection efficiency and a low rate of false positives and can be used to study neural populations in vitro and in vivo.

Grabación óptica de la actividad neural suprathreshold con la resolución de una sola célula y único punta-

Signaling of information in the vertebrate central nervous system is often carried by populations of neurons rather than individual neurons. Also ...

Multi-unit Recording Methods to Characterize Neural Activity in the Locust (Schistocerca Americana) Olfactory Circuits

Detection and interpretation of olfactory cues are critical for the survival of many organisms. Remarkably, species across phyla have strikingly similar olfactory systems suggesting that the biological approach to chemical sensing has been optimized over evolutionary time1. In the insect olfactory system, odorants are transduced by olfactory receptor neurons (ORN) in the antenna, which convert chemical stimuli into trains of action potentials. Sensory input from the ORNs is then relayed to the antennal lobe (AL; a structure analogous to the vertebrate olfactory bulb). In the AL, neural representations for odors take the form of spatiotemporal firing patterns distributed across ensembles of principal neurons (PNs; also referred to as projection neurons)2,3. The AL output is subsequently processed by Kenyon cells (KCs) in the downstream mushroom body (MB), a structure associated with olfactory memory and learning4,5. Here, we present electrophysiological recording techniques to monitor odor-evoked neural responses in these olfactory circuits.
First, we present a single sensillum recording method to study odor-evoked responses at the level of populations of ORNs6,7. We discuss the use of saline filled sharpened glass pipettes as electrodes to extracellularly monitor ORN responses. Next, we present a method to extracellularly monitor PN responses using a commercial 16-channel electrode3. A similar approach using a custom-made 8-channel twisted wire tetrode is demonstrated for Kenyon cell recordings8. We provide details of our experimental setup and present representative recording traces for each of these techniques.

Multi-unit Recording Methods to Characterize Neural Activity in the Locust Schistocerca Americana Olfactory Circuits

We demonstrate variations of the extracellular multi-unit recording technique to characterize odor-evoked responses in the first three stages of the invertebrate olfactory pathway. These techniques can easily be adapted to examine ensemble activity in other neural systems as well.

Varias unidades Métodos de grabación para caracterizar la actividad neuronal en el Locust (<em&gt; Schistocerca americana</em&gt;) Circuitos olfativas

Detection and interpretation of olfactory cues are critical for the survival  of many organisms. Remarkably, species across phyla have strikingly similar ...

Optogenetic Perturbation of Neural Activity with Laser Illumination in Semi-intact Drosophila Larvae in Motion

Drosophila larval locomotion is a splendid model system in developmental and physiological neuroscience, by virtue of the genetic accessibility of the underlying neuronal components in the circuits1-6. Application of optogenetics7,8 in the larval neural circuit allows us to manipulate neuronal activity in spatially and temporally patterned ways9-13. Typically, specimens are broadly illuminated with a mercury lamp or LED, so specificity of the target neurons is controlled by binary gene expression systems such as the Gal4-UAS system14,15. In this work, to improve the spatial resolution to "sub-genetic resolution", we locally illuminated a subset of neurons in the ventral nerve cord using lasers implemented in a conventional confocal microscope. While monitoring the motion of the body wall of the semi-intact larvae, we interactively activated or inhibited neural activity with channelrhodopsin16,17 or halorhodopsin18-20, respectively. By spatially and temporally restricted illumination of the neural tissue, we can manipulate the activity of specific neurons in the circuit at a specific phase of behavior. This method is useful for studying the relationship between the activities of a local neural assembly in the ventral nerve cord and the spatiotemporal pattern of motor output.

Optogenetic Perturbation of Neural Activity with Laser Illumination in Semi-intact Drosophila Larvae in Motion

Here we describe a protocol for optogenetic manipulation of motoneuronal activity while monitoring changes in motor output (muscle contraction) in semi-intact Drosophila larvae using lasers within a conventional confocal microscope. This technique enables researchers to achieve local perturbation of neural activity in a few neuromeres to elucidate the dynamics of motor circuits.

Optogenética perturbación de la actividad neuronal con la iluminación láser en semi-intacta<em&gt; Drosophila</em&gt; Las larvas in Motion

Drosophila larval locomotion is a splendid model system in developmental and physiological neuroscience, by virtue of the genetic accessibility of the ...

Immunohistochemical Visualization of Hippocampal Neuron Activity After Spatial Learning in a Mouse Model of Neurodevelopmental Disorders

Induction of phosphorylated extracellular-regulated kinase (pERK) is a reliable molecular readout of learning-dependent neuronal activation. Here, we describe a pERK immunohistochemistry protocol to study the profile of hippocampal neuron activation following exposure to a spatial learning task in a mouse model characterized by cognitive deficits of neurodevelopmental origin. Specifically, we used pERK immunostaining to study neuronal activation following Morris water maze (MWM, a classical hippocampal-dependent learning task) in Engrailed-2 knockout (En2-/-) mice, a model of autism spectrum disorders (ASD). As compared to wild-type (WT) controls, En2-/- mice showed significant spatial learning deficits in the MWM. After MWM, significant differences in the number of pERK-positive neurons were detected in specific hippocampal subfields of En2-/- mice, as compared to WT animals. Thus, our protocol can robustly detect differences in pERK-positive neurons associated to hippocampal-dependent learning impairment in a mouse model of ASD. More generally, our protocol can be applied to investigate the profile of hippocampal neuron activation in both genetic or pharmacological mouse models characterized by cognitive deficits.

We describe an immunohistochemistry protocol to study the profile of hippocampal neuron activation following exposure to a spatial learning task in a mouse model characterized by cognitive deficits of neurodevelopmental origin. This protocol can be applied to both genetic or pharmacological mouse models characterized by cognitive deficits.

Visualización inmunohistoquímico de hipocampo Neurona Actividad Después espacial aprendizaje en un modelo de ratón de los trastornos del desarrollo neurológico

Induction of phosphorylated extracellular-regulated kinase (pERK) is a reliable molecular readout of learning-dependent neuronal activation. Here, we ...

Interfacing 3D Engineered Neuronal Cultures to Micro-Electrode Arrays: An Innovative In Vitro Experimental Model

Currently, large-scale networks derived from dissociated neurons growing and developing in vitro on extracellular micro-transducer devices are the gold-standard experimental model to study basic neurophysiological mechanisms involved in the formation and maintenance of neuronal cell assemblies. However, in vitro studies have been limited to the recording of the electrophysiological activity generated by bi-dimensional (2D) neural networks. Nonetheless, given the intricate relationship between structure and dynamics, a significant improvement is necessary to investigate the formation and the developing dynamics of three-dimensional (3D) networks. In this work, a novel experimental platform in which 3D hippocampal or cortical networks are coupled to planar Micro-Electrode Arrays (MEAs) is presented. 3D networks are realized by seeding neurons in a scaffold constituted of glass microbeads (30-40 &#181;m in diameter) on which neurons are able to grow and form complex interconnected 3D assemblies. In this way, it is possible to design engineered 3D networks made up of 5-8 layers with an expected final cell density. The increasing complexity in the morphological organization of the 3D assembly induces an enhancement of the electrophysiological patterns displayed by this type of networks. Compared with the standard 2D networks, where highly stereotyped bursting activity emerges, the 3D structure alters the bursting activity in terms of duration and frequency, as well as it allows observation of more random spiking activity. In this sense, the developed 3D model more closely resembles in vivo neural networks.

Interfacing 3D Engineered Neuronal Cultures to Micro-Electrode Arrays: An Innovative In Vitro Experimental Model

In this work, a novel experimental model in which 3D neuronal cultures are coupled to planar Micro-Electrode Arrays (MEAs) is presented. 3D networks are built by seeding neurons in a scaffold made up of glass microbeads on which neurons grow and form interconnected 3D structures.

Interfaz culturas 3D Engineered neuronales a micro-electrodos matrices: un innovador<em&gt; In Vitro</em&gt; Modelo Experimental

Currently, large-scale networks derived from dissociated neurons growing and developing in vitro on extracellular micro-transducer devices are the ...

Direct-current Stimulation and Multi-electrode Array Recording of Seizure-like Activity in Mice Brain Slice Preparation

Cathodal transcranial direct-current stimulation (tDCS) induces suppressive effects on drug-resistant seizures. To perform effective actions, the stimulation parameters (e.g., orientation, field strength, and stimulation duration) need to be examined in mice brain slice preparations. Testing and arranging the orientation of the electrode relative to the position of the mice brain slice are feasible. The present method preserves the thalamocingulate pathway to evaluate the effect of DCS on anterior cingulate cortex seizure-like activities. The results of the multichannel array recordings indicated that cathodal DCS significantly decreased the amplitude of the stimulation-evoked responses and duration of 4-aminopyridine and bicuculline-induced seizure-like activity. This study also found that cathodal DCS applications at 15 min caused long-term depression in the thalamocingulate pathway. The present study investigates the effects of DCS on thalamocingulate synaptic plasticity and acute seizure-like activities. The current procedure can test the optimal stimulation parameters including orientation, field strength, and stimulation duration in an in vitro mouse model. Also, the method can evaluate the effects of DCS on cortical seizure-like activities at both the cellular and network levels.

Studies have shown that cathodal transcranial direct-current stimulation can produce suppressive effects on drug-resistant seizures. In this study, an in vitro experimental setup was devised in which the direct-current stimulation and multielectrode array recording of seizure-like activity were evaluated in mice brain slice preparation. The direct-current stimulation parameters were evaluated.

La estimulación de corriente directa y multi-electrodo matriz de registro de la actividad convulsiva en ratones cerebro rebanada preparación

Cathodal transcranial direct-current stimulation (tDCS) induces suppressive effects on drug-resistant seizures. To perform effective actions, the ...

Extracellular Recording of Neuronal Activity Combined with Microiontophoretic Application of Neuroactive Substances in Awake Mice

Differences in the activity of neurotransmitters and neuromodulators, and consequently different neural responses, can be found between anesthetized and awake animals. Therefore, methods allowing the manipulation of synaptic systems in awake animals are required in order to determine the contribution of synaptic inputs to neuronal processing unaffected by anesthetics. Here, we present methodology for the construction of electrodes to simultaneously record extracellular neural activity and release multiple neuroactive substances at the vicinity of the recording sites in awake mice. By combining these procedures, we performed microiontophoretic injections of gabazine to selectively block GABAA receptors in neurons of the inferior colliculus of head-restrained mice. Gabazine successfully modified neural response properties such as the frequency response area and stimulus-specific adaptation. Thus, we demonstrate that our methods are suitable for recording single-unit activity and for dissecting the role of specific neurotransmitter receptors in auditory processing.
The main limitation of the described procedure is the relatively short recording time (~3 hr), which is determined by the level of habituation of the animal to the recording sessions. On the other hand, multiple recording sessions can be performed in the same animal. The advantage of this technique over other experimental procedures used to manipulate the level of neurotransmission or neuromodulation (such as systemic injections or the use of optogenetic models), is that the drug effect is confined to the local synaptic inputs to the target neuron. In addition, the custom-manufacture of electrodes allows adjustment of specific parameters according to the neural structure and type of neuron of interest (such as the tip resistance for improving the signal-to-noise ratio of the recordings).

We present methods for the construction of electrodes to simultaneously record extracellular neural activity and release multiple neuroactive substances at the vicinity of the recording sites in awake mice. This technique allows the detailed analysis of putative local synaptic inputs to the neuron of interest.

Extracelular de grabación de la actividad neuronal junto con la aplicación de sustancias Microiontophoretic neuroactivos en ratones Awake

Differences in the activity of neurotransmitters and neuromodulators, and consequently different neural responses, can be found between anesthetized and ...