Los autores desean agradecer a Catalina Alford para obtener sugerencias sobre los métodos de disociación celular y Weller Kevin Flaherty David Matlock y Bretaña para el apoyo en la citometría de flujo de recursos compartidos en la Vanderbilt University Medical Center y Melissa A. Musser para la asistencia artística con ilustraciones. Agradecemos a los Dres. Jack Mosher y Sean Morrison para el asesoramiento en la implementación de aislamiento de progenitores neuronales. La Citometría de Flujo de Recursos VMC compartido con el apoyo de la Vanderbilt Ingram Cancer Center (P30 CA68485) y el Vanderbilt de Enfermedades Digestivas del Centro de Investigación (P30 DK058404). Este trabajo fue apoyado por fondos de EE.UU. Institutos Nacionales de Salud subvenciones DK064251, DK086594 y DK070219.

1. Preparación de medios de comunicación (Todos los pasos a cabo en la campana de cultivo de tejidos) <ol><li> Combinar la siguiente: 44 L-15 ml de medio, 0,5 ml de 100X penicilina / estreptomicina (P / S), 0,5 ml de 100 mg / ml de albúmina sérica bovina (BSA), 0,5 ml de HEPES 1M, 5 ml de cultivo tisular de agua de grado. Asegúrese de mezclar la BSA y P / S bien antes de añadir. Este volumen debe ser adecuada para la disociación de hasta cinco tipos diferentes tejidos. Este medio se utilizará en el Paso 3,4 para preparar soluciones de Enfriamiento para su uso después de la disociación enzimática de tejido. </li><li> Medio filtrante sin embargo 0,22 polietersulfona (PES) del filtro. </li><li> Preparar la solución salina equilibrada de Hank 1X (HBSS) y el fosfato 1X solución salina tamponada (PBS) de 10 veces las poblaciones de cultivo de tejidos, agua de calidad. Filtrar a través de filtros de 0,22 micras de PSA. Los grandes volúmenes de estos reactivos se pueden preparar antes de tiempo y se almacenan a 4 ° C, alícuotas de volúmenes más pequeños en una campana de cultivo de tejidos como sea necesario. </li><li> Rellene múltiples tubos cónicos de 15 ml con 1X HBSS, pornúmero de tubos para igualar el número de tejidos va en el sub-disección) el mantenimiento de los tubos en hielo. </li></ol> 2. Disección <ol><li> La eutanasia programada ratón embarazadas, de conformidad con el cuidado de animales institucional y protocolos de uso aprobados del comité y el útero de transferencia en un 60 o 100 mm placa de Petri que contiene el hielo frío PBS 1X. </li><li> Eliminar embriones del útero y de la eutanasia por decapitación en el hielo frío PBS 1X. Pantalla de forma individual bajo la iluminación de fluorescencia, dividiéndose en positivos transgénicos y de tipo salvaje (WT) piscinas no transgénicos. Mantener embriones en helado PBS 1X a lo largo de la disección. </li><li> Bajo un microscopio de disección, sub-diseccionar el tracto urogenital. Mantenga el embrión en su lugar en el nivel de miembro superior con unas pinzas finas. Eliminar las vísceras desde el hígado hasta el tubérculo genital mediante la inserción de pinzas en el nivel del diafragma entonces rápidamente tirando de los órganos internos hacia abajo y lejos de la pared dorsal del cuerpo. </li><li> Además sub-disecar el tejido de lainterés lejos del tejido circundante (Figura 1). Coloque cada uno de forma individual sub-tipo de tejido diseccionado en un tubo cónico de 15 ml que contiene hielo 1X HBSS fría. Piscina cada tipo de tejido en conjunto de acuerdo con el fenotipo de embriones (es decir, todas las buenas prácticas agrarias + muestras de intestino del feto se agrupan en un tubo cónico de 15 ml de una sola). </li><li> Al mismo tiempo, diseccionar los tejidos comparables de tipo salvaje embriones a utilizar para controles de compensación en la citometría de flujo. </li></ol> 3. La disociación de los tejidos Subdissected <ol><li> Pellet sub-disección de tejidos por centrifugación a 210 la fuerza centrífuga relativa (RCF), 4 ° C durante 5 min. Tras la centrifugación, se aspira apagado como HBSS tanto como sea posible. </li><li> Resuspender el sedimento de tejido en Accumax (Tecnologías Innovadoras celulares, Inc), y asegúrese de cambiar las puntas de pipeta para cada muestra para evitar la contaminación cruzada de los tipos de tejidos. La cantidad de Accumax añadido puede escalarse para cantidades mayores o menores de tejido. Típicamente, para una-5 Muestras de intestino fetal, 1 ml de Accumax se utilizaría, pero grandes grupos de tejidos que requieren un mayor volumen de lograr la disociación. </li><li> Colocar los tubos en 37 ° C baño de agua durante 20-45 minutos dependiendo de la etapa del tejido que está siendo aislada (por ejemplo 13,5 intestino DPC 20 minutos, 15,5 intestino DPC 35 min). A mitad de camino cuando el tiempo de disociación, de forma manual romper el tejido golpeando el tubo contra el lado del baño de agua (o cualquier otra superficie sólida) y por el &quot;parpadeo&quot; del tubo (como era de extorsionar a un termómetro de mercurio pasada de moda). Al final del tiempo de disociación repetir el movimiento hacia abajo procedimiento varias veces para disociar aún más la muestra. Para las muestras más frágiles, reducir la vigorosidad de la sacudida hacia abajo y en lugar de utilizar la trituración de pipeta durante el paso de 3,5 a alcanzar un nivel adecuado de la disociación. Tiempos de disociación de 14,5 dpc y 15.5 dpc LUT son 35 y 45 minutos, respectivamente. </li><li> Mientras que el tejido se está incubando en Accumax, constituyen enfriamiento paraluciones, denominado Quench Quench y 1:5. Quench se hace mediante la adición de 45 l de 5 mg / ml de DNasa I de 6 ml de L-15 de medios. Quench 01:05 se hace mediante la adición de 45 l de 5 mg / ml de DNasa I de 30 ml a 15 L-Media. </li><li> Al final de la disociación, mover tubos de 15 ml en hielo y añadir inmediatamente 1 Quench ml a cada tubo. Se tritura cada muestra arriba y hacia abajo hasta que el tejido es casi completamente disociado (Figura 2). Todavía habrá algunos pequeños trozos de tejido presente en la solución. El logro de una muestra completamente homogénea es ni fácilmente realizable ni deseable ya que puede resultar en la viabilidad celular pobre. </li><li> Mantener la muestra en hielo tanto como sea posible durante el resto del protocolo. Asegúrese de utilizar una punta de pipeta al pipetear hasta apagar o Quench 1:05 para evitar la contaminación cruzada de muestras. </li></ol> 4. Filtrado de la suspensión de la célula <ol><li> El uso de pinzas que se han empapado en etanol al 70%, colocar unos 3 cm cuadrados de 38 micras membrana de malla de nylon (Sefar América) sobre ella boca de un nuevo Tubo de 15 ml cónico. Filtrar las células a través de la malla al vaso en el centro de la membrana con estrechos consejos calibre. Si la membrana se satura mientras se filtra, se retire, secar la boca del tubo con una Kimwipe, y utilizar una nueva pieza de malla de nylon para filtrar el resto de la suspensión celular. Una vez que todas las células han sido filtrados, utilice 1 ml Quench 01:05 para enjuagar el tubo y el filtro de las células restantes. </li><li> Cuando el filtrado es completa, o cuando se reemplaza una membrana obstruido, utilizar fórceps para enrollar los lados de la malla y limpie la membrana a través de la parte superior del tubo para eliminar cualquier gotitas colgantes de las células. </li><li> Pellet suspensión de células por centrifugación a 210rcf, 4 ° C durante 5 min. Aspirar el sobrenadante y resuspender el pellet en 1 ml Quench 01:05. </li><li> Suspensión de células a través del filtro de malla de nylon en 5 tubos de poliestireno ml. Lavar tubo de 15 ml con 1 ml Quench 1:5 y filtro para capturar todas las células restantes. </li></ol> 5. Preparación de muestras para la FACS <ol&gt; <li> Si se utiliza el mismo tejido de la clasificación y para los controles de compensación, la transferencia de 1/10 a 1/20 ª del volumen de muestra a un nuevo tubo de poliestireno de 5 ml de usar para los controles de compensación. Dividir la muestra de tejido de tipo salvaje en dos porciones. Una porción se mancha de tipo salvaje (WT solamente) mientras que el segundo medio tendrá 7-Aminoactinomycin D (7-AAD, un intercalador fluorescente excluidos de células vivas utilizadas como una &quot;mancha viabilidad&quot;) que se añade a ella (7-AAD sólo ). Estos controles individuales son necesarias para permitir la compensación de cualquier solapamiento espectral entre las emisiones de fluoróforos discretos en el clasificador de flujo. Por ejemplo, para un solo reportero fluorescente como EGFP, los controles necesarios se incluyen: EGFP solamente, sin teñir las células en peso, y un tubo de teñido con 7-AAD sólo (Figura 3). </li><li> Rellene todos los tubos de 5 ml que contienen suspensión celular con Quench 01:05 y centrifugar a 210rcf, 4 ° C durante 5 min. Aspirar el sobrenadante, dejando aproximadamente 200 l de líquidoen el tubo. </li><li> Diluir 7-AAD 1:1000 en Quench 01:05. Agregar 7-AAD dilución de tinción de 7-AAD Control de compensación única y muestras que deben resolverse. No agregue 7-AAD a la EGFP sólo o WT controles de compensación solamente. Volumen de 7-AAD que se añade variará dependiendo de la cantidad de material de partida y el tamaño de sedimento celular obtenido. Una vez 7-AAD se ha añadido a los tubos apropiados, las muestras están listas para ser ordenados. <table border="1"><tbody><tr><td> Tejido </td><td> Tamaño de la muestra Piscina </td><td> Volumen 7-AAD que se añade a * tubo </td></tr><tr><td> 15.5 dpc Intestino </td><td> 1-5 </td><td> 200 l </td></tr><tr><td> 15.5 dpc LUT </td><td> 1-5 </td><td> 150 l </td></tr></tbody></table> Tabla 1. Cantidad de 7-AAD añadido a disocia tejidos diferentes * La cantidad total final en cada tubo variará por una cantidad que varía desde 50 hasta 100 l desde la aspiración de los medios es unn proceso aproximado y realiza para evitar el sedimento. Volúmenes finales no se miden con el fin de minimizar la manipulación de las células en solución. </li><li> Preparar los tubos de recogida de capturar las células de aislamiento de ARN mediante la adición de 0,75 ml de TRIzol LS a tubos de 1,5 ml de centrífuga. </li><li> Si la recolección de células para el cultivo in vitro, en lugar de aislamiento de ARN, las células ordenar directamente en los medios de auto-renovación en placas de 6 pocillos de cultivo de tejidos, las revestidas con fibronectina y se llena con los medios que se describió anteriormente. 2,6,7 </li></ol> 6. Citometría de Flujo <ol><li> En el citómetro de flujo, evaluar la compensación de los controles en primer lugar, asegurándose de eliminar de nuevo entre cada muestra para evitar la contaminación. Utilice los perfiles de las muestras de compensación para ajustar los voltajes o las puertas de la clasificación. Nótese que si las células positivas en el tejido deseado están presentes en números limitantes, un tejido distinto puede ser utilizado para establecer la configuración de compensación, siempre y cuando la intensidad de fluorescencia y tamaño de la celdaentre las muestras son comparables. </li><li> Establezca los parámetros de compensación y las puertas para evitar que las células muertas, que ocupan el 7-AAD tinte y recoger las células que presentan alta intensidad de fluorescencia de GFP en relación a los controles sin teñir (Figura 4). </li><li> Clasificar como máximo 25.000 células en cada tubo de microcentrífuga. Debe realizar una selección a la menor presión posible con una boquilla de gran calibre y bajo caudal (por ejemplo, 17psi, 100 m de la boquilla, 3.000 eventos por segundo) para preservar la viabilidad de células progenitoras neuronales. Por suerte para aislar las células EGFP + realizamos nuestros aislamientos en un FACSAriaII BD Biosciences utilizando un láser de 20mW 488nm para excitar el reportero EGFP. </li><li> Si las muestras contienen altas concentraciones de células, es aconsejable diluir la suspensión de células adicionalmente usando 1:1000 7-AAD mancha para lograr mayores eficiencias de captura al ordenar. </li><li> Vortex cada tubo de células capturadas en TRIzol LS inmediatamente después de la clasificación. </li></ol> 7. Los resultados representativos La disociación de tejidos para producir un suspensiones celulares para ordenar el flujo es un delicado equilibrio entre la digestión enzimática adecuada y evitar el exceso de digestión que puede dar lugar a viabilidades celulares bajos. Un ejemplo de nivel deseado de tejido disociación se muestra en la Figura 2. En el tejido digerido apropiadamente antes de piezas manuales trituración de los órganos sub-disecados son todavía claramente evidente (Figura 2b, 2f). En los tejidos que son enzimáticamente tratados por un período demasiado largo de tiempo o en una concentración demasiado alta de la enzima, la suspensión resultante carece de piezas residuales grandes de tejido (Figura 2d, 2H). Adecuada la disociación y el filtrado manual producir perfiles tipo en citometría de flujo que por lo general exhiben más de 90% de células viables y muestran altos niveles de expresión de EGFP (Figura 4). Poblaciones celulares obtenidos con este método ilustrar buenaviabilidad y puede ser capturada por la cultura posterior o análisis de la expresión génica de puerta de enlace para la captura de EGFP + progenitores neuronales. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/4188/4188fig1.jpg" /> Figura 1. Distribución de la TH-EGFP + neuronales progenitores en LUT de ratón fetal. Todo el montaje en el tracto urogenital 15,5 dpc vista ventral bajo la iluminación de campo claro (a) en comparación con la distribución de EGFP + células marcadas por TH-EGFP expresión de los transgenes identificados bajo la iluminación de fluorescencia (b). TH-EGFP expresión está presente en las glándulas suprarrenales (a) y en los ganglios situados medialmente celíaca (cg). Lateral (c) punto de vista de 15,5 dpc TH-EGFP sub-muestras disecadas de vejiga de fluorescencia de la expresión del transgen en los ganglios de la pelvis (PG), la pared de la vejiga (BLA) y la uretra (u). En vista dorsal (d) EGFP + células son evidentes en la uretra anterior dorsal. Otras etiquetas: riñones (k), testículo (T), vejiga (BLA) y tubérculo genital (GT). <imgalt = &quot;Figura 2&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/4188/4188fig2.jpg&quot; /&gt; Figura 2. Imágenes de campo claro 15 LUT DPC fetal (a) y el intestino (e), respectivamente, fotografiado la mitad del período de incubación de disociación, al final de la incubación disociación antes de la interrupción (b, f), después de la interrupción de instrucciones (c, g), y en una muestra que ha sido demasiado disociado (d, h). <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/4188/4188fig3.jpg" /> Figura 3. Diagrama esquemático ilustra la compensación necesaria para establecer controles rigurosos parámetros de compuerta FACS. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/4188/4188fig4.jpg" /> Figura 4. Imagen representativa de los perfiles de ordenación de flujos en un 14,5 dpc (a) y 15.5 dpc (b). Negro de la población se compone de células individuales basadas en la dispersión y la cara que están muertos y etiquetado por7-AAD fluorescencia. Población de Gray se compone de células singlete sobre la base de la dispersión y la cara que se han excluido 7-AAD y, por tanto viable. Población con acceso Verde se indica en caja &quot;las buenas prácticas agrarias +&quot; área y se compone de células individuales que han excluido a 7-AAD (viable) y presentan fluorescencia EGFP.

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	<li>Gong, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+gene+expression+atlas+of+the+central+nervous+system+based+on+bacterial+artificial+chromosomes.">A gene expression atlas of the central nervous system based on bacterial artificial chromosomes.</a> Nature. 425, 917-925 (2003).</li><li>Morrison, S. J., White, P. M., Zock, C., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prospective+identification,+isolation+by+flow+cytometry,+and+in+vivo+self-renewal+of+multipotent+mammalian+neural+crest+stem+cells.">Prospective identification, isolation by flow cytometry, and in vivo self-renewal of multipotent mammalian neural crest stem cells.</a> Cell. 96, 737-749 (1999).</li><li>Kruger, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+crest+stem+cells+persist+in+the+adult+gut+but+undergo+changes+in+self-renewal,+neuronal+subtype+potential,+and+factor+responsiveness.">Neural crest stem cells persist in the adult gut but undergo changes in self-renewal, neuronal subtype potential, and factor responsiveness.</a> Neuron. 35, 657-669 (2002).</li><li>Bixby, S., Kruger, G. M., Mosher, J. T., Joseph, N. M., Morrison, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-intrinsic+differences+between+stem+cells+from+different+regions+of+the+peripheral+nervous+system+regulate+the+generation+of+neural+diversity.">Cell-intrinsic differences between stem cells from different regions of the peripheral nervous system regulate the generation of neural diversity.</a> Neuron. 35, 643-656 (2002).</li><li>Walters, L. C., Cantrell, V. A., Weller, K. P., Mosher, J. T., Southard-Smith, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+background+impacts+developmental+potential+of+enteric+neural+crest-derived+progenitors+in+the+Sox10Dom+model+of+Hirschsprung+disease.">Genetic background impacts developmental potential of enteric neural crest-derived progenitors in the Sox10Dom model of Hirschsprung disease.</a> Human Molecular Genetics. , (2010).</li><li>Corpening, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+live+imaging+of+enteric+progenitors+based+on+Sox10-Histone2BVenus+transgene+expression.">Isolation and live imaging of enteric progenitors based on Sox10-Histone2BVenus transgene expression.</a> Genesis. 49, 599-618 (2011).</li><li>Morrison, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Isolation of fetal rat neural crest stem cells (NCSC) from gut and sciatic nerve. , (2012).</li><li>Skarnes, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conditional+knockout+resource+for+the+genome-wide+study+of+mouse+gene+function.">A conditional knockout resource for the genome-wide study of mouse gene function.</a> Nature. 474, 337-342 (2011).</li><li>Harding, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+GUDMAP+database--an+online+resource+for+genitourinary+research.">The GUDMAP database--an online resource for genitourinary research.</a> Development. 138, 2845-2853 (2011).</li><li>Joseph, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enteric+glia+are+multipotent+in+culture+but+primarily+form+glia+in+the+adult+rodent+gut.">Enteric glia are multipotent in culture but primarily form glia in the adult rodent gut.</a> J. Clin. Invest. 121, 3398-3411 (2011).</li><li>Newgreen, D. F., Murphy, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+crest+cell+outgrowth+cultures+and+the+analysis+of+cell+migration.">Neural crest cell outgrowth cultures and the analysis of cell migration.</a> Methods Mol. Biol. 137, 201-211 (2000).</li></ol>

No hay conflictos de interés declarado.

Líneas de ratones que expresan reportero reporteros fluorescentes están siendo ampliamente disponibles a través de los múltiples esfuerzos de la comunidad de la genética murina 1,8,9. Como resultado, el método de disociación se ilustra aquí se puede aplicar ampliamente para el aislamiento de discretos subtipos neuronales basadas en neurotransmisor o patrones de expresión del receptor de cualquiera de los tejidos fetales o un adulto. Si bien hemos optimizado este método basado en la expresión de un ...

The authors middle initials were omitted from the publication of <a href="http://www.jove.com/video/4188">An Optimized Procedure for Fluorescence-activated Cell Sorting (FACS) Isolation of Autonomic Neural Progenitors from Visceral Organs of Fetal Mice</a>.

Erratum: An Optimized Procedure for Fluorescence-activated Cell Sorting (FACS) Isolation of Autonomic Neural Progenitors from Visceral Organs of Fetal Mice

<table border="1"><tbody><tr><td> Reactivo Nombre </td><td> Vendedor </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> Accumax </td><td> Sigma (MFR: Tecnologías Innovadoras en la célula) </td><td> A7089-100ML </td><td> Almacenar congelado en alícuotas de 1 ml </td></tr><tr><td> DNasa I </td><td> Sigma </td><td> D-4527 </td><td> Almacenó congelado a -20 ° C 5 mg / ml en 1xHBSS, (Utilizado en Quench, Quench 01:05) </td></tr><tr><td> 10X de PBS pH 7,4 </td><td> Gibco </td><td> 70011-044 </td><td> Completar hasta 1x con agua de grado de cultivo de tejidos luego de filtro estéril </td></tr><tr><td> 10 veces HBSS w / o Ca o Mg </td><td> Gibco </td><td> 14185-052 </td><td> Completar hasta 1x con agua de grado de cultivo de tejidos luego de filtro estéril </td></tr><tr><td> Leibovitz medio L-15 </td><td> Gibco </td><td> 21083027 </td><td></td></tr><tr><td> La penicilina / estreptomicina 100X </td><td> Gibco </td><td>15140-133 </td><td> Tienda alícuotas a -20 ° C </td></tr><tr><td> BSA </td><td> Sigma </td><td> A3912-100G </td><td> Almacenar alícuotas a -20 ° C, 100 mg / ml en agua </td></tr><tr><td> Biowhittaker 1M en HEPES 0,85% de NaCl </td><td> Lonza </td><td> 17-737E </td><td></td></tr><tr><td> 38 m de nylon de malla Nitex de membrana </td><td> Sefar Latina </td><td> 3-38/22 </td><td> Cortar en cuadrados ~ 3 cm. UV tratar la noche a la mañana para esterilizar en la campana de cultivo de tejidos. </td></tr><tr><td> 7-AAD </td><td> Invitrogen </td><td> A1310 </td><td> 1 mg / ml </td></tr><tr><td> TRIzol LS </td><td> Invitrogen </td><td> 10296-028 </td><td></td></tr><tr><td> 5 ml tubos de poliestireno </td><td> Halcón </td><td> 352058 </td><td></td></tr><tr><td> Tubos cónicos de 15 ml </td><td> Corning </td><td> 430790 </td><td></td></tr><tr><td> Bellas Pinza de disección </td><td> Instrumentos Bellas Ciencia </td><td> 11251-30 </td><td> Dumont # 5 forcep, Dumoxel, estándar de la punta 0.1x0.06mm </td></tr><tr><td> Disección de una cuchara </td><td> Instrumentos Bellas Ciencia </td><td> 10370-18 </td><td></td></tr></tbody></table>

an optimized procedure for fluorescence-activated cell sorting (facs) isolation of autonomic neural progenitors from visceral organs of fetal mice

Durante el desarrollo de la cresta neural (NC) de los progenitores neuronales derivados de migrar fuera del tubo neural para formar los ganglios autonómicos en los órganos viscerales como el intestino y el tracto urinario inferior. Tanto durante el desarrollo y en los tejidos maduros estas células son a menudo muy dispersos a lo largo de los tejidos por lo que el aislamiento de las poblaciones discretas utilizando métodos como la captura de micro-disección con láser es difícil. Sin embargo, pueden ser vistas directamente por la expresión de los periodistas fluorescentes expulsados ​​de las regiones reguladoras de genes específicos de neuronas, como tirosina hidroxilasa (TH). Se describe un método optimizado para altos rendimientos de TH + viables progenitoras neuronales de tejidos de ratón fetales viscerales, incluyendo intestino y tracto urogenital inferior (LUT), basado en la disociación y activado por fluorescencia de células de clasificación (FACS). El gen codifica Th. la enzima limitante para la producción de catecolaminas. Entéricas progenitores neuronales empiezan a expresar TH duranteIng su migración en el intestino del feto 1 y TH también está presente en un subconjunto de neuronas de los ganglios pélvicos adultos 2-4. La primera aparición de este linaje y la distribución de estas neuronas en otros aspectos de la LUT, y su aislamiento no se ha descrito. Progenitores neuronales que expresan TH pueden ser fácilmente visualizados por la expresión de EGFP en ratones portadores del transgén construcción Tg (Th-EGFP) DJ76Gsat/Mmnc 1. Hemos fotografiado la expresión de este transgén en los ratones fetales para documentar la distribución de las células TH + en la LUT desarrollando a 15,5 días post coito (dpc), la designación de la mañana de detección de conexión de hasta 0,5 dpc, y observó que un subconjunto de células progenitoras neuronales en la coalescencia pélvica ganglios expresa EGFP. Para aislar LUT TH + progenitores neuronales, hemos optimizado los métodos que se utilizaron inicialmente para purificar las células troncales de la cresta neural del intestino delgado de ratón fetal 2-6. Los esfuerzos anteriores para aislar a Carolina del Norte derivados de las poblaciones en que se basadigestión con un cóctel de la colagenasa y tripsina para obtener suspensiones de células de citometría de flujo. En nuestras manos estos métodos producen suspensiones de células de la LUT con la viabilidad relativamente bajo. Teniendo en cuenta la incidencia ya baja de los progenitores neuronales en los tejidos fetales TUS, nos propusimos optimizar los métodos de disociación de tal manera que la supervivencia celular en las finales se disocia se incrementaría. Se determinó que la gentil disociación en Accumax (Tecnologías Innovadoras celulares, Inc), el filtrado manual, y el flujo de la clasificación a bajas presiones, que nos permitió lograr una supervivencia constantemente mayor (&gt; 70% del total de células), con rendimientos posteriores de progenitores neuronales suficientes para el análisis de aguas abajo. El método se describe pueden ser ampliamente aplicadas para aislar una variedad de poblaciones neuronales de cualquiera de los tejidos murinos fetales o un adulto.

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An Optimized Procedure for Fluorescence-activated Cell Sorting FACS Isolation of Autonomic Neural Progenitors from Visceral Organs of Fetal Mice

Siguiendo un procedimiento optimizado para purificar la cresta neural, derivados progenitores neuronales a partir de tejidos fetales de ratón se ha descrito. Este método aprovecha de expresión de alelos reportero fluorescentes para aislar poblaciones discretas por clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS). La técnica se puede aplicar para aislar las subpoblaciones neuronales en todo el desarrollo o de tejidos adultos.

Un procedimiento optimizado para el activado por fluorescencia de células de clasificación (FACS) El aislamiento de progenitores neurales autónomas de los órganos viscerales de los fetos de ratones

During development neural crest (NC)-derived neuronal progenitors migrate away from the neural tube to form autonomic ganglia in visceral organs like the ...

an-optimized-procedure-for-fluorescence-activated-cell-sorting-facs

Research

JoVE Journal

Neuroscience

An Optimized Procedure for Fluorescence-activated Cell Sorting (FACS) Isolation of Autonomic Neural Progenitors from Visceral Organs of Fetal Mice

13.6K vistas.  Vanderbilt University School of Medicine. Siguiendo un procedimiento optimizado para purificar la cresta neural, derivados progenitores neuronales a partir de tejidos fetales de ratón se ha descrito. Este método aprovecha de expresión de alelos reportero fluorescentes para aislar poblaciones discretas por clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS). La técnica se puede aplicar para aislar las subpoblaciones neuronales en todo el desarrollo o de tejidos adultos.

Video: An Optimized Procedure for Fluorescence-activated Cell Sorting FACS Isolation of Autonomic Neural Progenitors from Visceral Organs of Fetal Mice

Generation of Neural Stem Cells from Discarded Human Fetal Cortical Tissue

Neural stem cells (NSCs) reside along the ventricular zone neuroepithelium during the development of the cortical plate. These early progenitors ultimately give rise to intermediate progenitors and later, the various neuronal and glial cell subtypes that form the cerebral cortex. The capacity to generate and expand human NSCs (so called neurospheres) from discarded normal fetal tissue provides a means with which to directly study the functional aspects of normal human NSC development 1-5. This approach can also be directed toward the generation of NSCs from known neurological disorders, thereby affording the opportunity to identify disease processes that alter progenitor proliferation, migration and differentiation 6-9. We have focused on identifying pathological mechanisms in human Down syndrome NSCs that might contribute to the accelerated Alzheimer's disease phenotype 10,11. Neither in vivo nor in vitro mouse models can replicate the identical repertoire of genes located on human chromosome 21. 
Here we use a simple and reliable method to isolate Down syndrome NSCs from aborted human fetal cortices and grow them in culture. The methodology provides specific aspects of harvesting the tissue, dissection with limited anatomical landmarks, cell sorting, plating and passaging of human NSCs. We also provide some basic protocols for inducing differentiation of human NSCs into more selective cell subtypes.

A simple and reliable method on isolation and culture of neural stem cells from discarded human fetal cortical tissue is described. Cultures derived from known human neurological disorders can be used for characterization of pathological cellular and molecular processes, as well as provide a platform to assess pharmacological efficacy.

Generación de las células troncales nerviosas de desechados Humanos tejido cortical fetal

Neural stem cells (NSCs) reside along the ventricular zone neuroepithelium during the development of the cortical plate. These early progenitors ...

Investigación

Neurociencias

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to mesenchymal transition (EMT) and migrates throughout the embryo, giving rise to diverse cell types 1-3. NC also has the unique ability to influence the differentiation and maturation of target organs4-6. When explanted in vitro, NC progenitors undergo self-renewal, migrate and differentiate into a variety of tissue types including neurons, glia, smooth muscle cells, cartilage and bone. 
NC multipotency was first described from explants of the avian neural tube7-9. In vitro isolation of NC cells facilitates the study of NC dynamics including proliferation, migration, and multipotency. Further work in the avian and rat systems demonstrated that explanted NC cells retain their NC potential when transplanted back into the embryo10-13. Because these inherent cellular properties are preserved in explanted NC progenitors, the neural tube explant assay provides an attractive option for studying the NC in vitro. 
To attain a better understanding of the mammalian NC, many methods have been employed to isolate NC populations. NC-derived progenitors can be cultured from post-migratory locations in both the embryo and adult to study the dynamics of post-migratory NC progenitors11,14-20, however isolation of NC progenitors as they emigrate from the neural tube provides optimal preservation of NC cell potential and migratory properties13,21,22. Some protocols employ fluorescence activated cell sorting (FACS) to isolate a NC population enriched for particular progenitors11,13,14,17. However, when starting with early stage embryos, cell numbers adequate for analyses are difficult to obtain with FACS, complicating the isolation of early NC populations from individual embryos. Here, we describe an approach that does not rely on FACS and results in an approximately 96% pure NC population based on a Wnt1-Cre activated lineage reporter23. 
The method presented here is adapted from protocols optimized for the culture of rat NC11,13. The advantages of this protocol compared to previous methods are that 1) the cells are not grown on a feeder layer, 2) FACS is not required to obtain a relatively pure NC population, 3) premigratory NC cells are isolated and 4) results are easily quantified. Furthermore, this protocol can be used for isolation of NC from any mutant mouse model, facilitating the study of NC characteristics with different genetic manipulations. The limitation of this approach is that the NC is removed from the context of the embryo, which is known to influence the survival, migration and differentiation of the NC2,24-28.

Isolation of embryonic neural crest from the neural tube facilitates the use of in vitro methods for studying migration, self-renewal, and multipotency of neural crest.

Aislamiento y cultivo de células de la cresta neural de embriones murinos del Tubo Neural

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

A Quantitative Cell Migration Assay for Murine Enteric Neural Progenitors

Neural crest cells (NCC) are a transient and multipotent cell population that originates from the dorsal neural tube and migrates extensively throughout the developing vertebrate embryo. In addition to providing peripheral glia and neurons, NCC generate melanocytes as well as most of the cranio-facial skeleton. NCC migration and differentiation is controlled by a combination of their axial origin along the neural tube and their exposure to regionally distinct extracellular cues. Such contribution of extracellular ligands is especially evident during the formation of the enteric nervous system (ENS), a complex interconnected network of neural ganglia that locally controls (among other things) gut muscle movement and intestinal motility. Most of the ENS is derived from a small initial pool of NCC that undertake a long journey in order to colonize - in a rostral to caudal fashion - the entire length of the prospective gut. Among several signaling pathways known to influence enteric NCC colonization, GDNF/RET signaling is recognized as the most important. Indeed, spatiotemporally controlled secretion of the RET ligand GDNF by the gut mesenchyme is chiefly responsible for the attraction and guidance of RET-expressing enteric NCC to and within the embryonic gut. Here, we describe an ex vivo cell migration assay, making use of a transgenic mouse line possessing fluorescently labeled NCC, which allows precise quantification of enteric NCC migration potential in the presence of various growth factors, including GDNF.

We present an ex vivo cell migration assay that allows precise quantification of enteric neural crest cell migration potential in the presence of various growth factors.

Un ensayo de migración celular cuantitativa para murinos entéricas Neuronales Progenitores

Neural crest cells (NCC) are a transient and multipotent cell population that originates from the dorsal neural tube and migrates extensively throughout ...

One Mouse, Two Cultures: Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Two Neurogenic Zones of Individual Mice

The neurosphere assay and the adherent monolayer culture system are valuable tools to determine the potential (proliferation or differentiation) of adult neural stem cells in vitro. These assays can be used to compare the precursor potential of cells isolated from genetically different or differentially treated animals&#160;to determine the effects of exogenous factors on neural precursor cell proliferation and differentiation and to generate neural precursor cell lines that can be assayed over continuous passages. The neurosphere assay is traditionally used for the post-hoc identification of stem cells, primarily due to the lack of definitive markers with which they can be isolated from primary tissue&#160;and has the major advantage of giving a quick estimate of precursor cell numbers in brain tissue derived from individual animals. Adherent monolayer cultures, in contrast, are not traditionally used to compare proliferation between individual animals, as each culture is generally initiated from the combined tissue of between 5-8 animals. However, they have the major advantage that, unlike neurospheres, they consist of a mostly homogeneous population of precursor cells and are useful for following the differentiation process in single cells. Here, we describe, in detail, the generation of neurosphere cultures and, for the first time, adherent cultures from individual animals. This has many important implications including paired analysis of proliferation and/or differentiation potential in both the subventricular zone (SVZ) and dentate gyrus (DG) of treated or genetically different mouse lines, as well as a significant reduction in animal usage.

Here we describe a detailed protocol for the simultaneous generation of neural precursor cell cultures, as either adherent monolayers or neurospheres, from the subventricular zone and dentate gyrus of individual adult mice.

Un ratón, dos culturas: Aislamiento y cultivo de adultos Neural las células madre de las dos zonas neurogénicos de ratones individuales

The neurosphere assay and the adherent monolayer culture system are valuable tools to determine the potential (proliferation or differentiation) of adult ...

Using Fluorescence Activated Cell Sorting to Examine Cell-Type-Specific Gene Expression in Rat Brain Tissue

The brain is comprised of four primary cell types including neurons, astrocytes, microglia and oligodendrocytes. Though they are not the most abundant cell type in the brain, neurons are the most widely studied of these cell types given their direct role in impacting behaviors. Other cell types in the brain also impact neuronal function and behavior via the signaling molecules they produce. Neuroscientists must understand the interactions between the cell types in the brain to better understand how these interactions impact neural function and disease. To date, the most common method of analyzing protein or gene expression utilizes the homogenization of whole tissue samples, usually with blood, and without regard for cell type. This approach is an informative approach for examining general changes in gene or protein expression that may influence neural function and behavior; however, this method of analysis does not lend itself to a greater understanding of cell-type-specific gene expression and the effect of cell-to-cell communication on neural function. Analysis of behavioral epigenetics has been an area of growing focus which examines how modifications of the deoxyribonucleic acid (DNA) structure impact long-term gene expression and behavior; however, this information may only be relevant if analyzed in a cell-type-specific manner given the differential lineage and thus epigenetic markers that may be present on certain genes of individual neural cell types. The Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) technique described below provides a simple and effective way to isolate individual neural cells for the subsequent analysis of gene expression, protein expression, or epigenetic modifications of DNA. This technique can also be modified to isolate more specific neural cell types in the brain for subsequent cell-type-specific analysis.

The goal of this protocol is to use the fluorescence activated cell sorting (FACS) technique to sort specific types of neural cells for subsequent analysis of cell-type-specific gene expression, epigenetic markers, and or protein expression.

Utilizando fluorescencia clasificación de células activadas para examinar Cell-tipo-específica la expresión génica en el tejido de cerebro de rata

The brain is comprised of four primary cell types including neurons, astrocytes, microglia and oligodendrocytes. Though they are not the most abundant ...

Cell Sorting of Neural Stem and Progenitor Cells from the Adult Mouse Subventricular Zone and Live-imaging of their Cell Cycle Dynamics

Neural stem cells (NSCs) in the subventricular zone of the lateral ventricles (SVZ) sustain olfactory neurogenesis throughout life in the mammalian brain. They successively generate transit amplifying cells (TACs) and neuroblasts that differentiate into neurons once they integrate the olfactory bulbs. Emerging fluorescent activated cell sorting (FACS) techniques have allowed the isolation of NSCs as well as their progeny and have started to shed light on gene regulatory networks in adult neurogenic niches. We report here a cell sorting technique that allows to follow and distinguish the cell cycle dynamics of the above-mentioned cell populations from the adult SVZ with a LeX/EGFR/CD24 triple staining. Isolated cells are then plated as adherent cells to explore in details their cell cycle progression by time-lapse video microscopy. To this end, we use transgenic Fluorescence Ubiquitination Cell Cycle Indicator (FUCCI) mice in which cells are red-fluorescent during G1 phase due to a G1 specific red-Cdt1 reporter. This method has recently revealed that proliferating NSCs progressively lengthen their G1 phase during aging, leading to neurogenesis impairment. This method is easily transposable to other systems and could be of great interest for the study of the cell cycle dynamics of brain cells in the context of brain pathologies.

We report a Fluorescent Activated Cell Sorting (FACS)-based method to isolate neural stem cells (NSCs) and their progeny from the subventricular zone (SVZ) of the adult mouse brain. Applied to Fluorescence Ubiquitination Cell Cycle Indicator (FUCCI) transgenic mice, it allows the study of cell cycle progression by live imaging.

Clasificación celular del Neuronales madre y progenitoras Las células del adulto Ratón zona subventricular y Live-imágenes de sus Dinámica del Ciclo Celular

Neural stem cells (NSCs) in the subventricular zone of the lateral ventricles (SVZ) sustain olfactory neurogenesis throughout life in the mammalian brain. ...

Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) and Gene Expression Analysis of Fos-expressing Neurons from Fresh and Frozen Rat Brain Tissue

The study of neuroplasticity and molecular alterations in learned behaviors is switching from the study of whole brain regions to the study of specific sets of sparsely distributed activated neurons called neuronal ensembles that mediate learned associations. Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) has recently been optimized for adult rat brain tissue and allowed isolation of activated neurons using antibodies against the neuronal marker NeuN and Fos protein, a marker of strongly activated neurons. Until now, Fos-expressing neurons and other cell types were isolated from fresh tissue, which entailed long processing days and allowed very limited numbers of brain samples to be assessed after lengthy and complex behavioral procedures. Here we found that yields of Fos-expressing neurons and Fos mRNA from dorsal striatum were similar between freshly dissected tissue and tissue frozen at -80 &#186;C for 3 - 21 days. In addition, we confirmed the phenotype of the NeuN-positive and NeuN-negative sorted cells by assessing gene expression of neuronal (NeuN), astrocytic (GFAP), oligodendrocytic (Oligo2) and microgial (Iba1) markers, which indicates that frozen tissue can also be used for FACS isolation of glial cell types. Overall, it is possible to collect, dissect and freeze brain tissue for multiple FACS sessions. This maximizes the amount of data obtained from valuable animal subjects that have often undergone long and complex behavioral procedures.

Fluorescence Activated Cell Sorting FACS and Gene Expression Analysis of Fos-expressing Neurons from Fresh and Frozen Rat Brain Tissue

Here we present a Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) protocol to study molecular alterations in Fos-expressing neuronal ensembles from both fresh and frozen brain tissue. The use of frozen tissue allows FACS isolation of many brain areas over multiple sessions to maximize the use of valuable animal subjects.

La fluorescencia de células activadas (FACS) y análisis de expresión génica de las neuronas que expresan Fos-Fresco y de tejido congelado de cerebro de rata

The study of neuroplasticity and molecular alterations in learned behaviors is switching from the study of whole brain regions to the study of specific ...

Isolation and Cultivation of Neural Progenitors Followed by Chromatin-Immunoprecipitation of Histone 3 Lysine 79 Dimethylation Mark

Brain development is a complex process, which is controlled in a temporo-spatial manner by gradients of morphogens and different transcriptional programs. Additionally, epigenetic chromatin modifications, like histone methylation, have an important role for establishing and maintaining specific cell fates within this process. The vast majority of histone methylation occurs on the flexible histone tail, which is accessible to histone modifiers, erasers, and histone reader proteins. In contrast, H3K79 methylation is located in the globular domain of histone 3 and is implicated in different developmental functions. H3K79 methylation is evolutionarily conserved and can be found in a wide range of species from Homo sapiens to Saccharomyces cerevisiae. The modification occurs in different cell populations within organisms, including neural progenitors. The location of H3K79 methylation in the globular domain of histone 3 makes it difficult to assess. Here, we present methods to isolate and culture cortical progenitor cells (CPCs) from embryonic cortical brain tissue (E11.5-E14.5) or cerebellar granular neuron progenitors (CGNPs) from postnatal tissue (P5-P7), and to efficiently immunoprecipitate H3K79me2 for quantitative PCR (qPCR) and genome-wide sequencing.

We present an effective and reproducible method to isolate and culture neural progenitor cells from embryonic and postnatal brain tissue for chromatin immunoprecipitation (ChIP) of histone 3 lysine 79 dimethylation (H3K79me2) - a histone mark located within the globular domain of histone 3.

Aislamiento y cultivo de progenitores neuronales seguido por inmunoprecipitación de cromatina de histona 3 lisina 79 dimetilación marca

Brain development is a complex process, which is controlled in a temporo-spatial manner by gradients of morphogens and different transcriptional programs. ...

Primary Cell Culture of Purified GABAergic or Glutamatergic Neurons Established through Fluorescence-activated Cell Sorting

The overall goal of this protocol is to generate purified neuronal cultures derived from either GABAergic or glutamatergic neurons. Purified neurons can be cultured in defined media for 16 days in vitro and are amenable to any analyses typically performed on dissociated cultures, including electrophysiological, morphological and survival analyses. The major advantage of these cultures is that specific cell types can be selectively studied in the absence of complex external influences, such as those arising from glial cells or other neuron types. When planning experiments with purified cells, however, it is important to note that neurons strongly depend on glia-conditioned media for their growth and survival. In addition, glutamatergic neurons further depend on glia-secreted factors for the establishment of synaptic transmission. We therefore also describe a method for co-culturing neurons and glial cells in a non-contact arrangement. Using these methods, we have identified major differences between the development of GABAergic and glutamatergic neuronal networks. Thus, studying cultures of purified neurons has great potential for furthering our understanding of how the nervous system develops and functions. Moreover, purified cultures may be useful for investigating the direct action of pharmacological agents, growth factors or for exploring the consequences of genetic manipulations on specific cell types. As more and more transgenic animals become available, labeling additional specific cell types of interest, we expect that the protocols described here will grow in their applicability and potential.

This protocol describes a cell sorting based method for the purification and culture of fluorescent GABAergic or glutamatergic neurons from the neocortex and hippocampus of postnatal mice or rats.

Cultura celular primaria de las neuronas purificadas GABAérgicas o glutamatérgicas establecidas a través de la clasificación celular activada por fluorescencia

The overall goal of this protocol is to generate purified neuronal cultures derived from either GABAergic or glutamatergic neurons. Purified neurons can ...

Dissection of Pelvic Autonomic Ganglia and Associated Nerves in Male and Female Rats

The bilateral major pelvic ganglia (MPG; synonym, pelvic ganglia) are the primary source of postganglionic sympathetic and parasympathetic neurons innervating pelvic organs of rodents; the functionally equivalent structure in humans is the inferior hypogastric plexus. The major pelvic ganglia also provide the route by which lumbar and sacral sensory axons reach the pelvic organs. These complex, mixed ganglia can prove challenging to identify and dissect for further experimental study of normal autonomic mechanisms or to establish preclinical models of disease, injury or visceral pain. Here we describe a protocol to access and visualize these ganglia and their associated nerve tracts. We provide this protocol with schematics for both male and female rats, as the ganglion size and landmarks for identification differ between sexes. The protocol describes removal of the ganglion for in vitro studies, but this method can be integrated into a surgical recovery protocol for experimental interventions (e.g., nerve crush, nerve resection) or for mapping neuronal circuits (e.g., by microinjection of neural tracers). We also demonstrate the primary structures of the ganglion and its associated nerves immediately following dissection and following immunohistochemical staining.

The major pelvic ganglia contain parasympathetic and sympathetic neurons that innervate pelvic organs. Here we describe a dissection method and provide schematics for identification of these ganglia and their associated nerves. These methods can be applied to experimental manipulation of these ganglia in vivo or removal post-mortem for further study.