Este trabajo fue apoyado por becas de los NIH (DC007681, AB), CT donación de células madre (AB), Pardee base (AB), Ruth L. Kirschstein Predoctoral Nacional del Servicio de Investigación Premios (NRSA) (Szy), y una investigación NSF Graduate Fellowship (BL). Agradecemos a los miembros del laboratorio Bordey por sus valiosos comentarios sobre el manuscrito. El presente material está basado en trabajo apoyado en parte por el Estado de Connecticut bajo el Stem Cell Research Connecticut Programa de Subvenciones. Su contenido es de exclusiva responsabilidad de sus autores y no representan necesariamente la opinión oficial del Estado de Connecticut, el Departamento de Salud Pública del Estado de Connecticut CT o Innovations, Incorporated.

1. Preparación de las soluciones, disección y Vibratome <ol><li> Las soluciones deben ser preparados en la osmolaridad y el pH correcto (Tabla 1). En comparación con fluido cerebroespinal artificial (ACSF), solución de disección se prepara con concentraciones menores de sodio y calcio, y mayores concentraciones de magnesio. Esto es para minimizar los efectos de excitotoxicidad durante el rebanado. </li><li> Ambas soluciones de disección y ACSF debe ser saturado con 95% O 2/5% CO 2 mediante burbujeo durante al menos 10 min para alcanzar el pH deseado de 7,3. </li><li> Preparar un baño de hielo en una bandeja. Colocar una placa de disección en el baño de hielo y llene con la solución de disección. Burbuja de la placa de disección. </li><li> Preparar la vibratome mediante la creación de un baño de hielo. Colocar el plato de seccionamiento en el baño de hielo, llenar el recipiente con solución de disección, y la burbuja. </li><li> Llene la cámara de retención con rodaja ACSF y burbuja para asegurar que la solución está adecuadamente aireados sinde donde se colocan las rebanadas. </li></ol> 2. La eliminación del tejido cerebral Rebanadas cerebrales agudos tienden a ser más saludables con ratones más jóvenes. La arquitectura celular SVZ postnatal en los roedores es madura alrededor del día postnatal (P) 20 1. Por lo tanto, tratamos de limitar los experimentos a las edades de ratón de P20-P30, pero hemos realizado experimentos con éxito en ratones tan antiguas como 3 meses. A lo largo de la manipulación del tejido, uno debe tener en cuenta para minimizar los movimientos mecánicos y la presión en el cerebro, mantener condiciones refrigeradas, y exponer la SVZ de solución lo más rápidamente posible sacrificio siguiente. <ol><li> Después de la inyección de pentobarbital, el ratón se decapitaron rápidamente. La piel se retira y las incisiones se realizan a través de la base del cráneo. La cabeza se coloca entonces en una bandeja llena con solución de disección. </li><li> Si bien la estabilización de la cabeza con unas pinzas, cortes continuos se realizan en todo el cráneo y en ocasiones hasta la línea media con microscissors. Tener cuidado para minimizar el contacto con el tejido. Desde el bulbo olfativo es el destino final de las neuronas recién nacidas de la SVZ, uno debe ser consciente de la preservación de esa región, especialmente en la eliminación de hueso alrededor de esta área. Microscissor cortes realizados alrededor del cráneo debe estar en el lado dorsal, para permitir una fácil retirada del cráneo. </li><li> La eliminación del cráneo que cubre el cerebro ahora está separado de los huesos debajo del cerebro. Si los recortes en el paso anterior se hizo correctamente, este hueso suprayacente se puede quitar fácilmente con unas pinzas o fórceps. </li><li> Mientras sostiene la cabeza con fórceps, se puede utilizar una cuchilla quirúrgica para eliminar limpiamente varias piezas de tejido cerebral antes de rebanar, tales como las siguientes. Un corte coronal se pueden hacer en el nivel de lambda. Cortes sagitales se puede hacer en ambos lados del cerebro lateral a la SVZ. Una estimación conservadora sería de aproximadamente 2,5 mm de la línea media. Si se desea, el cerebro también puede hemiseccionaron aquí. Estos recortes tanto facilitar montaje del tejido y permitir que la SVZ a ser alcanzado más rápidamente cuando el cerebro de rebanar. Es importante recordar que debe ejercer la mínima cantidad de fuerzas mecánicas en el cerebro (por ejemplo, no empuje o tracción). </li></ol> 3. Cerebral agudo Preparación Slice <ol><li> Para prepararse para etapas posteriores, asegurarse de que el pegamento utilizado para montar el tejido está libre de obstrucciones y listo para aplicar a la placa de vibratome. Es importante ir tan rápido como sea posible sin dañar el cerebro. </li><li> El tejido cerebral puede entonces ser recogidos de debajo, que separa el tejido del hueso subyacente al mismo tiempo que separa los nervios. </li><li> El tejido se monta y se pega sobre una placa y se coloca en la vibratome. Debido a la anatomía rostral caudal de la SVZ, nos hemos centrado en hacer cortes sagitales ya que preserva la vía migratoria de los neuroblastos, la vaina glial, y la vasculatura que se alinea en gran parte en esta dirección. Uno puede cualquier moUNT el tejido en la línea media o en la superficie plana creada mediante cortes sagitales laterales de la SVZ. Una etapa opcional es colocar un 3% de agarosa bloque detrás del tejido para servir como un tope para la cuchilla como las rodajas se desprenda. Hemos utilizado preferentemente a base de cianoacrilato pegamento. </li><li> Enjuague la hoja con etanol para eliminar los aceites y enjuague con agua destilada. Coloque la cuchilla en el soporte de la cuchilla. Montar el soporte de la cuchilla a la vibratome. </li><li> Ajustar la configuración de vibratome para cortar el tejido con un espesor de 250-350 micras por rebanada. Es importante cortar con vibraciones de alta frecuencia y baja velocidad. </li><li> Sección progresivamente a través del tejido. La aparición del bulbo olfatorio es un buen indicador de que uno está cerca de la SVZ en cortes sagitales como las rodajas más laterales contendrán ni región. Otras señales a tener en cuenta incluyen el ventrículo y el engrosamiento del cuerpo calloso, debajo del cual se encuentra la SVZ. El SVZ aparecerá por primera vez en más Sagit lateralrodajas de Tal. El RMS se mostrará en rebanadas sagital medial. </li><li> Retire rebanadas contienen la SVZ con una pipeta Pasteur de plástico con la punta cortada. Transferencia a la cámara de retención con slice. A menudo obtener más cortes que podemos utilizar en un día de trabajo. Sin embargo, las rebanadas pueden variar en la cantidad de células que contienen la SVZ. A veces es necesario mirar a través de varias rebanadas de encontrar uno deseada para la imagen. </li></ol> 4. Preparación del microscopio y colorantes Las rodajas requieren un tiempo de incubación de una hora en ACSF para recuperarse de la disección y rebanar. Varios pasos se pueden realizar durante este período de recuperación rebanada. <ol><li> Preparación de las pipetas para el tinte de calcio y / o la aplicación del fármaco <ol class="lalpha"><li> Pipetas de vidrio debe tener una punta de 2-3 micras de diámetro y una longitud de la punta (~ 2 mm) y el ángulo (~ 16 ° para el soporte de pipetas) que evita el contacto con la cámara de perfusión y permite espacio para la colocación deel objetivo. </li><li> Uno puede preparar típicamente 6-8 pipetas de presión para cada día de experimentos. </li></ol></li><li> Calcio preparación de tinte <ol class="lalpha"><li> Al preparar la solución de trabajo (4-5 mM de baño, 250 mu M por aplicación de presión), lo mejor es exponer la cantidad mínima de DMSO a las células. Esto se puede lograr haciendo que las poblaciones altamente concentradas. Por ejemplo, para Fluo-4, un tubo que contiene 50 g se utiliza por día. Uno puede hacer un stock de 10 mM de esta alícuota mediante la adición de 4,6 l de solución de Pluronic F-127 20% en DMSO. </li></ol></li><li> Preparación de configuración microscopio (Figura 2). <ol class="lalpha"><li> El uso de una bomba peristáltica para el flujo de solución ha ayudado a minimizar la deriva de imagen. Ejecutar la bomba peristáltica antes de permitir ACSF para funcionar a través de las líneas de perfusión y asegurarse de que está libre de burbujas. </li><li> Ajuste el tubo de entrada en la cámara de perfusión y asegurar que no haya fugas. </li><li> Coloque la punta de vacío para ensure que la solución está siendo aspirado de la cámara de perfusión. Asegúrese de que esté en un nivel adecuado de modo que el objetivo se sumerge en la distancia de trabajo, pero no tan alta como solución que pueden derramarse sobre la cámara. Un bajo nivel de solución también minimizar las distorsiones de flujo. Una aspiración constante también puede ser verificado por la escucha de estabilidad. </li></ol></li></ol> 5. Colorante de carga Este método ha sido descrito en detalle en otro manuscrito 2. Por favor, vea las figuras en el mismo. <ol><li> Baño de colorante de carga <ol class="lalpha"><li> Hacer una solución de 1-2 ml de trabajo del colorante. Para Fluo-4 AM, una concentración de 4-5 mu M es adecuado para el etiquetado de neuroblastos SVZ. </li><li> Los sectores se transfiere primero a una placa de cultivo de 35 mm con un fondo de malla que ya está llena con ACSF. Reemplazar la solución mediante el uso de una pipeta de plástico de 3 ml de transferencia para eliminar suavemente la ACSF, mientras que la adición simultánea de la calcium tinte de solución de trabajo. </li><li> Incubar a 37 ° C durante 30-60 min en un 5% de CO 2 gas ambiente controlado. </li><li> Coloque la rebanada de nuevo en la cámara de ACSF lleno de celebración para lavar tinte que no ha entrado en las células. Alternativamente, se puede colocar directamente en la cámara de perfusión microscopio que ejecuta ACSF. Este período de lavado es 30-45 min. </li><li> Transferir la porción de la cámara de perfusión. </li></ol></li><li> Presión de aplicación de tinte <ol class="lalpha"><li> Transferir la rebanada de la cámara de retención de la cámara de perfusión de la configuración del microscopio. </li><li> Llenar una pipeta de vidrio con una solución de trabajo que es de 250 mM y el lugar en el micromanipulador. </li><li> Bajar la pipeta a la región de interés. La pipeta puede ser colocado de tal manera que la punta es o bien varios micrómetros por encima de la superficie de loncha o enterrados varios micrómetros por debajo de la superficie de loncha, pero lejos de la región grabada. El ángulo de la pipeta no Affect la eficiencia de carga. Cuando la imagen por debajo de la superficie de loncha, encontramos que la colocación de la punta de la pipeta por debajo del plano de la imagen se etiqueta nuestra área deseada formación de imágenes mejor. </li><li> Cuando la presión de aplicar el tinte, establecer el Picospritzer modo que es &lt;3 psi. No hemos estimado el volumen de difusión de tinte, porque esto está sujeto a variabilidad del diámetro de la punta de la pipeta, la presión aplicada, y la densidad del tejido en el que se inyecta el medio de contraste. Aplicamos simplemente hasta que logremos nuestra carga deseada según la evaluación de los ojos. Minimizar el daño a la rebanada durante la aplicación, especialmente cuando la punta se coloca debajo de la superficie de la rebanada. Aplicar durante 1-2 minutos. Aplicaciones repetidas veces sean necesarias en función de etiquetado según la evaluación de los ojos. Por esta duración concentración y aplicación, se encuentra que la aplicación superficial de colorante preferentemente etiqueta neuroblastos mientras que por debajo de la superficie de aplicación preferentemente etiquetas de astrocitos. Sin embargo,&gt; 3 min a aplicación 500 mM también se etiqueta neuroblastosindependientemente de si la punta está por encima o por debajo de la superficie de loncha (JC Platel, observación no publicada). Deje para el lavado y la recuperación rebanada durante 30-45 min. </li></ol></li></ol> 6. Confocal de imágenes de la actividad del calcio <ol><li> Encontrar la región de interés primero con un objetivo de baja potencia tales como 4x o 10x. Colocar en el centro del campo antes de cambiar a un objetivo de potencia mayor. En este punto, se puede evaluar la salud general de rebanada observando la aparición de células SVZ bajo contraste de interferencia diferencial (DIC). Las células sanas aparecen redonda y regordeta. Además, las células sanas se mostrará débil Fluo-4 de carga como se supone que no hay carga en todo o fluorescencia brillante (una célula que muere). </li><li> Bajar el objetivo de inmersión en agua en la región de interés, que es ahora cargadas con colorante. Ya sea un objetivo de 40x o 60x ha sido adecuada para nuestras necesidades, aunque 40x proporciona un campo de visión más amplio y permite el acceso pipeta mayor. Cuando la imagen por debajo de lasuperficie, que a menudo van de un mínimo de 15 micras por debajo de la superficie donde están mejor tajada de la arquitectura en 3 dimensiones y salud de las células preservadas. </li><li> Verifique que la perfusión y de vacío están trabajando adecuadamente. </li><li> Configure el microscopio para que la resolución de lapso de tiempo y la resolución espacial se establecen en las tasas deseadas. Para la microscopía confocal, estos factores deben equilibrarse como un aumento de la resolución temporal generalmente resulta en una pérdida de resolución espacial debido a la naturaleza de escaneo del sistema. Para la actividad del calcio, que han captado un marco aproximadamente cada segundo con una resolución de 512x512 píxeles. Si varios canales adquiridos por separado son necesarios, esto también afectará a las tasas de adquisición. Establecer la duración de la película (2-10 min). </li><li> Iniciar correr. Si la realización de estudios farmacológicos, lavar en antagonistas o agonistas no desensibilizantes durante al menos 5-10 minutos, y luego hacer otra película de 5-10 min. Los agonistas que pueden desensibilizar los receptores pueden ser extremadamente aplicado, tal como mediante el uso de un prEssure pipeta controlada por un micromanipulador. </li></ol> 7. Análisis Calcio El análisis sigue los procedimientos estándar que hemos descrito en las publicaciones permeables 2-4. F 0 (línea de base, es decir) y F son las intensidades medias de fluorescencia que se mide a través de todas las regiones de interés (ROIs) y en cada ROI, respectivamente. Un cambio en la fluorescencia se considera que un aumento de Ca 2 + si era&gt; 15% F / F 0 aumento. Intracelular de Ca 2 + Los cambios se calcularon utilizando Calsignal 5. 8. Los resultados representativos Hemos sido capaces de obtener carga selectiva de células SVZ en función de los protocolos de carga de colorante descritos anteriormente y en otros lugares 2-4,6. Baño de carga o aplicación de presión sobre la superficie rebanada de Fluo-4 AM (05.04 ó 250 micras, respectivamente) las etiquetas en su mayoría neuroblastos. Si bien la aplicación de presión puede cargar neurobdura más rápidamente que la carga baño en una sola rebanada, carga baño permite la carga simultánea de varios sectores. Se confirma la identidad de las células marcadas como neuroblasts por (1) si presentan un comportamiento migratorio 4,7, (2) su morfología, (3) la tinción negativa de sulforrodamina 101, un colorante específico de astrocitos 3 o (4) con tinción positiva DCX-DsRed expresión (JC Platel, observación no publicada). Los neuroblastos migrar rápidamente (media de 60 micras / hr) a temperatura fisiológica 4,7-9, pero su movimiento puede ser observada fácilmente incluso a temperatura ambiente. El movimiento de los neuroblastos no plantea un problema con respecto a la colocación de regiones de interés (ROI) para rastrear la actividad del calcio ya que nuestras películas son por lo general de corta duración. Sin embargo, durante largos períodos de espera, como por ejemplo durante los intercambios solución de fármaco, los investigadores deben tener cuidado para que coincida con ROIs en el control y períodos de tratamiento. No es raro que los neuroblastos a migrar dentro o fuera de la i<html> maging campo o plano focal. Aplicación de presión de Fluo-4 AM (250 micras) de profundidad en el corte y la duración limitada (&lt;2 min) preferentemente etiqueta astrocitos SVZ 2. Etiquetado astrocito ha sido verificada por etiquetado positivo con sulforrodamina 101 y su morfología, especialmente por la presencia de proyecciones y endfeet sobre los vasos sanguíneos que hemos descrito recientemente 3. Usando estos métodos, hemos observado la actividad espontánea en tanto la neuroblast SVZ y población de astrocitos (Figura 1). La actividad en los astrocitos a menudo toma la forma de ondas que se dedican a 3 de los vasos sanguíneos. Además, el uso de imágenes de calcio como un ensayo, la aplicación de agonistas farmacológicos ha revelado o confirmado la expresión de los receptores GABA A en neuroblastos y astrocitos 6, AMPA y NMDA receptores en neuroblastos 4. Figuras 1 &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/4071/4071fig1.jpg &quot;/&gt; Figura 1. Propagación de la actividad del calcio en los astrocitos. (A) Representante promedio imagen de una grabación de lapso de tiempo de actividad del calcio. Los astrocitos en la SVZ se cargaron con aplicación de presión de Fluo-4 AM deep en la rebanada. Películas fueron adquiridas en 0,75 s pasos de tiempo. Las regiones de interés (ROI) se colocan sobre las células que muestran actividad. (B) Restos de ROIs coloca sobre las células de la película se muestra en (A). Las huellas se filtraron con un promedio móvil y normalizado. La escala vertical representa 2 x Df / F 0 donde F es la intensidad de la señal y F 0 es la señal de línea base media y Df = 0 FF. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/4071/4071fig2.jpg" /> Figura 2. Fotografía del sistema de perfusión. Un extremo de un tubo se sumerge en 95% de O 2/5% CO 2 gas p-erfused solución. La solución después se perfundió a través del tubo y de la cámara de baño por una bomba peristáltica (no se muestra). El otro extremo se inserta en la entrada de la solución de la cámara de baño montado sobre una plataforma. La punta de aspiración se conecta entonces a la salida de disolución de la cámara y se fija a un nivel para determinar la altura solución. Desde la salida, la punta de aspiración está conectada a la línea de vacío, que aspira la solución de la cámara en un contenedor de residuos. El sistema de perfusión se muestra fuera de la platina del microscopio para mayor claridad visual.

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No hay conflictos de interés declarado.

Imágenes de calcio de células SVZ se ha utilizado para estudiar los patrones de actividad espontánea en neuroblastos 10, la expresión del receptor de canal en ambos neuroblastos y astrocitos 4,6,8 y ondas astrocíticos calcio 3. Dado que las células en la SVZ son o bien inmaduros o que tienen propiedades gliales, no se activan los potenciales de acción 11,12, lo que significa que los cambios en el potencial de voltaje de milisegundos indicativos de la actividad en las re...

<table border="1"><tbody><tr><td> Soluto </td><td> Empresa </td><td> Número de Catálogo </td><td> Disección (mM) </td></tr><tr><td> Sacarosa </td><td> Sigma </td><td> S0389 </td><td> Disección: 147 mM ACSF: 0 mm </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Sigma </td><td> S9888 </td><td> Disección: 42 mM ACSF: 126 mM </td></tr><tr><td> KCl </td><td> Sigma </td><td> P3911 </td><td> Disección: 2,5 mM ACSF: 2,5 mM </td></tr><tr><td> MgCl 2 .6 H 2 O </td><td> Sigma </td><td> M9272 </td><td> Disección: 4,33 mM ACSF: 1 mM </td></tr><tr><td> NaH 2 PO 4. H 2 O </td><td> Sigma </td><td> S8282 </td><td> Disección: 1,25 mM ACSF: 1,25 mM </td></tr><tr><td> Glucosa </td><td> Sigma </td><td> G8270 </td><td> Dissección: 10 mM ACSF: 10 mM </td></tr><tr><td> NaHCO 3 </td><td> Sigma </td><td> S6014 </td><td> Disección: 26 mM ACSF: 26 mM </td></tr><tr><td> De CaCl 2 .2 H 2 O </td><td> Sigma </td><td> C3306 </td><td> Disección: 1,33 mM ACSF: 2 mM </td></tr></tbody></table> Tabla 1. Química lista y recetas de solución de disección y ACSF. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td> [Encabezado] </td></tr><tr><td> Nombre </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> Vibratome </td><td> Leica </td><td> VT 1000S </td><td></td></tr><tr><td> Super Glue </td><td> Surehold o 3M </td><td> Surehold 3G Super Glue o 3M Vet-Bond </td><td></td></tr><tr><td> Herramientas de disección </td><td> Roboz o Ted Pella </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Fluo-4 a.m. sensible al calcio, colorante </td><td> Invitrogen </td><td> F14201 </td><td></td></tr><tr><td> Oregon Green BAPTA-1 AM colorante sensible al calcio </td><td> Invitrogen </td><td> O6807 </td><td></td></tr><tr><td> Pluronic F-127 20% de solución en DMSO </td><td> Invitrogen </td><td> P3000MP </td><td></td></tr><tr><td> Microscopio confocal vertical </td><td> Olimpo </td><td> FV300 o FV1000 </td><td></td></tr><tr><td> Inmersión en agua objetivos </td><td> Olimpo </td><td> LUMPlanFl 40 x W / IR (NA 0,80); LUMPlanFl 60 x W / I (NA 0,90) </td><td></td></tr><tr><td> Micromanipuladores </td><td> Sutter </td><td> MPC-200/MPC-325/MPC-385 </td><td></td></tr><tr><td> Presión &lt;controlador/ Td&gt; <td> Parker Hannifin </td><td> Picospritzer </td><td> &lt;3 PSI durante la aplicación </td></tr><tr><td> Pipetear extractor </td><td> Sutter o Narshige </td><td> Sutter P-97, o Narshige PP-830 </td><td></td></tr><tr><td> Pipetas de vidrio </td><td> Sutter </td><td> BF150-110-10 </td><td> ID: 1.10, OD: 1,50 </td></tr><tr><td> Bomba peristáltica </td><td> Harvard Apparatus </td><td> Modelo 720 </td><td> velocidad de flujo: 1 ml / min </td></tr><tr><td> Cámara de baño </td><td> Warner Instruments </td><td> RC-26 GLP </td><td> De bajo perfil permite un aclaramiento objetivo </td></tr><tr><td> Tubería </td><td> Tygon </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Controlador de temperatura </td><td> Warner Instruments </td><td> TC-324B/344B </td><td></td></tr></tbody></table> Tabla 2. Materiales / lista de equipo.

preparation of acute subventricular zone slices for calcium imaging

La zona subventricular (SVZ) es una de las dos zonas neurogénica en el cerebro postnatal. El SVZ contiene células densamente empaquetados, incluyendo las células progenitoras neuronales con características astrocytic (llamadas astrocitos SVZ), neuroblastos y células progenitoras intermedios. Neuroblastos nacidos en la SVZ tangencialmente emigrar a una gran distancia hasta el bulbo olfatorio, donde se diferencian en interneuronas. La señalización intercelular a través de moléculas de adhesión y señales difusibles juegan papeles importantes en la neurogénesis de control. Muchas de estas señales de desencadenar la actividad del calcio intercelular que transmite la información dentro y entre las células. La actividad del calcio es por lo tanto un reflejo de la actividad de señales extracelulares y es una forma óptima de comprender la señalización intercelular entre las células funcionales SVZ. Actividad calcio ha sido estudiado en muchas otras regiones y tipos de células, incluyendo los astrocitos y neuronas maduras. Sin embargo, el método tradicional para loacélulas D con tinte indicador de calcio (es decir, la carga baño) no fue eficaz en la carga de todos los tipos de células SVZ. En efecto, la densidad celular en la SVZ se opone a la difusión del colorante en el interior del tejido. Además, la preparación de cortes sagitales mejor preservará la disposición tridimensional de las células SVZ, en particular la secuencia de la migración de neuroblastos en el eje rostral caudal. A continuación, se describen métodos para preparar las secciones sagitales que contienen la SVZ, la carga de las células SVZ con tinte indicador de calcio, y la adquisición de la actividad del calcio con películas de time-lapse. Se utilizó Fluo-4 a.m. colorante para la carga de los astrocitos SVZ utilizando la aplicación de presión en el interior del tejido. La actividad del calcio fue grabado usando un microscopio confocal de barrido que permite una resolución precisa para distinguir las células individuales. Nuestro enfoque es aplicable a otras zonas neurogénicas incluyendo el hipocampo adulto zona subgranular y embrionarias zonas neurogénicos. Además, otros tipos de tintes puedeaplicarse utilizando el método descrito.

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Preparation of Acute Subventricular Zone Slices for Calcium Imaging

Un método para cargar subventricular (SVZ de zona) células con colorantes indicadores de calcio para el registro de la actividad de calcio se describe. El postnatal SVZ contiene células apretadas, incluyendo las células progenitoras neurales y neuroblastos. En lugar de utilizar carga baño se inyecta el medio de contraste por la presión en el interior del tejido que permite una mejor difusión de tinte.

Preparación de agudos Slices zona subventricular for Imaging Calcio

The subventricular zone (SVZ) is one of the two neurogenic zones in the postnatal brain. The SVZ contains densely packed cells, including neural ...

preparation-of-acute-subventricular-zone-slices-for-calcium-imaging

Research

JoVE Journal

Neuroscience

13.1K vistas.  Yale University School of Medicine. Un método para cargar subventricular (SVZ de zona) células con colorantes indicadores de calcio para el registro de la actividad de calcio se describe. El postnatal SVZ contiene células apretadas, incluyendo las células progenitoras neurales y neuroblastos. En lugar de utilizar carga baño se inyecta el medio de contraste por la presión en el interior del tejido que permite una mejor difusión de tinte.

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The Subventricular Zone En-face: Wholemount Staining and Ependymal Flow

The walls of the lateral ventricles contain the largest germinal region in the adult mammalian brain. The subventricular zone (SVZ) in these walls is an extensively studied model system for understanding the behavior of neural stem cells and the regulation of adult neurogenesis. Traditionally, these studies have relied on classical sectioning techniques for histological analysis. Here we present an alternative approach, the wholemount technique, which provides a comprehensive, en-face view of this germinal region. Compared to sections, wholemounts preserve the complete cytoarchitecture and cellular relationships within the SVZ. This approach has recently revealed that the adult neural stem cells, or type B1 cells, are part of a mixed neuroepithelium with differentiated ependymal cells lining the lateral ventricles. In addition, this approach has been used to study the planar polarization of ependymal cells and the cerebrospinal fluid flow they generate in the ventricle. With recent evidence that adult neural stem cells are a heterogeneous population that is regionally specified, the wholemount approach will likely be an essential tool for understanding the organization and parcellation of this stem cell niche.

The lateral ventricle walls contain the largest germinal region in the adult mammalian brain. Traditionally, studies on neurogenesis in this region have relied on classical sectioning techniques for histological analysis. Here we present an alternative approach, the wholemount technique, which provides a comprehensive, en-face view of this germinal region.

En la zona subventricular cara: tinción wholemount y flujo ependimarios

The walls of the lateral ventricles contain the largest germinal region in the adult mammalian brain. The subventricular zone (SVZ) in these walls is an ...

Investigación

Neurociencias

Neonatal Subventricular Zone Electroporation

Neural stem cells (NSCs) line the postnatal lateral ventricles and give rise to multiple cell types which include neurons, astrocytes, and ependymal cells1. Understanding the molecular pathways responsible for NSC self-renewal, commitment, and differentiation is critical for harnessing their unique potential to repair the brain and better understand central nervous system disorders. Previous methods for the manipulation of mammalian systems required the time consuming and expensive endeavor of genetic engineering at the whole animal level2. Thus, the vast majority of studies have explored the functions of NSC molecules in vitro or in invertebrates.
Here, we demonstrate the simple and rapid technique to manipulate neonatal NPCs that is referred to as neonatal subventricular zone (SVZ) electroporation. Similar techniques were developed a decade ago to study embryonic NSCs and have aided studies on cortical development3,4 . More recently this was applied to study the postnatal rodent forebrain5-7. This technique results in robust labeling of SVZ NSCs and their progeny. Thus, postnatal SVZ electroporation provides a cost and time effective alternative for mammalian NSC genetic engineering.

We demonstrate a minimally invasive technique referred to as neonatal subventricular zone electroporation. The technique consists of injecting plasmid DNA into the lateral ventricles of neonatal pups and applying electrical current to deliver and genetically manipulate neural stem cells

La electroporación neonatal zona subventricular

Neural stem cells (NSCs) line the postnatal lateral ventricles and give rise to multiple cell types which include neurons, astrocytes, and ependymal ...

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

The subventricular zone (SVZ) is one of the main neurogenic niches in the postnatal brain. Here, neural progenitors proliferate and give rise to neuroblasts able to move along the rostral migratory stream (RMS) towards the olfactory bulb (OB). This long-distance migration is required for the subsequent maturation of newborn neurons in the OB, but the molecular mechanisms regulating this process are still unclear. Investigating the signaling pathways controlling neuroblast motility may not only help understand a fundamental step in neurogenesis, but also have therapeutic regenerative potential, given the ability of these neuroblasts to target brain sites affected by injury, stroke, or degeneration.
In this manuscript we describe a detailed protocol for in vivo postnatal electroporation and subsequent time-lapse imaging of neuroblast migration in the mouse RMS. Postnatal electroporation can efficiently transfect SVZ progenitor cells, which in turn generate neuroblasts migrating along the RMS. Using confocal spinning disk time-lapse microscopy on acute brain slice cultures, neuroblast migration can be monitored in an environment closely resembling the in vivo condition. Moreover, neuroblast motility can be tracked and quantitatively analyzed. As an example, we describe how to use in vivo postnatal electroporation of a GFP-expressing plasmid to label and visualize neuroblasts migrating along the RMS. Electroporation of shRNA or CRE recombinase-expressing plasmids in conditional knockout mice employing the LoxP system can also be used to target genes of interest. Pharmacological manipulation of acute brain slice cultures can be performed to investigate the role of different signaling molecules in neuroblast migration. By coupling in vivo electroporation with time-lapse imaging, we hope to understand the molecular mechanisms controlling neuroblast motility and contribute to the development of novel approaches to promote brain repair.

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

Neuroblast migration is a fundamental event in postnatal neurogenesis. We describe a protocol for efficient labeling of neuroblasts by in vivo postnatal electroporation and subsequent visualization of their migration using time-lapse imaging of acute brain slices. We include a description for the quantitative analysis of neuroblast dynamics by video tracking.

In vivo Postnatal electroporación y time-lapse de Neuroblast Migración en rodajas de cerebro de ratón aguda

The subventricular zone (SVZ) is one of the main neurogenic niches in the postnatal brain. Here, neural progenitors proliferate and give rise to ...

Cell Sorting of Neural Stem and Progenitor Cells from the Adult Mouse Subventricular Zone and Live-imaging of their Cell Cycle Dynamics

Neural stem cells (NSCs) in the subventricular zone of the lateral ventricles (SVZ) sustain olfactory neurogenesis throughout life in the mammalian brain. They successively generate transit amplifying cells (TACs) and neuroblasts that differentiate into neurons once they integrate the olfactory bulbs. Emerging fluorescent activated cell sorting (FACS) techniques have allowed the isolation of NSCs as well as their progeny and have started to shed light on gene regulatory networks in adult neurogenic niches. We report here a cell sorting technique that allows to follow and distinguish the cell cycle dynamics of the above-mentioned cell populations from the adult SVZ with a LeX/EGFR/CD24 triple staining. Isolated cells are then plated as adherent cells to explore in details their cell cycle progression by time-lapse video microscopy. To this end, we use transgenic Fluorescence Ubiquitination Cell Cycle Indicator (FUCCI) mice in which cells are red-fluorescent during G1 phase due to a G1 specific red-Cdt1 reporter. This method has recently revealed that proliferating NSCs progressively lengthen their G1 phase during aging, leading to neurogenesis impairment. This method is easily transposable to other systems and could be of great interest for the study of the cell cycle dynamics of brain cells in the context of brain pathologies.

We report a Fluorescent Activated Cell Sorting (FACS)-based method to isolate neural stem cells (NSCs) and their progeny from the subventricular zone (SVZ) of the adult mouse brain. Applied to Fluorescence Ubiquitination Cell Cycle Indicator (FUCCI) transgenic mice, it allows the study of cell cycle progression by live imaging.

Clasificación celular del Neuronales madre y progenitoras Las células del adulto Ratón zona subventricular y Live-imágenes de sus Dinámica del Ciclo Celular

Neural stem cells (NSCs) in the subventricular zone of the lateral ventricles (SVZ) sustain olfactory neurogenesis throughout life in the mammalian brain. ...

Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method

This protocol is a practical guide to the N-methyl-D-glucamine (NMDG) protective recovery method of brain slice preparation. Numerous recent studies have validated the utility of this method for enhancing neuronal preservation and overall brain slice viability. The implementation of this technique by early adopters has facilitated detailed investigations into brain function using diverse experimental applications and spanning a wide range of animal ages, brain regions, and cell types. Steps are outlined for carrying out the protective recovery brain slice technique using an optimized NMDG artificial cerebrospinal fluid (aCSF) media formulation and enhanced procedure to reliably obtain healthy brain slices for patch clamp electrophysiology. With this updated approach, a substantial improvement is observed in the speed and reliability of gigaohm seal formation during targeted patch clamp recording experiments while maintaining excellent neuronal preservation, thereby facilitating challenging experimental applications. Representative results are provided from multi-neuron patch clamp recording experiments to assay synaptic connectivity in neocortical brain slices prepared from young adult transgenic mice and mature adult human neurosurgical specimens. Furthermore, the optimized NMDG protective recovery method of brain slicing is compatible with both juvenile and adult animals, thus resolving a limitation of the original methodology. In summary, a single media formulation and brain slicing procedure can be implemented across various species and ages to achieve excellent viability and tissue preservation.

Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method

This protocol demonstrates the implementation of an optimized N-methyl-D-glucamine (NMDG) protective recovery method of brain slice preparation. A single media formulation is used to reliably obtain healthy brain slices from animals of any age and for diverse experimental applications.

Preparación de rebanadas cerebrales agudas mediante un optimizado N-metil-D-glucamine recuperación protección método

This protocol is a practical guide to the N-methyl-D-glucamine (NMDG) protective recovery method of brain slice preparation. Numerous recent studies have ...

Prolonged Incubation of Acute Neuronal Tissue for Electrophysiology and Calcium-imaging

Acute neuronal tissue preparations, brain slices and retinal wholemount, can usually only be maintained for 6 - 8 h following dissection. This limits the experimental time, and increases the number of animals that are utilized per study. This limitation specifically impacts protocols such as calcium imaging that require prolonged pre-incubation with bath-applied dyes. Exponential bacterial growth within 3 - 4 h after slicing is tightly correlated with a decrease in tissue health. This study describes a method for&#160;limiting the proliferation of bacteria in acute preparations to maintain viable neuronal tissue for prolonged periods of time (&#62;24 h) without the need for antibiotics, sterile procedures, or tissue culture media containing growth factors. By cycling the extracellular fluid through UV irradiation and keeping the tissue in a custom holding chamber at 15 - 16 &#176;C, the tissue shows no difference in electrophysiological properties, or calcium signaling through intracellular calcium dyes at &#62;24 h postdissection. These methods will not only extend experimental time for those using acute neuronal tissue, but will reduce the number of animals required to complete experimental goals, and will set a gold standard for acute neuronal tissue incubation.

Once removed from the body, neuronal tissue is greatly affected by environmental conditions, leading to eventual degradation of the tissue after 6 - 8 h. Using a unique incubation method, which closely monitors and regulates the extracellular environment of the tissue, tissue viability can be significantly extended for &#62;24 h.

La incubación prolongado de aguda neuronal de tejidos para la Sección de Electrofisiología y calcio de imágenes

Acute neuronal tissue preparations, brain slices and retinal wholemount, can usually only be maintained for 6 - 8 h following dissection. This limits the ...

Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ fluctuations can occur through a variety of membrane and intracellular mechanisms and play a crucial role in the induction of synaptic plasticity and regulation of dendritic excitability. Hence, the ability to record different types of Ca2+ signals in dendritic branches is valuable for groups studying how dendrites integrate information. The advent of two-photon microscopy has made such studies significantly easier by solving the problems inherent to imaging in live tissue, such as light scattering and photodamage. Moreover, through combination of conventional electrophysiological techniques with two-photon Ca2+ imaging, it is possible to investigate local Ca2+ fluctuations in neuronal dendrites in parallel with recordings of synaptic activity in soma. Here, we describe how to use this method to study the dynamics of local Ca2+ transients (CaTs) in dendrites of GABAergic inhibitory interneurons. The method can be also applied to studying dendritic Ca2+ signaling in different neuronal types in acute brain slices.

We present a method combining whole-cell patch-clamp recordings and two-photon imaging to record Ca2+ transients in neuronal dendrites in acute brain slices.

Proyección de imagen de calcio de dos fotones en las dendritas neuronales en rebanadas de cerebro

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ ...

Preparation of Acute Spinal Cord Slices for Whole-cell Patch-clamp Recording in Substantia Gelatinosa Neurons

Recent whole-cell patch-clamp studies from substantia gelatinosa (SG) neurons have provided a large body of information about the spinal mechanisms underlying sensory transmission, nociceptive regulation, and chronic pain or itch development. Implementations of electrophysiological recordings together with morphological studies based on the utility of acute spinal cord slices have further improved our understanding of neuronal properties and the composition of local circuitry in SG. Here, we present a detailed and practical guide for the preparation of spinal cord slices and show representative whole-cell recording and morphological results. This protocol permits ideal neuronal preservation and can mimic in vivo conditions to a certain extent. In summary, the ability to obtain an in vitro preparation of spinal cord slices enables stable current- and voltage-clamp recordings and could thus facilitate detailed investigations into the intrinsic membrane properties, local circuitry and neuronal structure using diverse experimental approaches.

Here, we describe the essential steps for whole-cell patch-clamp recordings made from substantia gelatinosa (SG) neurons in the in vitro spinal cord slice. This method allows the intrinsic membrane properties, synaptic transmission and morphological characterization of SG neurons to be studied.

Preparación de láminas agudas de la médula espinal para celulares Patch-clamp de grabación en las neuronas de la sustancia Gelatinosa

Recent whole-cell patch-clamp studies from substantia gelatinosa (SG) neurons have provided a large body of information about the spinal mechanisms ...

Preparation of Acute Human Hippocampal Slices for Electrophysiological Recordings

Epilepsy affects about 1% of the world population and leads to a severe decrease in quality of life due to ongoing seizures as well as high risk for sudden death. Despite an abundance of available treatment options, about 30% of patients are drug-resistant. Several novel therapeutics have been developed using animal models, though the rate of drug-resistant patients remains unaltered. One of probable reasons is the lack of translation between rodent models and humans, such as a weak representation of human pharmacoresistance in animal models. Resected human brain tissue as a preclinical evaluation tool has the advantage to bridge this translational gap. Described here is a method for high quality preparation of human hippocampal brain slices and subsequent stable induction of epileptiform activity. The protocol describes the induction of burst activity during application of 8 mM KCl and 4-aminopyridin. This activity is sensitive to established AED lacosamide or novel antiepileptic candidates, such as dimethylethanolamine (DMEA). In addition, the method describes induction of seizure-like events in CA1 of human hippocampal brain slices by reduction of extracellular Mg2+ and application of bicuculline, a GABAA receptor blocker. The experimental set-up can be used to screen potential antiepileptic substances for their effects on epileptiform activity. Furthermore, mechanisms of action postulated for specific compounds can be validated using this approach in human tissue (e.g., using patch-clamp recordings). To conclude, investigation of vital human brain tissue ex vivo (here, resected hippocampus from patients suffering from temporal lobe epilepsy) will improve the current knowledge of physiological and pathological mechanisms in the human brain.

The presented protocol describes the transport and preparation of resected human hippocampal tissue with the ultimate goal to use vital brain slices as a preclinical evaluation tool for potential antiepileptic substances.

Preparación de rebanadas agudas de hipocampo humano para grabaciones electrofisiológicas

Epilepsy affects about 1% of the world population and leads to a severe decrease in quality of life due to ongoing seizures as well as high risk for ...

<meta charset="utf8"></head><body>Nucleofección eficiente de NSCs aisladas de la zona subventricular murina

Isolation, Expansion, and Nucleofection of Neural Stem Cells from Adult Murine Subventricular Zone

Isolation and expansion of neural stem cells (NSCs) from the subventricular zone (SVZ) of the adult mouse brain can be achieved in a medium supplemented with basic fibroblast growth factor (bFGF) and epidermal growth factor (EGF) as mitogens, producing clonal aggregates known as neurospheres. This in vitro system is a valuable tool for studying NSC potential. Transfection of siRNAs or genes carried in plasmids can be used to induce perturbations to gene expression and study NSC biology. However, the exogenous nucleic acid delivery to NSC cultures is challenging due to the low efficiency of central nervous system (CNS) cells transfection. Here, we present an improved nucleofection system that achieves high efficiency of gene delivery in expanded NSCs from adult murine SVZ. We demonstrate that this relatively simple method enhances gene perturbation in adult NSCs, surpassing traditional transfection protocols with survival rates exceeding 80%. Moreover, this method can also be applied in primary isolated NSCs, providing a crucial advancement in gene function studies through gene expression manipulation via knockdown or overexpression in neurosphere cultures.

<meta charset="utf8"></head><body>Autor destacado: Nucleofección mejorada para la entrega de genes de alta eficiencia en cultivos de células madre neurales derivadas de la zona subventricular murin

Here, we describe a nucleofection system designed to enhance gene delivery efficiency in expanded neural stem cells (NSCs) isolated from the adult murine subventricular zone. The findings demonstrate that this method significantly improves gene perturbation in NSCs, surpassing the effectiveness of traditional transfection protocols and enhancing cell survival rate.

Aislamiento, expansión y nucleofección de células madre neurales de la zona subventricular murina adulta

Isolation and expansion of neural stem cells (NSCs) from the subventricular zone (SVZ) of the adult mouse brain can be achieved in a medium supplemented ...