El objetivo general de esta técnica es la evaluación del efecto de las manipulaciones de expresión génica en la arquitectura neuronal cortical in vivo. Nuestra primera ventaja clave de este procedimiento sobre los basados en una electroporación neutra, es el control fino de los niveles de expresión génica. Específicamente, esta tubería integrada permite la evaluación in vivo del defecto, exaltada por pequeños cambios en la expresión génica en el control de la citoarquitectura neuronal.
Además, la estructura de pares de la prueba de trasplante permite una enorme reducción en el número de animales necesarios para obtener resultados estadísticamente significativos. La técnica aprovecha un grupo de precursores originarios de embriones transgénicos Tau EGFP. Esta piscina se subdivide en dos sub-pools que son alternativamente infectados con dos mezclas lentivirales.
Para obtener un grupo de pruebas verde y un grupo de control amarillo que se va a co-inyectar. Después de dos días de expansión in vitro, las neuroesferas resultantes se desasocian, se mezclan uno a uno, y se inyectan con un capilar en el espacio ventricular del ratón. Diez días después, se realiza inmunofluorescencia en secciones coronales para permitir la comparación entre las neuronas de prueba y control.
Por último, las secciones inmunotendémicas se tometán y esqueletizan para la evaluación final de los parámetros morfométricos. Antes del trasplante in vivo, preparar la piscina verde precursora. Los embriones E12.5, cosechados de una presa embarazada previamente acoplada a un fundador de Tau EGFP, se colocan en pozos individuales de una placa multi-pozo en solución PBS.
Genotipo rápidamente mediante inspección visual bajo una lámpara de luz azul. Desasociar los cortices verdes diseccionados a células individuales. Vuelva a suspender las células en un medio proliferativo y subdividirlas en dos subgrupos de tamaño igual.
Infectar cada sub-pool con una mezcla lentiviral dedicada. Cada mezcla contiene virus de etiqueta roja o virus de control negro. Así como virus para transgenes impulsados por Tet-Off o expresión de control, respectivamente.
Cada lentivirus debe administrarse a una multiplicidad de infección de 8. Placar las células infectadas en medio proliferativo con 2 microgramos por mililitro de doxiciclina. Transfiera las células a la incubadora y déjelas durante 2 días a 37 grados.
Después de 2 días, las dos sub-piscinas deben aparecer como suspensiones de pequeñas neuroesferas. Expresar homogéneamente la proteína fluorescente roja, o no. Después de la ingeniería de precursores, establezca una matriz de evaluación para el trasplante en cachorros de laboratorio blanco P0.
Utilice los capilares de vidrio borosilicato con diámetro eterno e interno igual a 1,5 milímetros y 1,12 milímetros, respectivamente. Tire del capilar con un tirador P1000. En primer lugar, introduzca el programa de extracción.
En segundo lugar, coloque el capilar en los soportes y apriételos. Tercero, inicie el programa y tome los dos microcapillarios tirados. Cortar la punta capilar, a mano con un bisturí, debajo del estereomicroscopio para obtener una punta con un diámetro externo de 200-250 micrómetros.
Por último, coloque los capilares en el soporte de plastilina en un plato de Petri cerrado, y transfiéralo debajo del capó. Desinfecte las fibras ópticas y colóquelas debajo del capó. Mezcle las mezclas maestras EGTA y Fast Green, para preparar la solución de trazador celular, y colóquela de nuevo debajo del capó.
Corte pequeños trozos de película de sellado de laboratorio para detectar la suspensión celular. Y finalmente, preparar una solución de 1 miligramo por mililitro de doxiciclina estéril desemida en una jeringa de 0,3 mililitros. El tubo de inyección se prepara a partir de dos tubos de látex.
Fije una pieza de boca de plástico duro a un extremo de un tubo de látex. A continuación, fije el soporte capilar a un extremo del otro tubo de látex. Conecte los extremos libres de los dos tubos de látex de un filtro estéril de 0,45 micrómetros, como barrera contra los gérmenes del operador.
Coloque el conjunto de tubo del aspirador resultante en un soporte de plastilina que se mantendrá debajo del capó. Recopile, pruebe y controle las neuroesferas en tubos separados. Centrifugar suspensiones de neurosfera y reemplazar el sobrenadante por PBS.
Repita esta secuencia dos veces más. Centrifugar las suspensiones de la neurosfera, reemplazar el sobrenadante por solución de trippsina, y pipetear el pellet celular hacia arriba y hacia abajo, 4, 5 veces. Deje las células en la incubadora durante cinco minutos para obtener una suspensión de una sola célula.
Bloquear la trippsina con solución inhibidora de la trippsina. Centrifugar las células y volver a suspenderlas en un medio proliferativo fresco. Contar las células de las dos agrupaciones y ajustar su concentración a 100.000 células por microlitro, en medio proliferativo.
Luego, mezcle las células de prueba y control 1:1 y compruebe la mezcla resultante bajo un microscopio de fluorescencia. Por último, coloque la mezcla sobre hielo debajo del capó. Prepare la jaula con la madre y los cachorros en una mesa lejos del área de la operadora quirúrgica.
Coloque una jaula de recuperación en un carro. Ponga una mezcla de aserrín tomado de la jaula de la madre en su fondo, y coloque la jaula de recuperación debajo de una lámpara. Aparte, establecer una caja de hielo cubierta por una lámina de aluminio para la anestesia de los cachorros P0.
Justo antes del trasplante, agregue de 1 a 10 volúmenes de solución de trazador celular a un volumen de suspensión celular, y detecte tres microlitros de la mezcla resultante en una pieza de película de sellado de laboratorio. Coloque el cachorro en la lámina de aluminio fresca durante un minuto, y compruebe que está completamente anestesiado. Mientras tanto, aspirar los 3 microlitros de la mezcla de inyección en el capilar de vidrio.
Limpie suavemente la cabeza del cachorro anestesiado con 70%etanol. A continuación, localícelo en la fibra óptica, para identificar claramente los hemisferios corticales. Introduzca el capilar en la parte delantera y acceda a la cavidad ventricular.
Al hacer eso, preste atención a no dañar los vasos sanguíneos. Para evitar daños de eminencia gangliónica, gire la aguja lateralmente unas treinta grados. Inyecte suavemente las células en la cavidad y monitoree su difusión por medio de Fast Green.
Espera de cinco a diez segundos. Retire la aguja de vidrio, teniendo cuidado de no aspirar la suspensión celular, y deseche en un contenedor de eliminación adecuado. Antes de la recuperación del cachorro de la anestesia, inyecte 150 microlitros de solución de doxi por vía intraperitoneal, para mantener la expresión transgénica todavía fuera después del trasplante.
Después de la inyección, coloque los cachorros inmediatamente debajo de la lámpara para su recuperación. Deja a los cachorros allí durante cinco a diez minutos, y una vez que estén completamente despiertos, colóquelos en la jaula con la madre. Observe a los cachorros operados durante dos o tres horas, para asegurarse de que la madre los acepte.
Suministre a la jaula agua potable que contenga 0,5mg/ml de doxiciclina y sacarosa, para mantener la expresión transgénica. Sustituya la doxiciclina que contiene agua con agua libre de oxígeno cuatro días después del trasplante. Activando así el trans-gen en las neuronas postmitoticas.
Mantenga a los ratones en un régimen libre de oxígeno durante seis días y eutanasiarlos en P10. Arreglar cerebros de cachorros eutanasiados en 4%PFA, a cuatro grados, de la noche a la mañana. Retire la solución PFA y sustitúyalo por una solución de sacarosa al 30%.
Deje los cerebros a cuatro grados hasta que se hundan hasta el fondo del vial. Transfiera los cerebros a un molde de incrustación desechable aproximadamente medio lleno de medio crio-inclusión. Congela el cerebro incluido a 80 grados.
Corte secciones coronales de 60 micras de espesor con un criostato. Secciones de proceso para inmunofluorescencia anti-GFP, anti-RFP y contrarrestenlas con solución DAPI. Establezca los parámetros de trabajo del microscopio confocal de forma adecuada como se muestra.
Recoger imágenes de rebanadas inmunoensayadas, seleccionando GFP campos fotográficos positivos ricos en neuronas ciegas de la distribución de la señal RFP. Exporta las imágenes como archivos ND2 y genera las máximas proyecciones z de ellas como archivos TIFF. Para permitir la esqueletización posterior de la neurona ciega del genotipo celular, oculte la señal roja.
Para ello, añada una capa de ajuste. Seleccione los niveles, seleccione rojo. Establezca la salida en cero.
Y guarde el archivo como tal. La esqueletización la realiza posteriormente un nuevo operador, que no tenía acceso previo a los archivos rojos sin formato originales. Para cada archivo rojo oculto, abra el archivo, añada una capa de dibujo a la imagen principal y seleccione la herramienta de lápiz.
Rastree el somer sobre la base de la señal GFP. Luego, rastrea las neuritas. Por último, guarde el archivo mutlilayer, incluidas las siluetas neuronales.
El análisis posterior de esqueletos neuronales puede ser realizado por cualquiera de los operadores. Abra cada archivo mulitlayer, cree nuevos archivos vacíos en escala de grises de 16 bits con fondo negro. Uno por neurona.
Copie y pegue siluetas neuronales individuales, desde la imagen principal, hasta los archivos en escala de grises. Vuelva al archivo multicapa y desactive la capa de ajuste para revelar genotipos neuronales. Guarde los archivos en escala de grises de 16 bits, anotando los genotipos de neurona correspondientes.
Importa imágenes en escala de grises en ImageJ una por una, y analiza esqueletos por el plugin NeurphologyJ. Recopile datos primarios seleccionados de NeurophologyJ, área total de longitud de neurita, puntos de unión y puntos finales, en una hoja de cálculo y empújelos para calcular parámetros morfométricos secundarios. El protocolo de ingeniería que proponemos permite coducducir la gran mayoría de las neuronas objeto de investigación, con los conjuntos transgenes previstos.
Además, permite alcanzar una homogeneidad sustancial de los niveles de expresión transgénero dentro de la población celular transducida. Una característica clave de nuestro procedimiento, es su configuración emparejada. Una prueba y un grupo de precursores de control se diseñan por separado, se mezclan 1:1 y finalmente se co-transplantan.
Este enfoque emparejado facilitará la detección de diferencias de resultados específicamente vinculadas a distintos genotipos. En este ejemplo, analizamos secciones coronales de cachorros trasplantados, diez días después de la coinyección interventricular de precursores de neuronas y control de Foxg1. Las imágenes de grupos de neuronas fueron adquiridas con microscopía confocal.
Los archivos Z-stack se utilizaron para calcular las proyecciones máximas. Las siluetas neuronales fueron trazadas manualmente. Aquí, las siluetas verdes y amarillas representan Foxg1 sobre-expresando y controlando las neuronas, respectivamente.
Finalmente, los parámetros primarios obtenidos por el análisis de NeurphologyJ, se emplearon para el cálculo de índices morfométricos secundarios, como se ilustra. Este es un protocolo simple que permite al investigador evaluar el impacto que la expresión mixta de un gen dado, puede ejercer sobre el control fino del desarrollo de neurite darth in vivo. Las principales ventajas de este protocolo son dos.
El número existente de genes implicados en la morfogénesis neuronal puede caracterizarse funcionalmente in vivo, en ausencia de las líneas teratogénicas correspondientes. Y se necesitan menos animales para el análisis para obtener los resultados estadísticos significativos.
