Nuestro protocolo ayudará a responder el impacto que las interacciones de las células inmunes tienen en la funcionalidad de los islotes. El método de corte de tejido pancreático vivo permite estudiar la fisiología y la función de los islotes mientras se mantienen las patologías subyacentes de los tejidos y el microambiente nativo. Este método podría proporcionar información sobre los procesos de enfermedad de las enfermedades pancreáticas, como la pancreatitis, la diabetes tipo I y la diabetes tipo II.
Para comenzar, coloque los bloques en el soporte de la muestra de tal manera que no excedan el ancho de la cuchilla, asegurando que la cuchilla pueda avanzar la menor distancia posible cuando el vibratome se mueva lentamente. Aplique una línea de súper pegamento en el soporte de la muestra, haciendo una capa delgada usando el extremo del dispensador de pegamento, luego voltee los bloques de tejido sobre el pegamento para que el lado cercano al tejido mire hacia arriba. Empuje suavemente hacia abajo los bloques y deje que el pegamento se seque durante tres minutos.
A continuación, conecte la placa al vibratomo con un tornillo y ajuste la altura de la cuchilla y la distancia que se recorre para que la cuchilla se mueva a lo largo de los bloques y apenas por encima de ellos. Empuje suavemente los bloques con las pinzas para verificar que el pegamento se haya secado y luego llene la bandeja de vibratomo con una solución extracelular refrigerada hasta que la cuchilla esté cubierta. Coloque el vibratome para hacer rebanadas de 120 micrómetros de espesor y comience, luego observe las rodajas que salen de los bloques de tejido.
Levante las rodajas cuando floten fuera del bloque colocando un pincel o fórceps debajo de ellas y coloque las rodajas en tampón de bicarbonato Krebs-Ringer que contenga tres milimolares inhibidores de D-glucosa y tripsina. Coloque las placas que contienen las rodajas en un balancín e incube a temperatura ambiente durante una hora a 25 RPM. Si las rebanadas deben mantenerse durante más tiempo, coloque las rebanadas en 15 mililitros de medio de cultivo de rebanadas y coloque la placa en una incubadora.
Incube las rebanadas preparadas a 37 grados Celsius para estudios el mismo día o transfiera las rebanadas que se cultivan a 24 grados Celsius durante la noche a 37 grados Celsius durante al menos una hora antes del experimento. Encienda el microscopio al menos una hora antes de la grabación y equilibre la incubadora superior del escenario a 37 grados centígrados. Asegure la placa de Petri con fondo de vidrio de la cubierta que contiene la rebanada en el escenario.
Enfoque el microscopio estableciendo el objetivo 10X en el modo de campo brillante y localice los islotes utilizando el modo de campo brillante buscando óvalos de color marrón anaranjado dentro de la rebanada. Cambie el microscopio a imágenes confocales presionando el botón CS en el controlador de pantalla táctil del microscopio. Para ver los islotes utilizando la reflectancia, encienda el detector láser 638 y el detector PMT.
Ajuste la potencia del láser entre uno y 2% y apague los filtros de muesca. Utilice el láser de 405 nanómetros y el detector PMT para observar la mancha de ácido nucleico. El detector híbrido para la detección de anticuerpos CD8 y el detector láser e híbrido de 488 nanómetros para ver el tetrámero de insulina.
Centra el islote de interés en el campo de visión utilizando las perillas X e Y del controlador de escenario. Una vez que se encuentra un islote de interés, cambie al objetivo 20X y amplíe para que el islote ocupe la mayor parte del marco. Tome una pila Z del islote, luego encuentre las mejores secciones ópticas donde las células están vivas y las células inmunes circundantes están enfocadas.
Configure el microscopio para que grabe en modo XYZT y optimice la configuración para registrar una pila z de los pasos seleccionados cada 20 minutos durante un período de varias horas. Los islotes en una rebanada de tejido pancreático se visualizaron mediante microscopía de campo brillante y luz reflejada. La insulina en los islotes aumenta la granularidad y provoca la absorción de grandes cantidades de luz reflejada, aumentando la visibilidad de los islotes.
La viabilidad de una rebanada de tejido pancreático humano vivo se evaluó mediante tinción. Las células vivas están indicadas en verde y las células muertas en azul. Otro indicador positivo de viabilidad es la actividad basal observable.
Cuando una rebanada pancreática viva se cargó con un indicador de calcio permeable a las células, se observó estimulación de la glucosa en las rebanadas pancreáticas de ratón y humano. También se cuantificó la fluorescencia de células individuales durante la estimulación de la glucosa. Se observaron islotes intactos y enfermos mediante tinción de ditizona y microscopía de luz reflejada.
Los islotes enfermos comienzan a perder granularidad debido a la infiltración de células inmunes y la muerte celular. Las poblaciones de células inmunes se pueden identificar utilizando anticuerpos CD8 y tinción de tetrámeros de insulina. La tinción conjunta indica que las células son células T efectoras que se dirigen específicamente al antígeno de insulina.
Lo más importante a recordar en este procedimiento es mantener las rebanadas en soluciones inhibidores de la proteasa en todo momento. Después de este procedimiento, se pueden realizar numerosas funciones en experimentos con células inmunes que permiten estudiar el efecto de las interacciones de las células inmunes y la función de los islotes.
