Name: subretinal injection of gene therapy vectors and stem cells in the perinatal mouse eye
Uploaded: 2012-11-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 9 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Subretinal Injection of Gene Therapy Vectors and Stem Cells in the Perinatal Mouse Eye at JoVE.com

Investigación para Prevención de la Ceguera, la asistencia Experimental de Takayuki Nagasaki; Esta investigación cumple con la Declaración de ARVO para el Uso de Animales en Investigación Oftalmológica y Visual. KJW es apoyado por el NIH subvenciones 5T32EY013933 y 5T32DK007647-20. VBM es apoyado por el NIH subvención K08EY020530.

1. Montar dispositivos para la inyección subretiniana <ol><li> Compre o haga una aguja de 100 m de diámetro de un tubo capilar de vidrio. Esto se puede hacer manualmente mediante el uso de un Sutter P-97 extractor de pipeta u otro equipo similar. El extremo del tubo capilar se calienta y se retiró hasta que alcanza el diámetro deseado (100 micras). Una aguja de diámetro más pequeño se puede utilizar para vectores de terapia génica, sin embargo, este es el diámetro recomendado para la inyección de células sin daño a las células o al ojo. En comparación con agujas de acero, la aguja capilar de vidrio tiene una punta muy fina, pero romo, para permitir la visualización de la inyección de fluido y el acceso al espacio subretiniano sin causar la rotura retiniana. Limpie estas agujas tiradas si es necesario el uso del 70% de etanol, y guárdelo en un recipiente estéril. A 15 cm estéril placa de cultivo de tejido con cinta adhesiva para sujetar las agujas en su lugar es una forma en que para mantener las agujas de inyección cubierto y en un ambiente estéril. En este punto, complete la puesta a punto dentro de la sala de operaciones donde el procedimiento se llevará a cabo. Es más fácil mantener todo el equipo en la sala quirúrgica en todo momento con el fin de que siga siendo estéril, sobre todo si este procedimiento se realiza dentro de una instalación de barrera. </li><li> Aspirar de silicona a la aguja de inyección y expulsar la silicona para dejar un revestimiento a lo largo de las paredes internas de la aguja. El revestimiento de silicona maximiza el paso de células y virus a través del orificio de agujas, que de otro modo se pegan a las paredes capilares de vidrio interiores. </li><li> Obtener una longitud de aproximadamente 8 cm de tubo de plástico estéril mediante la reducción de un 25 ¾ de calibre de recogida de sangre con luer-lock en el punto directamente después de la aguja (retirar la aguja de la tubería). </li><li> Llenar un 1 ml Sub-Q-26 5/8-gauge deslizamiento punta de la jeringa con solución salina estéril y retirar la aguja de la jeringa. </li><li> Coloque la aguja de inyección en el extremo cortado de la tubería de plástico y unir la jeringa al luer-lock en el otrofinal. </li><li> Aspirar solución salina estéril para llenar el espacio muerto de la aguja y el tubo capilar, expulsando algunos salina a través de la aguja para asegurarse de que esté correctamente colocado sin fugas. A continuación, se aspira una pequeña cantidad de aproximadamente 1 l de aire, en la punta de la aguja de inyección. Esto separa la solución salina desde el fluido de inyección y proporcionar una señal visual que indica el final de la inyección de fluido durante el procedimiento quirúrgico. El aparato de inyección debe mantenerse en una superficie limpia limpiados con etanol al 70% durante el procedimiento quirúrgico. Además, todo el equipo usado durante el procedimiento quirúrgico se debe limpiar antes y después con etanol al 70%, para la excepción de las agujas de inyección que ya debe mantenerse estéril y listo para su uso. Estas agujas deben desecharse después de la cirugía, y no volver a utilizarse. </li><li> Finalmente, aspirar solución inyectable que contiene el vector empaquetado deseado terapia génica viral o células madre. Esto se puede hacer portomando la solución de inyección en una punta de pipeta estéril, y después de pipeteado de la solución sobre la superficie de una placa de cultivo celular estéril. La solución puede ser fácilmente trasladada a la aguja de inyección con la jeringa. La cantidad necesaria variará dependiendo de la edad del ratón. Para nuestros propósitos utilizar post-natales día 5 ratones, que pueden ser inyectados con 0.5-0.8 l de fluido de inyección. Las cantidades más pequeñas, l 0,5 o menos, pueden ser utilizados para ratones más jóvenes y cantidades mayores, tales como 1 l, se puede utilizar para ratones adultos. El título viral o el número de células tiene que ser determinado con base en el virus / células se inyectan y el tejido objetivo deseado, como partículas virales de más o de células en un volumen pequeño puede conducir a la toxicidad para las células de la retina. En el vídeo, para propósitos de visualización, se han utilizado 1,5 l, una mayor cantidad de colorante que es necesario inyectar en el ojo. </li></ol> 2. Acceso al espacio subretiniano <ol><li> Dentro de la sala quirúrgica estéril,estabilizar o anestesiar al ratón de acuerdo con el protocolo de manipulación de animales aprobado localmente, que varían según la edad del ratón. Anestesia común para ratones adultos incluye el uso de gas isoflurano o una inyección intra-peritoneal de 0,1 ml/10g peso corporal de ketamina (100 mg / ml) y xilazina (20 mg / ml) en solución salina estéril. Para los ratones perinatales, las técnicas comunes de anestesia incluyen el uso de gas isoflurano o crioanestesia (hipotermia). Todas las técnicas de anestesia debe ser aprobado por el comité local de IACUC antes de su uso. Por lo general el uso post-natal días (P) 5 ratones, aunque técnicas similares puede ser aplicada a los ratones tan jóvenes como P0 o ratones adultos. El procedimiento quirúrgico no puede comenzar hasta que el ratón ha dejado de mover las extremidades y ya no responde a los pies pellizcos. Para los ratones perinatales, se vuelven notablemente más ligero en color, ya que el flujo de sangre se ralentizará, otra de las claves para saber que están completamente bajo anestesia. </li><li> En ratones perinatales, use tijeras Vannas consecutivos para make un aproximado de 1,5 mm de incisión a lo largo de la fisura tapa cerrada. Tenga cuidado de cortar a la sangría, donde el ojo naturalmente se abrirá en el futuro. Esto asegura que las tapas se cura y abrir correctamente durante el desarrollo del ratón. Una cuchilla quirúrgica puede ser utilizado para este propósito, aunque preferimos tijeras de Vannas ya que reducen el riesgo de perforar el ojo durante este procedimiento. En el video, las tijeras se utilizan para pinchar directamente y corte a lo largo del borde del párpado. Cuando el aprendizaje de esta técnica, el fórceps se debe utilizar para levantar el párpado antes de cortar y reducir el riesgo de dañar el ojo. </li><li> Separar los párpados con pinzas curvas para vestirse proptose los ojos y apretar los párpados ligeramente por debajo del ojo para mantenerlo proptosed para inyección. Si la incisión tapa hecha en el paso dos es demasiado grande, el ojo se deslice de nuevo bajo las tapas y prevenir la exposición adecuada durante el procedimiento de inyección. Para los ratones adultos, aplicando una ligera presión alrededor de los ojos con el Dr.essing fórceps puede mantener el ojo proptosed para inyección. </li><li> Hacer una pequeña incisión escleral en o posterior al ecuador del globo por el rascado de la superficie con una cuchilla de microcirugía 15-grado. Esta incisión debe ser suficientemente grande para pasar la punta de la aguja de inyección, pero no más que eso. Si se prefiere, una aguja pequeña, afilado tal como una aguja de acupuntura se puede utilizar para hacer la incisión en el espacio subretiniano en lugar de la hoja de microcirugía. En los animales con pigmentación oscura, de color marrón oscuro-pigmentada tejido (la coroides-epitelio pigmentario retinal) se hará visible en el punto de incisión. En más ligeros ratones pigmentados o albino, un rotulador quirúrgico de marcado puede ser aplicado a la punta de la hoja de microcirugía para dejar una mancha de tinta que indica el lugar de la incisión. Si transparente (vítreo) reflujos de fluido desde el lugar de la incisión, la cuchilla se coloca demasiado profunda y entró en la cavidad vítrea y el virus terapéutico o células pueden entrar en el espacio durante la inyección intravítrea. Para visualizatien fin, hemos hecho la incisión hasta este punto en el video. Todavía es posible completar una inyección subretiniana en este caso, sin embargo, el desprendimiento de la retina causado por la presencia del fluido de inyección no puede curarse completamente en este ratón. Por lo tanto, se debe tener cuidado para cortar solamente la superficie exterior del ojo y no a través de la retina antes de la inyección. </li><li> Con cuidado, inserte la aguja en el sitio de la incisión y avanzar en paralelo a la pared externa del ojo para entrar en el espacio subretiniano. Avanzando demasiado cerca de la pared exterior o demasiado profundo dentro del ojo vaya a dirigir la inyección en el lugar equivocado. El mejor método para comprender si la aguja está en la ubicación correcta es practicar la técnica. Practicar en ratones ligeramente pigmentadas o albino puede ayudar a que las inyecciones precisas y exactas en el espacio subretiniano. Esto es porque el fluido de la aguja y la inyección es visible dentro de estos ojos. </li><li> Aplique una leve presión sobre el émbolo de la jeringa ygin inyección del fluido deseado. Si la aguja está colocada correctamente en el espacio subretiniano, la contrapresión moderado se sentía. Si la aguja está dentro del vítreo, habrá contrapresión significativamente menor y potencialmente algo de reflujo del fluido durante la inyección. Si hay contrapresión importante, mantenga la aguja en su lugar por lo menos durante otros 15 segundos antes de retirar la aguja lentamente. Esto permitirá que la alta presión intraocular para igualar en lugar de a reflujo el virus inyecta o células de nuevo fuera del sitio de la incisión. Parte del aire y la solución salina puede ser inyectado en el espacio subretiniano debido al aumento de la presión requerida durante el procedimiento de inyección. Se debe tener cuidado de no sobre-inyectar aire o solución salina, ya que puede eliminar el virus inyecta o células del ojo. También es posible hacer que el desprendimiento de retina permanente de la presencia de demasiado líquido inyectado en el espacio subretiniano. Para fines de visualización, el exceso de tinte y se inyectó aire into el espacio subretiniano en el vídeo. Se puede ver claramente cómo parte del tinte se enjuaga de nuevo fuera del espacio subretinal si se inyecta demasiado, sino también cómo la burbuja de aire permanece dentro del espacio subretinal y no desaparece en el vítreo. Esto se utiliza para enfatizar que estas inyecciones eran todos a la ubicación correcta de los ojos, así que uno puede visualizar cómo la aguja debe entrar en el sitio de la incisión. Todas las inyecciones en el espacio subretiniano causar un desprendimiento de retina temporal debido a la presencia del fluido de inyección. Si el procedimiento de inyección se ha completado correctamente, este desprendimiento de retina temporal se cura dentro de 24 horas y los ratones pueden ser utilizados para todos los experimentos posteriores. El ojo puede permanecer suave durante aproximadamente una semana debido a la intervención quirúrgica, por lo que una segunda inyección se deben evitar durante este período de tiempo. </li><li> Para los ratones recién nacidos, utilice las pinzas curvas aderezo para empujar suavemente el ojo detrás de los párpados y en la órbita. Puede ser útilesperar un minuto con el fin de permitir que el virus a establecerse dentro del espacio subretinal y no causar que sea purgada del sitio de la incisión cuando se presiona suavemente el ojo de vuelta a su órbita. Después de la cirugía, una gota de 0,5% de bupivacaína (marcaína) diluido al 0,25% en solución salina estéril con una aguja de calibre 25-puede ser colocado en el sitio de inyección. Los ratones no muestran signos evidentes de angustia después de la cirugía subretiniana y el uso de bupivacaína como un analgésico tópico de larga duración ha sido amplia en los últimos tres años. Ratones siempre deben ser controlados después del procedimiento quirúrgico para observar cualquier signo de peligro, tales como las infecciones, inflamación, o una disminución en las actividades cotidianas del ratón. Si esto ocurre, el veterinario debe ser notificado y otras medicaciones de dolor como la buprenorfina (0,05 mg / kg) puede administrarse como una inyección intraperitoneal. </li><li> Despierta el ratón de la anestesia local, según el protocolo aprobado manipulación de animales. El ratón se debe mantener en un p calefacciónanuncio para mantener la temperatura normal del cuerpo como se despierta de la anestesia. El procedimiento quirúrgico debe tomar menos de cinco minutos para completar, sin contar el tiempo para el ratón para someterse a la anestesia. Por lo tanto, una resistencia de calentamiento no es necesario durante el procedimiento en sí, pero puede ser necesaria mientras que uno está aprendiendo la técnica como el procedimiento podría tener una mayor duración de tiempo. El ratón no se debe volver a colocar en una jaula limpia hasta que ha comenzado a moverse por sí mismo. Para los recién nacidos, pellizcos suaves dedos le ayudará para que puedan recuperarse completamente de la anestesia, y deben recuperar su color rosado y el movimiento antes de ser colocado de nuevo con la madre. Los ratones deben ser controlados a través del tiempo en busca de signos de malestar como se indica anteriormente. </li></ol>

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	<li>Abe, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+the+retina+using+pigment+epithelial+cell+transplantation.">Regeneration of the retina using pigment epithelial cell transplantation.</a> Nihon Ganka Gakkai Zasshi. 106, 778-803 (2002).</li><li>Jacobson, S. G., Cideciyan, A. V., Ratnakaram, R., Heon, E., Schwartz, S. B., Roman, A. J., Peden, M. C., Aleman, T. S., Boye, S. L., Sumaroka, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+therapy+for+Leber+congenital+amaurosis+caused+by+RPE65+mutations:+safety+and+efficacy+in+15+children+and+adults+followed+up+to+3+years.">Gene therapy for Leber congenital amaurosis caused by RPE65 mutations: safety and efficacy in 15 children and adults followed up to 3 years.</a> Arch. Ophthalmol. 130, 9-24 (2011).</li><li>Schwartz, S. D., Hubschman, J. P., Heilwell, G., Franco-Cardenas, V., Pan, C. K., Ostrick, R. M., Mickunas, E., Gay, R., Klimanskaya, I., Lanza, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell+trials+for+macular+degeneration:+a+preliminary+report.">Embryonic stem cell trials for macular degeneration: a preliminary report.</a> Lancet. 379, 713-720 (2012).</li><li>Wang, N. K., Tosi, J., Kasanuki, J. M., Chou, C. L., Kong, J., Parmalee, N., Wert, K. J., Allikmets, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+reprogrammed+embryonic+stem+cells+improves+visual+function+in+a+mouse+model+for+retinitis+pigmentosa.">Transplantation of reprogrammed embryonic stem cells improves visual function in a mouse model for retinitis pigmentosa.</a> Transplantation. 89, 911-919 (2010).</li><li>Song, B. J., Tsang, S. H., Lin, C. -. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+models+of+retinal+degeneration+and+targets+for+gene+therapy.">Genetic models of retinal degeneration and targets for gene therapy.</a> Gene Ther. Mol. Biol. 11, 229-262 (2007).</li><li>Tosi, J., Sancho-Pelluz, J., Davis, R. J., Hsu, C. W., Wolpert, K. V., Sengillo, J. D., Lin, C. S., Tsang, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentivirus-mediated+expression+of+cDNA+and+shRNA+slows+degeneration+in+retinitis+pigmentosa.">Lentivirus-mediated expression of cDNA and shRNA slows degeneration in retinitis pigmentosa.</a> Exp. Biol. Med. 236, 1211-1217 (2011).</li><li>Tucker, B. A., Park, I. H., Qi, S. D., Klassen, H. J., Jiang, C., Yao, J., Redenti, S., Daley, G. Q., Young, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+adult+mouse+iPS+cell-derived+photoreceptor+precursors+restores+retinal+structure+and+function+in+degenerative+mice.">Transplantation of adult mouse iPS cell-derived photoreceptor precursors restores retinal structure and function in degenerative mice.</a> PLoS One. 6, e189992 (2011).</li><li>Mahajan, V. B., Mondino, B. J., Tsang, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> A high-throughput Mouse Eye Phenomics System. , (2010).</li><li>Chang, B., Hawes, N. L., Hurd, R. E., Davisson, M. T., Nusinowitz, S., Heckenlively, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+degeneration+mutants+in+the+mouse.">Retinal degeneration mutants in the mouse.</a> Vision Res. 42, 517-525 (2002).</li><li>Hawes, N. L., Smith, R. S., Chang, B., Davisson, M., Heckenlively, J. R., John, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+fundus+photography+and+angiography:+a+catalogue+of+normal+and+mutant+phenotypes.">Mouse fundus photography and angiography: a catalogue of normal and mutant phenotypes.</a> Mol. Vis. 5, 22 (1999).</li><li>Won, J., Shi, L. Y., Hicks, W., Wang, J., Hurd, R., Naggert, J. K., Chang, B., Nishina, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+model+resources+for+vision+research.">Mouse model resources for vision research.</a> J. Ophthalmol. 2011, 391384 (2011).</li></ol>

No hay conflictos de interés declarado.

Esta técnica de vídeo proporciona instrucciones para completar el procedimiento de inyección subretiniana quirúrgica con éxito, y asegurar que el vector de terapia génica o de células madre se colocan en la posición necesaria para tratar eficazmente la enfermedad oftálmica. Esta técnica permite la focalización de las células de la retina tales como el RPE o fotorreceptores, puesto que coloca los vectores de terapia génica o tejidos derivados de células madre en la proximidad de estas células. Los métodos...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre </td><td> Empresa </td><td> Catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> 0.8-1.10 x 100 mm Tubo capilar (vidrio) </td><td> Kimble Glass, Inc. </td><td> 34502 99 </td><td></td></tr><tr><td> Flaming / Brown Micropipeta Puller </td><td> Sutter Instrument </td><td> P-97 </td><td> Narishige microforge se puede utilizar en su lugar. Catálogo # MF-900 </td></tr><tr><td> Sigmacote </td><td> Sigma Aldrich </td><td> SL2-25ML </td><td> Silicona </td></tr><tr><td> Fosfato de Dubecco salina tamponada con cloruro de calcio y cloruro de magnesio </td><td> Gibco-Invitrogen </td><td> 14040-133 </td><td></td></tr><tr><td> Safety-Lok 3/4G 25 x 12 &quot;, set de muestras de sangre </td><td> BD Vacutainer </td><td> 367298 </td><td></td></tr><tr><td> 1 ml Sub-Q 265/8G Slip-punta de la jeringa </td><td> Becton-Dickinson </td><td> 309597 </td><td></td></tr><tr><td> 0.5-10 l Finnpipette II-Volumen ajustable pipeteador </td><td> Fisherbrand </td><td> 21-377-815 </td><td></td></tr><tr><td> 1-200 mu l puntas biseladas Naturales </td><td> EE.UU. Scientific, Inc. </td><td> 1111-1700 </td><td></td></tr><tr><td> Discovery.V8 Microscopio estéreo </td><td> Zeiss </td><td> MC1500 </td><td></td></tr><tr><td> 60 mm x 15 mm Estilo de células tratadas placa de cultivo de poliestireno </td><td> Corning Incorporated </td><td> 430166 </td><td></td></tr><tr><td> Vannas rectas Tijeras </td><td> Storz Ophthalmics </td><td> E3383 S </td><td></td></tr><tr><td> Pinza Dressing curva con dientes delicados </td><td> Storz Ophthalmics </td><td> E1408 </td><td></td></tr><tr><td> 15 Grado Cuchillo Microcirugía </td><td> Wilsen Oftálmica Corp. </td><td> 091204 </td><td></td></tr><tr><td> La ketamina </td><td> Ketaset III </td><td> NADA # 45-290 </td><td></td></tr><tr><td> Xilazina </td><td> Lloyd Laboratorios </td><td> NADA # 139-236 </td><td></td></tr><tr><td> Bupivacaína (bupivacaína) </td><td> AstraZeneca </td><td> N / A </td><td></td></tr><tr><td> La buprenorfina </td><td> Sigma Aldrich </td><td> B9275 </td><td></td></tr></tbody></table>

subretinal injection of gene therapy vectors and stem cells in the perinatal mouse eye

La pérdida de visión afecta aproximadamente a 3,4 millones de personas en los Estados Unidos y se espera que aumente en los próximos años. 1 Recientemente, la terapia génica y el trasplante de células madre se han convertido en importantes herramientas terapéuticas para el tratamiento de la ceguera como resultado de las enfermedades degenerativas de retina. Varias formas de trasplante autólogo para la degeneración macular relacionada con la edad (AMD), como iris trasplante de células del epitelio pigmentario, han generado resultados alentadores, y los ensayos clínicos humanos han comenzado a otras formas de terapias con células madre y genes. 2 Estos incluyen RPE65 sustitución de genes terapia en pacientes con amaurosis congénita de Leber y un trasplante de células RPE humanas usando madre embrionarias (ES) de células en la enfermedad de Stargardt. 3-4 Ahora que hay vectores de terapia génica y células madre disponibles para el tratamiento de pacientes con enfermedades de la retina, es importante verificar estas terapias potenciales en modelos animales antes de aplicarIng. ellos en estudios con humanos. El ratón se ha convertido en un importante modelo científico para probar la eficacia terapéutica de los vectores de terapia génica y trasplante de células madre en el ojo. 5-8 En este artículo de vídeo, se presenta una técnica para inyectar vectores de terapia génica o células madre en el espacio subretiniano de el ojo del ratón mientras que minimiza el daño al tejido circundante.

Un dibujo del ojo del ratón se muestra con grandes estructuras marcadas para referencia, con flechas que muestran las ubicaciones de los procedimientos de inyección intravítrea tanto subretinal y quirúrgicos (puntas de flecha, Figura 1). Vectores de terapia génica, tales como el vector lentiviral lacZ (Figura 2), se puede inyectar el uso de estas ubicaciones. Además, las células madre, tales como células madre embrionarias de ratón (Figura 3), también...

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Subretinal Injection of Gene Therapy Vectors and Stem Cells in the Perinatal Mouse Eye

Esta técnica quirúrgica ilustra la inyección de vectores de terapia génica y las células madre en el espacio subretiniano del ojo del ratón.

Inyección subretiniana de vectores de terapia génica y células madre en el ojo del ratón

The loss of sight affects approximately 3.4 million people in the United States and is expected to increase in the upcoming years.1 Recently, gene therapy ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

33.1K vistas.  Columbia University. Esta técnica quirúrgica ilustra la inyección de vectores de terapia génica y las células madre en el espacio subretiniano del ojo del ratón.

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Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural connectivity form during development. In mice, retinofugal projections are arranged in a topographic manner and form eye-specific layers in the Lateral Geniculate Nucleus (dLGN) of the thalamus and the Superior Colliculus (SC). The development of these precise patterns of retinofugal projections has typically been studied by labeling populations of RGCs with fluorescent dyes and tracers, such as horseradish peroxidase1-4. However, these methods are too coarse to provide insight into developmental changes in individual RGC axonal arbor morphology that are the basis of retinotopic map formation. They also do not allow for the genetic manipulation of RGCs.
Recently, electroporation has become an effective method for providing precise spatial and temporal control for delivery of charged molecules into the retina5-11. Current retinal electroporation protocols do not allow for genetic manipulation and tracing of retinofugal projections of a single or small cluster of RGCs in postnatal mice. It has been argued that postnatal in vivo electroporation is not a viable method for transfecting RGCs since the labeling efficiency is extremely low and hence requires targeting at embryonic ages when RGC progenitors are undergoing differentiation and proliferation6. 
In this video we describe an in vivo electroporation protocol for targeted delivery of genes, shRNA, and fluorescent dextrans to murine RGCs postnatally. This technique provides a cost effective, fast and relatively easy platform for efficient screening of candidate genes involved in several aspects of neural development including axon retraction, branching, lamination, regeneration and synapse formation at various stages of circuit development. In summary we describe here a valuable tool which will provide further insights into the molecular mechanisms underlying sensory map development.

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

We demonstrate an in vivo electroporation protocol for transfecting single or small clusters of retinal ganglion cells (RGCs) and other retinal cell types in postnatal mice over a wide range of ages. The ability to label and genetically manipulate postnatal RGCs in vivo is a powerful tool for developmental studies.

La transfección de células de ratón del ganglio de la retina por In vivo La electroporación

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

Investigación

Neurociencias

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge. Gene targeting to generate constitutive or conditional loss of function knockouts remains cost and labor intensive, as well as time consuming. Adding to these challenges, retina expressed genes may have essential roles outside the retina leading to unintended confounds when using a knockout approach. Furthermore, the ability to ectopically express a gene in a gain of function experiment can be extremely valuable when attempting to identify a role in cell fate specification and/or terminal differentiation.
We present a method for the rapid and efficient incorporation of DNA plasmids into the neonatal mouse retina by electroporation. The application of short electrical impulses above a certain field strength results in a transient increase in plasma membrane permeability, facilitating the transfer of material across the membrane 1,2,3,4. Groundbreaking work demonstrated that electroporation could be utilized as a method of gene transfer into mammalian cells by inducing the formation of hydrophilic plasma membrane pores allowing the passage of highly charged DNA through the lipid bilayer 5. Continuous technical development has resulted in the viability of electroporation as a method for in vivo gene transfer in multiple mouse tissues including the retina, the method for which is described herein 6, 7, 8, 9, 10. 
DNA solution is injected into the subretinal space so that DNA is placed between the retinal pigmented epithelium and retina of the neonatal (P0) mouse and electrical pulses are applied using a tweezer electrode. The lateral placement of the eyes in the mouse allows for the easy orientation of the tweezer electrode to the necessary negative pole-DNA-retina-positive pole alignment. Extensive incorporation and expression of transferred genes can be identified by postnatal day 2 (P2). Due to the lack of significant lateral migration of cells in the retina, electroporated and non-electroporated regions are generated. Non-electroporated regions may serve as internal histological controls where appropriate. 
Retinal electroporation can be used to express a gene under a ubiquitous promoter, such as CAG, or to disrupt gene function using shRNA constructs or Cre-recombinase. More targeted expression can be achieved by designing constructs with cell specific gene promoters. Visualization of electroporated cells is achieved using bicistronic constructs expressing GFP or by co-electroporating a GFP expression construct. Furthermore, multiple constructs may be electroporated for the study of combinatorial gene effects or simultaneous gain and loss of function of different genes. Retinal electroporation may also be utilized for the analysis of genomic cis-regulatory elements by generating appropriate expression constructs and deletion mutants. Such experiments can be used to identify cis-regulatory regions sufficient or required for cell specific gene expression 11. Potential experiments are limited only by construct availability.

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

A method for the incorporation of plasmid DNA into murine retinal cells for the purpose of performing either gain- or loss of function studies in vivo is presented. This method capitalizes on the transient increase in permeability of cell plasma membranes induced by the application of an external electrical field.

En electroporación in vivo de la retina del ratón en desarrollo

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge.  Gene targeting to generate ...

Retinal Detachment Model in Rodents by Subretinal Injection of Sodium Hyaluronate

Subretinal injection of sodium hyaluronate is a widely accepted method of inducing retinal detachment (RD). However, the height and duration of RD or the occurrence of subretinal hemorrhage can affect photoreceptor cell death in the detached retina. Hence, it is advantageous to create reproducible RDs without subretinal hemorrhage for evaluating photoreceptor cell death. We modified a previously reported method to create bullous and persistent RDs in a reproducible location with rare occurrence of subretinal hemorrhage. The critical step of this modified method is the creation of a self-sealing scleral incision, which can prevent leakage of sodium hyaluronate after injection into the subretinal space. To make the self-sealing scleral incision, a scleral tunnel is created, followed by scleral penetration into the choroid with a 30 G needle. Although choroidal hemorrhage may occur during this step, astriction with a surgical spear reduces the rate of choroidal hemorrhage. This method allows a more reproducible and reliable model of photoreceptor death in diseases that involve RD such as rhegmatogenous RD, retinopathy of prematurity, diabetic retinopathy, central serous chorioretinopathy, and age-related macular degeneration (AMD).

Creating experimental retinal detachments with a reproducible and sustained height of detachment, and without subretinal hemorrhage, is important for studying the pathophysiology of photoreceptor cell loss in retinal disease and evaluating potential therapeutic interventions. Here, we report such a method in detail.

Desprendimiento de Retina modelo en roedores por inyección subretiniana de Hialuronato de Sodio

Subretinal injection of sodium hyaluronate is a widely accepted method of inducing retinal detachment (RD). However, the height and duration of RD or the ...

Medicina

In utero and ex vivo Electroporation for Gene Expression in Mouse Retinal Ganglion Cells

The retina and its sole output neuron, the retinal ganglion cell (RGC), comprise an excellent model in which to examine biological questions such as cell differentiation, axon guidance, retinotopic organization and synapse formation[1]. One drawback is the inability to efficiently and reliably manipulate gene expression in RGCs in vivo, especially in the otherwise accessible murine visual pathways. Transgenic mice can be used to manipulate gene expression, but this approach is often expensive, time consuming, and can produce unwanted side effects. In chick, in ovo electroporation is used to manipulate gene expression in RGCs for examining retina and RGC development. Although similar electroporation techniques have been developed in neonatal mouse pups[2], adult rats[3], and embryonic murine retinae in vitro[4], none of these strategies allow full characterization of RGC development and axon projections in vivo. To this end, we have developed two applications of electroporation, one in utero and the other ex vivo, to specifically target embryonic murine RGCs[5, 6]. 
With in utero retinal electroporation, we can misexpress or downregulate specific genes in RGCs and follow their axon projections through the visual pathways in vivo, allowing examination of guidance decisions at intermediate targets, such as the optic chiasm, or at target regions, such as the lateral geniculate nucleus. Perturbing gene expression in a subset of RGCs in an otherwise wild-type background facilitates an understanding of gene function throughout the retinal pathway. Additionally, we have developed a companion technique for analyzing RGC axon growth in vitro. We electroporate embryonic heads ex vivo, collect and incubate the whole retina, then prepare explants from these retinae several days later. Retinal explants can be used in a variety of in vitro assays in order to examine the response of electroporated RGC axons to guidance cues or other factors. In sum, this set of techniques enhances our ability to misexpress or downregulate genes in RGCs and should greatly aid studies examining RGC development and axon projections.

In utero and ex vivo Electroporation for Gene Expression in Mouse Retinal Ganglion Cells

Here we present two techniques for manipulating gene expression in murine retinal ganglion cells (RGCs) by in utero and ex vivo electroporation. These techniques enable one to examine how alterations in gene expression affect RGC development, axon guidance, and functional properties.

La electroporación in vivo en el útero y el ex de la expresión génica en células de ratón ganglionares retinianas

The retina and its sole output neuron, the retinal ganglion cell (RGC), comprise an excellent model in which to examine biological questions such as cell ...

Biología

Performing Subretinal Injections in Rodents to Deliver Retinal Pigment Epithelium Cells in Suspension

The conversion of light into electrical impulses occurs in the outer retina and is accomplished largely by rod and cone photoreceptors and retinal pigment epithelium (RPE) cells. RPE provide critical support for photoreceptors and death or dysfunction of RPE cells is characteristic of age-related macular degeneration (AMD), the leading cause of permanent vision loss in people age 55 and older. While no cure for AMD has been identified, implantation of healthy RPE in diseased eyes may prove to be an effective treatment, and large numbers of RPE cells can be readily generated from pluripotent stem cells. Several interesting questions regarding the safety and efficacy of RPE cell delivery can still be examined in animal models, and well-accepted protocols used to inject RPE have been developed. The technique described here has been used by multiple groups in various studies and involves first creating a hole in the eye with a sharp needle. Then a syringe with a blunt needle loaded with cells is inserted through the hole and passed through the vitreous until it gently touches the RPE. Using this injection method, which is relatively simple and requires minimal equipment, we achieve consistent and efficient integration of stem cell-derived RPE cells in between the host RPE that prevents significant amount of photoreceptor degeneration in animal models. While not part of the actual protocol, we also describe how to determine the extent of the trauma induced by the injection, and how to verify that the cells were injected into the subretinal space using in vivo imaging modalities. Finally, the use of this protocol is not limited to RPE cells; it may be used to inject any compound or cell into the subretinal space.

Here we present a community accepted protocol in multimedia format for subretinally injecting a bolus of RPE cells in rats and mice. This approach can be used for determining rescue potentials, safety profiles, and survival capacities of grafted RPE cells upon implantation in animal models of retinal degeneration.

Realizar Subretinal Inyecciones en roedores administrar células de la retina epitelio pigmentario en Suspensión

The conversion of light into electrical impulses occurs in the outer retina and is accomplished largely by rod and cone photoreceptors and retinal pigment ...

Limbal Approach-Subretinal Injection of Viral Vectors for Gene Therapy in Mice Retinal Pigment Epithelium

The eye is a small and enclosed organ which makes it an ideal target for gene therapy. Recently various strategies have been applied to gene therapy in retinopathies using non-viral and viral gene delivery to the retina and retinal pigment epithelium (RPE). Subretinal injection is the best approach to deliver viral vectors directly to RPE cells. Before the clinical trial of a gene therapy, it is inevitable to validate the efficacy of the therapy in animal models of various retinopathies. Thus, subretinal injection in mice becomes a fundamental technique for an ocular gene therapy. In this protocol, we provide the easy and replicable technique for subretinal injection of viral vectors to experimental mice. This technique is modified from the intravitreal injection, which is widely used technique in ophthalmology clinics. The representative results of RPE/choroid/scleral complex flat-mount will help to understand the efficacy of this technique and adjust the volume and titer of viral vectors for the extent of gene transduction.

Subretinal injection is a surgical technique for effective gene delivery to retinal pigment epithelium in the mouse eye. Here we describe an easy and replicable method for subretinal injection of viral vectors to retinal pigment epithelium in experimental mice.

Limbal Inyección-Enfoque Subretinal de vectores virales para terapia génica en ratones epitelio pigmentario de la retina

The eye is a small and enclosed organ which makes it an ideal target for gene therapy. Recently various strategies have been applied to gene therapy in ...

An Alternative and Validated Injection Method for Accessing the Subretinal Space via a Transcleral Posterior Approach

Subretinal injections have been successfully used in both humans and rodents to deliver therapeutic interventions of proteins, viral agents, and cells to the interphotoreceptor/subretinal compartment that has direct exposure to photoreceptors and the retinal pigment epithelium (RPE). Subretinal injections of plasminogen as well as recent preclinical and clinical trials have demonstrated safety and/or efficacy of delivering viral vectors and stem cells to individuals with advanced retinal disease. Mouse models of retinal disease, particularly hereditary retinal dystrophies, are essential for testing these therapies. The most common injection procedure in rodents is to use small transcorneal or transcleral incisions with an anterior approach to the retina. With this approach, the injection needle penetrates the neurosensory retina disrupting the underlying RPE and on insertion can easily nick the lens, causing lens opacification and impairment of noninvasive imaging. Accessing the subretinal space via a transcleral, posterior approach avoids these problems: the needle crosses the sclera approximately 0.5 mm from the optic nerve, without retinal penetration and avoids disrupting the vitreous. Collateral damage is limited to that associated with the focal sclerotomy and the effects of a transient, serous retinal detachment. The simplicity of the method minimizes ocular injury, ensures rapid retinal reattachment and recovery, and has a low failure rate. The minimal damage to the retina and RPE allows for clear assessment of the efficacy and direct effects of the therapeutic agents themselves. This manuscript describes a novel subretinal injection technique that can be used to target viral vectors, pharmacological agents, stem cells or induced pluripotent stem (iPS) cells to the subretinal space in mice with high efficacy, minimal damage, and fast recovery.

An Alternative and Validated Injection Method for Accessing the Subretinal Space via a Transcleral Posterior Approach

Subretinal injections are the most common technique for delivering large therapeutic agents such as proteins and viral vectors to photoreceptors and the retinal pigment epithelium. An alternative method in mice that successfully targets the subretinal space with minimal collateral damage and fast recovery times is described here.

Un método alternativo de inyección y validado para acceder al espacio subretiniano<i&gt; vía</i&gt; Un enfoque posterior transescleral

Subretinal injections have been successfully used in both humans and rodents to deliver therapeutic interventions of proteins, viral agents, and cells to ...

Ultrahigh Resolution Mouse Optical Coherence Tomography to Aid Intraocular Injection in Retinal Gene Therapy Research

HR-SD-OCT is utilized to monitor the progression of photoreceptor degeneration in live mouse models, assess the delivery of therapeutic agents into the subretinal space, and to evaluate toxicity and efficacy in vivo. HR-SD-OCT uses near infrared light (800-880 nm) and has optics specifically designed for the unique optics of the mouse eye with sub-2-micron axial resolution. Transgenic mouse models of outer retinal (photoreceptor) degeneration and controls were imaged to assess the disease progression. Pulled glass microneedles were used to deliver sub retinal injections of adeno-associated virus (AAV) or nanoparticles (NP) via a trans-scleral and trans-choroidal approach. Careful positioning of the needle into the subretinal space was required prior to a calibrated pressure injection, which delivers fluid into the sub retinal space. Real time subretinal surgery was conducted on our retinal imaging system (RIS). HR-SD-OCT demonstrated progressive uniform retinal degeneration due to expression of a toxic mutant human mutant rhodopsin (P347S) (RHOP347S) transgene in mice. HR-SD-OCT allows rigorous quantification of all the retinal layers. Outer nuclear layer (ONL) thickness and photoreceptor outer segment length (OSL) measurements correlate with photoreceptor vitality, degeneration, or rescue. The RIS delivery system allows real-time visualization of subretinal injections in neonatal (~P10-14) or adult mice, and HR-SD-OCT immediately determines success of delivery and maps areal extent. HR-SD-OCT is a powerful tool that can evaluate the success of subretinal surgery in mice, in addition to measuring vitality of photoreceptors in vivo. HR-SD-OCT can also be used to identify uniform animal cohorts to evaluate the extent of retinal degeneration, toxicity, and therapeutic rescue in preclinical gene therapy research studies.

Here we demonstrate a novel approach to using high resolution spectral-domain optical coherence tomography (HR-SD-OCT) to assist delivery of gene therapy agents into the subretinal space, assess its areal coverage, and characterize photoreceptor vitality.

Tomografía de coherencia óptica ultraalta resolución ratón para facilitar la inyección Intraocular en investigación de retina la terapia génica

HR-SD-OCT is utilized to monitor the progression of photoreceptor degeneration in live mouse models, assess the delivery of therapeutic agents into the ...

Subretinal Transplantation of Human Embryonic Stem Cell-Derived Retinal Tissue in a Feline Large Animal Model

Retinal degenerative (RD) conditions associated with photoreceptor loss such as age-related macular degeneration (AMD), retinitis pigmentosa (RP) and Leber Congenital Amaurosis (LCA) cause progressive and debilitating vision loss. There is an unmet need for therapies that can restore vision once photoreceptors have been lost. Transplantation of human pluripotent stem cell (hPSC)-derived retinal tissue (organoids) into the subretinal space of an eye with advanced RD brings retinal tissue sheets with thousands of healthy mutation-free photoreceptors and has a potential to treat most/all blinding diseases associated with photoreceptor degeneration with one approved protocol. Transplantation of fetal retinal tissue into the subretinal space of animal models and people with advanced RD has been developed successfully but cannot be used as a routine therapy due to ethical concerns and limited tissue supply. Large eye inherited retinal degeneration (IRD) animal models are valuable for developing vision restoration therapies utilizing advanced surgical approaches to transplant retinal cells/tissue into the subretinal space. The similarities in globe size, and photoreceptor distribution (e.g., presence of macula-like region area centralis) and availability of IRD models closely recapitulating human IRD would facilitate rapid translation of a promising therapy to the clinic. Presented here is a surgical technique of transplanting hPSC-derived retinal tissue into the subretinal space of a large animal model allowing assessment of this promising approach in animal models.

Presented here is a surgical technique for transplanting human pluripotent stem cell (hPSC)-derived retinal tissue into the subretinal space of a large animal model.

Trasplante subretiniano de tejido retiniano derivado de células madre embrionarias humanas en un modelo felino de animales grandes

Retinal degenerative (RD) conditions associated with photoreceptor loss such as age-related macular degeneration (AMD), retinitis pigmentosa (RP) and ...

Transpupillary-Guided Trans-Scleral Transplantation of Subretinal Grafts in a Retinal Degeneration Mouse Model

Transplantation of photoreceptor cells and retinal pigment&#160;epithelial (RPE) cells provide a potential therapy for retinal degeneration diseases. Subretinal transplantation of therapeutic donor cells into mouse recipients is challenging due to the limited surgical space allowed by the small volume of the mouse eye. We developed a trans-scleral surgical transplantation platform with direct transpupillary vision guidance to facilitate the subretinal delivery of exogenous cells in mouse recipients. The platform was tested using retinal cell suspensions and three-dimensional retinal sheets collected from rod-rich Rho::EGFP mice and cone-rich OPN1LW-EGFP;NRL-/- mice, respectively. Live/dead assay showed low cell mortality for both forms of donor cells. Retinal grafts were successfully delivered into the subretinal space of a mouse model of retinal degeneration, Rd1/NS, with minimum surgical complications as detected by multimodal confocal scanning laser ophthalmoscope (cSLO) imaging. Two months post-transplantation, histological staining demonstrated evidence of advanced maturation of the retinal grafts into &#39;adult&#39; rods and cones (by robust Rho::EGFP, S-opsin, and OPN1LW:EGFP expression, respectively) in the subretinal space. Here, we provide a surgical platform that can enable highly accurate subretinal delivery with a low rate of complications in mouse recipients. This technique offers precision and relative ease of skill acquisition. Furthermore, the technique could be used not only for studies of subretinal cell transplantation but also for other intraocular therapeutic studies including gene therapies.

This protocol presents a transpupillary vision-guided trans-scleral approach to safely and precisely deliver subretinal cellular grafts, with a low rate of surgical complications, in mouse recipients with or without retinal degeneration.

Trasplante transescleral guiado por transpupilar de injertos subretinianos en un modelo de ratón con degeneración retiniana

Transplantation of photoreceptor cells and retinal pigment&#160;epithelial (RPE) cells provide a potential therapy for retinal degeneration diseases. ...

Inyección subretiniana de vectores de terapia génica y células madre en el ojo del ratón

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