Name: subretinal injection of gene therapy vectors and stem cells in the perinatal mouse eye
Uploaded: 2012-11-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 9 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Subretinal Injection of Gene Therapy Vectors and Stem Cells in the Perinatal Mouse Eye at JoVE.com

La ricerca per prevenire la cecità, l&#39;assistenza sperimentale da Takayuki Nagasaki; Questa ricerca è conforme con la dichiarazione ARVO per l&#39;uso di animali in oftalmica e di ricerca visiva. KJW è supportato da sovvenzioni NIH 5T32EY013933 e 5T32DK007647-20. VBM è sostenuto da NIH sovvenzione K08EY020530.

1. Montare dispositivi per l&#39;iniezione sottoretinico <ol><li> Acquistare o fare un ago diametro 100 micron da un tubo capillare di vetro. Questo può essere fatto manualmente utilizzando un Sutter P-97 pipetta estrattore o altre apparecchiature simili. L&#39;estremità del tubo capillare viene riscaldato e tirato fino a raggiungere il diametro desiderato (100 micron). Un ago di diametro più piccolo può essere utilizzato per vettori di terapia genica, tuttavia, questo è il diametro raccomandato per l&#39;iniezione delle cellule senza danni alle cellule o l&#39;occhio. Rispetto agli aghi di acciaio, l&#39;ago capillare di vetro ha una punta molto fine, ma smussato, per consentire la visualizzazione del fluido di iniezione e l&#39;accesso allo spazio sottoretinico senza provocare rotture retiniche. Pulire questi aghi tirati, se necessario, si usa il 70% di etanolo, e conservare in un contenitore sterile. A cm 15 sterile piatto di coltura tissutale con nastro per tenere gli aghi in posizione è un modo in cui per mantenere gli aghi di iniezione coperto e in ambiente sterile. A questo punto, complete il set-up all&#39;interno della sala chirurgica in cui la procedura avrà luogo. E &#39;più facile mantenere tutte le apparecchiature in sala operatoria in ogni momento in modo che esso rimanga sterile, soprattutto se questa procedura viene effettuata all&#39;interno di una struttura barriera. </li><li> Aspirare silicone nell&#39;ago iniezione ed espellere il silicone per lasciare un rivestimento lungo le pareti interne dell&#39;ago. Il rivestimento siliconico massimizza il passaggio di cellule e virus attraverso il foro dell&#39;ago, che altrimenti si attaccano alle pareti interne dei capillari di vetro. </li><li> Ottenere un circa 8 cm di lunghezza del tubo di plastica sterile, tagliando a 25 ¾ calibro di raccolta del sangue insieme con luer-lock nel punto subito dopo l&#39;ago (rimuovere l&#39;ago dal tubo). </li><li> Riempire una ml 1 Sub-Q 26 5/8-gauge slip-siringa con soluzione salina sterile e rimuovere l&#39;ago dalla siringa. </li><li> Attaccare l&#39;ago dell&#39;iniezione al fine taglio del tubo in plastica e collegare la siringa al luer-lock all&#39;altrafine. </li><li> Aspirare soluzione salina sterile per riempire lo spazio morto nel tubo dell&#39;ago e capillare, espellendo alcuni salina attraverso l&#39;ago per assicurare che esso sia collegato correttamente senza perdite. Successivamente, aspirare una piccola, circa 1 quantità microlitri di aria, nella punta dell&#39;ago di iniezione. Questo separerà la soluzione salina dal fluido di iniezione e di fornire un segnale visivo che indica la fine del fluido di iniezione durante la procedura chirurgica. Il dispositivo di iniezione deve essere mantenuto su una superficie pulita pulito con etanolo al 70% durante la procedura chirurgica. Inoltre, tutte le attrezzature usate durante la procedura chirurgica deve essere pulito prima e dopo con etanolo 70%, per l&#39;eccezione degli aghi di iniezione che dovrebbe già essere mantenuta sterile e pronta per l&#39;uso. Questi aghi devono essere smaltiti dopo l&#39;intervento chirurgico, e non riutilizzati. </li><li> Infine, aspirare soluzione iniettabile contenente il desiderato confezionato vettore terapia genica virale o cellule staminali. Questo può essere fattoriprendendo la soluzione iniettabile in una punta di pipetta sterile, quindi pipettare la soluzione sulla superficie di un recipiente sterile coltura cellulare. La soluzione può essere facilmente aspirato nel ago per iniezione con la siringa. La quantità necessaria varierà a seconda dell&#39;età del mouse. Per i nostri scopi usiamo postnatali giorno 5 topi, che può essere iniettato con 0,5-0,8 ml di fluido di iniezione. Piccole quantità, 0,5 microlitri o meno, possono essere utilizzati per topi più giovani e grandi quantità, come 1 ml, può essere utilizzato per topi adulti. Il titolo virale o numero di celle deve essere determinato in base alle cellule / virus viene iniettato e il loro tessuto bersaglio desiderato, come troppe particelle virali o cellule in un piccolo volume può portare a tossicità per le cellule della retina. Nel video, per scopi di visualizzazione, abbiamo utilizzato 1,5 microlitri, una maggiore quantità di colorante del necessario per iniettare nell&#39;occhio. </li></ol> 2. Accesso spazio sottoretinico <ol><li> All&#39;interno della camera sterile chirurgica,stabilizzare o anestetizzare il mouse secondo il protocollo approvato animale localmente manipolazione, che variano per età del mouse. Anestesia comune per topi adulti include l&#39;uso di gas isoflurano o una iniezione intraperitoneale di 0,1 peso corporeo ml/10g di ketamina (100 mg / ml) e xilazina (20 mg / ml) in soluzione fisiologica sterile. Per topi perinatali, tecniche di anestesia comuni includono l&#39;uso di gas isoflurano o cryoanesthesia (ipotermia). Tutte le tecniche di anestesia deve essere approvato dal comitato locale IACUC prima dell&#39;uso. Usiamo tipicamente post-natale giorni (P) 5 topi, sebbene le tecniche simili possono essere applicate a topi giovani come P0 o per topi adulti. La procedura chirurgica non può iniziare fino a quando il mouse ha smesso muovere gli arti e non risponde più ai piedi pizzichi. Per i topi perinatali, diventeranno notevolmente di colore più chiaro in quanto il flusso di sangue rallenta, un altro tasto per sapere che sono completamente sotto anestesia. </li><li> Nei topi perinatali, usare le forbici Vännäs rette a make una incisione di circa 1,5 mm lungo la fessura coperchio chiuso. Fare attenzione a tagliare il rientro, dove l&#39;occhio, naturalmente, aperto in futuro. Questo assicura che i coperchi guarirà e aprire correttamente durante lo sviluppo del mouse. Una lama chirurgica può essere usato per questo scopo, anche se preferiamo forbici Vännäs quanto riducono il rischio di puntura nell&#39;occhio durante questa procedura. Nel video, le forbici sono state utilizzate per perforare e tagliare direttamente lungo il margine palpebrale. Quando imparare questa tecnica, pinza deve essere usato per sollevare la palpebra prima del taglio e ridurre il rischio di danneggiare l&#39;occhio. </li><li> Separare le palpebre con una pinza medicazione curve per proptose l&#39;occhio e pizzicare le palpebre un po &#39;sotto l&#39;occhio di tenerlo proptosed per l&#39;iniezione. Se il coperchio incisione fatta nel passaggio due è troppo grande, l&#39;occhio scivolare indietro sotto le palpebre e impedire l&#39;esposizione adeguata durante la procedura di iniezione. Per i topi adulti, applicando una leggera pressione intorno all&#39;occhio con il dressing pinza può tenere l&#39;occhio proptosed per l&#39;iniezione. </li><li> Fai una piccola incisione sclerale uguale o posteriore al equatore del globo da parte di graffiare la superficie con una lama di 15 gradi microchirurgia. Questa incisione dovrebbe essere solo abbastanza grande per passare la punta dell&#39;ago di iniezione, ma non più grande di questo. Se preferito, un piccolo ago appuntito come un ago di agopuntura può essere usato per fare questa incisione nello spazio sottoretinico posto della lama microchirurgia. Negli animali scura, un marrone scuro pigmentato tessuto (coroide-dell&#39;epitelio pigmentato retinico) diventerà visibile nel punto di incisione. In più leggeri topi pigmentati o albino, una penna chirurgica marcatura può essere applicato alla punta della lama microchirurgia lasciare un posto inchiostro indica il sito di incisione. Se chiare (vitreo) riflussi di fluido dal sito di incisione, la lama è stata posta troppo in profondità ed è entrato nella cavità vitrea e il virus terapeutico o cellule possono entrare nello spazio durante l&#39;iniezione intravitreale. Per visualizatisulla scopi, abbiamo fatto l&#39;incisione a questo punto del video. È ancora possibile eseguire una iniezione sottoretinico in questo caso però il distacco di retina causato dalla presenza del liquido di iniezione non può guarire completamente in questo mouse. Pertanto, occorre prestare attenzione a tagliare solo la superficie esterna dell&#39;occhio e non attraverso la retina prima dell&#39;iniezione. </li><li> Inserire con attenzione l&#39;ago iniezione nel sito di incisione e farlo avanzare parallelamente alla parete esterna dell&#39;occhio per entrare nello spazio sottoretinico. Avanzando troppo vicino alla parete esterna o troppo in profondità all&#39;interno dell&#39;occhio dirigerà l&#39;iniezione nella posizione sbagliata. Il metodo migliore per capire se l&#39;ago si trova nella posizione corretta è quello di praticare la tecnica. Praticare su topi leggermente pigmentate o albino può contribuire a rendere iniezioni precisi ed accurati nello spazio sottoretinico. Questo perché il fluido dell&#39;ago e l&#39;iniezione è visibile all&#39;interno di questi occhi. </li><li> Applicare una leggera pressione lo stantuffo della siringa e di esseregin iniezione del fluido desiderato. Se l&#39;ago è posizionato correttamente nello spazio sottoretinico, contropressione moderato si faranno sentire. Se l&#39;ago si trova all&#39;interno del vitreo, ci sarà significativamente meno contropressione e potenzialmente alcuni riflusso del fluido durante l&#39;iniezione. In caso di contropressione significativa, tenere l&#39;ago in posizione per almeno altri 15 secondi prima di estrarre l&#39;ago lentamente. Ciò permetterà l&#39;alta pressione intraoculare per equalizzare anziché riflusso del virus o cellule iniettate indietro il sito di incisione. Parte dell&#39;aria e soluzione salina può essere iniettato nello spazio sottoretinico a causa della maggiore pressione richiesta durante la procedura di iniezione. Si deve prestare attenzione a non sovra iniettare aria o soluzione salina, poiché può scovare iniettato il virus o cellule dall&#39;occhio. È anche possibile far sì permanenti distacco di retina dalla presenza di liquidi troppo iniettato nello spazio sottoretinico. Per scopi di visualizzazione, il colorante in eccesso e l&#39;aria è stata iniettata into spazio sottoretinico nel video. Si vede chiaramente come alcuni del colorante viene lavata posteriore dallo spazio sottoretinico se troppo è iniettato, ma anche come la bolla d&#39;aria rimane all&#39;interno dello spazio sottoretinico e non scompare nel vitreo. Questo è stato usato per sottolineare che queste iniezioni erano tutti nella corretta posizione degli occhi, così si può visualizzare come l&#39;ago deve entrare nel sito di incisione. Tutte le iniezioni nello spazio sottoretinico provocare un distacco della retina temporanea per la presenza del liquido di iniezione. Se la procedura di iniezione è completato correttamente, questo distacco di retina temporanea guarirà entro 24 ore e topi possono essere utilizzati per tutti i successivi esperimenti. L&#39;occhio può rimanere morbido per circa una settimana a causa della procedura chirurgica, quindi una seconda iniezione deve essere evitato durante questo periodo di tempo. </li><li> Per i topi neonati, utilizzare le pinze medicazione curve per spingere delicatamente l&#39;occhio dietro le palpebre e nell&#39;orbita. Può essere utileattendere per un minuto al fine di consentire al virus di stabilirsi nello spazio sottoretinico e non farla essere lavata dal sito di incisione quando spingendo leggermente l&#39;occhio nella sua orbita. Dopo l&#39;intervento chirurgico, una goccia di bupivacaina 0,5% (Marcaine) diluito al 0,25% in soluzione salina sterile da un ago calibro 25 può essere posizionato nel sito di iniezione. I topi non mostrano evidenti segni di sofferenza dopo l&#39;intervento chirurgico sottoretinico e l&#39;uso di bupivacaina come una lunga durata d&#39;azione analgesico topico è stato sufficiente per i tre anni precedenti. I topi devono sempre essere monitorati dopo l&#39;intervento chirurgico alla ricerca di eventuali segni di sofferenza, come infezioni, gonfiore, o una diminuzione delle attività quotidiane del mouse. Se questi si verificano, il veterinario deve essere notificata e altri farmaci per il dolore come la buprenorfina (0,05 mg / kg) può essere somministrato con una iniezione intraperitoneale. </li><li> Wake il mouse dall&#39;anestesia secondo il protocollo animale localmente riconosciuto. Il mouse deve essere mantenuto su una p riscaldamentoannuncio a mantenere la temperatura corporea normale, come si sveglia dall&#39;anestesia. La procedura chirurgica dovrebbe richiedere meno di cinque minuti per completare, senza contare il tempo per il mouse a subire l&#39;anestesia. Pertanto, una piastra elettrica non è necessario durante la procedura attuale, ma può essere necessaria quando si sta imparando la tecnica come la procedura potrebbe richiedere un periodo di tempo più lungo. Il mouse non deve essere rimesso in una gabbia pulita fino a quando non ha cominciato a muoversi da solo. Per i neonati, pizzichi punta dolci per aiuterà a recuperare pienamente l&#39;anestesia, e dovrebbero riprendere il loro colore rosa e il movimento prima di essere indietro con la madre. I topi devono essere monitorati nel tempo per rilevare eventuali segni di sofferenza come indicato in precedenza. </li></ol>

<ol>
	<li>Abe, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+the+retina+using+pigment+epithelial+cell+transplantation.">Regeneration of the retina using pigment epithelial cell transplantation.</a> Nihon Ganka Gakkai Zasshi. 106, 778-803 (2002).</li><li>Jacobson, S. G., Cideciyan, A. V., Ratnakaram, R., Heon, E., Schwartz, S. B., Roman, A. J., Peden, M. C., Aleman, T. S., Boye, S. L., Sumaroka, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+therapy+for+Leber+congenital+amaurosis+caused+by+RPE65+mutations:+safety+and+efficacy+in+15+children+and+adults+followed+up+to+3+years.">Gene therapy for Leber congenital amaurosis caused by RPE65 mutations: safety and efficacy in 15 children and adults followed up to 3 years.</a> Arch. Ophthalmol. 130, 9-24 (2011).</li><li>Schwartz, S. D., Hubschman, J. P., Heilwell, G., Franco-Cardenas, V., Pan, C. K., Ostrick, R. M., Mickunas, E., Gay, R., Klimanskaya, I., Lanza, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell+trials+for+macular+degeneration:+a+preliminary+report.">Embryonic stem cell trials for macular degeneration: a preliminary report.</a> Lancet. 379, 713-720 (2012).</li><li>Wang, N. K., Tosi, J., Kasanuki, J. M., Chou, C. L., Kong, J., Parmalee, N., Wert, K. J., Allikmets, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+reprogrammed+embryonic+stem+cells+improves+visual+function+in+a+mouse+model+for+retinitis+pigmentosa.">Transplantation of reprogrammed embryonic stem cells improves visual function in a mouse model for retinitis pigmentosa.</a> Transplantation. 89, 911-919 (2010).</li><li>Song, B. J., Tsang, S. H., Lin, C. -. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+models+of+retinal+degeneration+and+targets+for+gene+therapy.">Genetic models of retinal degeneration and targets for gene therapy.</a> Gene Ther. Mol. Biol. 11, 229-262 (2007).</li><li>Tosi, J., Sancho-Pelluz, J., Davis, R. J., Hsu, C. W., Wolpert, K. V., Sengillo, J. D., Lin, C. S., Tsang, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentivirus-mediated+expression+of+cDNA+and+shRNA+slows+degeneration+in+retinitis+pigmentosa.">Lentivirus-mediated expression of cDNA and shRNA slows degeneration in retinitis pigmentosa.</a> Exp. Biol. Med. 236, 1211-1217 (2011).</li><li>Tucker, B. A., Park, I. H., Qi, S. D., Klassen, H. J., Jiang, C., Yao, J., Redenti, S., Daley, G. Q., Young, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+adult+mouse+iPS+cell-derived+photoreceptor+precursors+restores+retinal+structure+and+function+in+degenerative+mice.">Transplantation of adult mouse iPS cell-derived photoreceptor precursors restores retinal structure and function in degenerative mice.</a> PLoS One. 6, e189992 (2011).</li><li>Mahajan, V. B., Mondino, B. J., Tsang, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> A high-throughput Mouse Eye Phenomics System. , (2010).</li><li>Chang, B., Hawes, N. L., Hurd, R. E., Davisson, M. T., Nusinowitz, S., Heckenlively, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+degeneration+mutants+in+the+mouse.">Retinal degeneration mutants in the mouse.</a> Vision Res. 42, 517-525 (2002).</li><li>Hawes, N. L., Smith, R. S., Chang, B., Davisson, M., Heckenlively, J. R., John, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+fundus+photography+and+angiography:+a+catalogue+of+normal+and+mutant+phenotypes.">Mouse fundus photography and angiography: a catalogue of normal and mutant phenotypes.</a> Mol. Vis. 5, 22 (1999).</li><li>Won, J., Shi, L. Y., Hicks, W., Wang, J., Hurd, R., Naggert, J. K., Chang, B., Nishina, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+model+resources+for+vision+research.">Mouse model resources for vision research.</a> J. Ophthalmol. 2011, 391384 (2011).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Questa tecnica video fornisce istruzioni su come completare la procedura chirurgica sottoretinico iniezione successo, e garantire che il vettore terapia genica o le cellule staminali sono collocati nella posizione necessaria per trattare efficacemente la malattia oftalmica. Questa tecnica permette di targeting di cellule retiniche quali la RPE o fotorecettori, in quanto pone i vettori per terapia genica o cellule staminali derivate da tessuti in prossimità di queste cellule. I metodi precedenti coinvolti iniezioni intr...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome </td><td> Azienda </td><td> Catalogo </td><td> Commenti </td></tr><tr><td> 0,8-1,10 x 100 mm Tubo capillare (vetro) </td><td> Kimble Glass, Inc. </td><td> 34502 99 </td><td></td></tr><tr><td> Flaming / Brown Micropipetta Puller </td><td> Sutter Instrument </td><td> P-97 </td><td> Narishige microforgia può essere utilizzato in sostituzione. Catalog # MF-900 </td></tr><tr><td> Sigmacote </td><td> Sigma Aldrich </td><td> SL2-25ML </td><td> Silicone </td></tr><tr><td> Fosfato Dubecco di soluzione salina tamponata con cloruro di calcio e cloruro di magnesio </td><td> Gibco-Invitrogen </td><td> 14040-133 </td><td></td></tr><tr><td> Sicurezza-Lok 25 3/4G x 12 &quot;; Imposta il prelievo di sangue </td><td> BD Vacutainer </td><td> 367298 </td><td></td></tr><tr><td> 1 ml Sub-Q 265/8G Slip-Tip Siringa </td><td> Becton-Dickinson </td><td> 309597 </td><td></td></tr><tr><td> 0,5-10 ul Finnpipette II-Volume regolabile pipettatura </td><td> FISHERBRAND </td><td> 21-377-815 </td><td></td></tr><tr><td> 1-200 ul Consigli naturali smussati </td><td> USA Scientific, Inc. </td><td> 1111-1700 </td><td></td></tr><tr><td> Discovery.V8 Microscopio Stereo </td><td> Zeiss </td><td> MC1500 </td><td></td></tr><tr><td> 60 mm x 15 mm Stile trattato cellulare Dish polistirene Cultura </td><td> Corning Incorporated </td><td> 430166 </td><td></td></tr><tr><td> Forbici Vännäs dritti </td><td> Storz Ophthalmics </td><td> E3383 S </td><td></td></tr><tr><td> Pinze curve Dressing con dentellature Delicate </td><td> Storz Ophthalmics </td><td> E1408 </td><td></td></tr><tr><td> 15 Tipo Coltello Microchirurgia </td><td> Wilssu oftalmica Corp. </td><td> 091204 </td><td></td></tr><tr><td> Ketamina </td><td> Ketaset III </td><td> NADA # 45-290 </td><td></td></tr><tr><td> Xylazina </td><td> Lloyd Laboratories </td><td> NADA # 139-236 </td><td></td></tr><tr><td> Bupivacaina (Marcaine) </td><td> AstraZeneca </td><td> N / A </td><td></td></tr><tr><td> Buprenorfina </td><td> Sigma Aldrich </td><td> B9275 </td><td></td></tr></tbody></table>

subretinal injection of gene therapy vectors and stem cells in the perinatal mouse eye

La perdita della vista colpisce circa 3,4 milioni di persone negli Stati Uniti e dovrebbe aumentare nei prossimi anni. 1 Recentemente, la terapia genica e trapianto di cellule staminali sono diventate fondamentali strumenti terapeutici per la cura della cecità derivante da malattie degenerative della retina. Diverse forme di trapianto autologo di età degenerazione maculare (AMD), come il trapianto di cellule del pigmento epiteliale dell&#39;iride, hanno dato risultati incoraggianti, e studi clinici hanno iniziato ad altre forme di terapie geniche e cellulari staminali. 2 Questi includono RPE65 sostituzione del gene terapia in pazienti con amaurosi congenita di Leber e un trapianto di cellule RPE utilizzando umane staminali embrionali (ES) cellule nella malattia di Stargardt. 3-4 Ora che sono vettori di terapia genica e cellule staminali disponibili per il trattamento di pazienti con malattie retiniche, è importante verificare questi potenziali terapie in modelli animali prima di applicarezione in studi sull&#39;uomo. Il mouse è diventato un importante modello scientifico per testare l&#39;efficacia terapeutica di vettori di terapia genica e trapianto di cellule staminali negli occhi. 5-8 questo articolo video, vi presentiamo una tecnica per iniettare vettori di terapia genica e cellule staminali nello spazio sottoretinico di l&#39;occhio del mouse riducendo i danni al tessuto circostante.

Un disegno dell&#39;occhio del mouse viene visualizzata con le strutture principali etichettati come riferimento, con le frecce che mostrano le posizioni per le procedure di iniezione sia intravitreali e sottoretinico chirurgici (punte di freccia, figura 1). Vettori di terapia genica, quali il vettore lentivirale lacZ (Figura 2), può essere iniettato usando queste posizioni. Inoltre, le cellule staminali di topo, come le cellule staminali embrionali (Figura 3),</strong...

Watch this Scientific Journal Video about Subretinal Injection of Gene Therapy Vectors and Stem Cells in the Perinatal Mouse Eye at JoVE.com

Subretinal Injection of Gene Therapy Vectors and Stem Cells in the Perinatal Mouse Eye

Questa tecnica chirurgica illustra l&#39;iniezione di vettori di terapia genica e cellule staminali nello spazio sottoretinico dell&#39;occhio mouse.

Iniezione sottoretinico di vettori di terapia genica e cellule staminali nel Eye mouse

The loss of sight affects approximately 3.4 million people in the United States and is expected to increase in the upcoming years.1 Recently, gene therapy ...

subretinal-injection-gene-therapy-vectors-stem-cells-perinatal-mouse

Research

JoVE Journal

Medicine

33.1K Views.  Columbia University. Questa tecnica chirurgica illustra l'iniezione di vettori di terapia genica e cellule staminali nello spazio sottoretinico dell'occhio mouse.

Video: Subretinal Injection of Gene Therapy Vectors and Stem Cells in the Perinatal Mouse Eye

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural connectivity form during development. In mice, retinofugal projections are arranged in a topographic manner and form eye-specific layers in the Lateral Geniculate Nucleus (dLGN) of the thalamus and the Superior Colliculus (SC). The development of these precise patterns of retinofugal projections has typically been studied by labeling populations of RGCs with fluorescent dyes and tracers, such as horseradish peroxidase1-4. However, these methods are too coarse to provide insight into developmental changes in individual RGC axonal arbor morphology that are the basis of retinotopic map formation. They also do not allow for the genetic manipulation of RGCs.
Recently, electroporation has become an effective method for providing precise spatial and temporal control for delivery of charged molecules into the retina5-11. Current retinal electroporation protocols do not allow for genetic manipulation and tracing of retinofugal projections of a single or small cluster of RGCs in postnatal mice. It has been argued that postnatal in vivo electroporation is not a viable method for transfecting RGCs since the labeling efficiency is extremely low and hence requires targeting at embryonic ages when RGC progenitors are undergoing differentiation and proliferation6. 
In this video we describe an in vivo electroporation protocol for targeted delivery of genes, shRNA, and fluorescent dextrans to murine RGCs postnatally. This technique provides a cost effective, fast and relatively easy platform for efficient screening of candidate genes involved in several aspects of neural development including axon retraction, branching, lamination, regeneration and synapse formation at various stages of circuit development. In summary we describe here a valuable tool which will provide further insights into the molecular mechanisms underlying sensory map development.

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

We demonstrate an in vivo electroporation protocol for transfecting single or small clusters of retinal ganglion cells (RGCs) and other retinal cell types in postnatal mice over a wide range of ages. The ability to label and genetically manipulate postnatal RGCs in vivo is a powerful tool for developmental studies.

Trasfezione delle cellule gangliari della retina di topo In vivo Elettroporazione

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

Ricerca

Neuroscienze

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge. Gene targeting to generate constitutive or conditional loss of function knockouts remains cost and labor intensive, as well as time consuming. Adding to these challenges, retina expressed genes may have essential roles outside the retina leading to unintended confounds when using a knockout approach. Furthermore, the ability to ectopically express a gene in a gain of function experiment can be extremely valuable when attempting to identify a role in cell fate specification and/or terminal differentiation.
We present a method for the rapid and efficient incorporation of DNA plasmids into the neonatal mouse retina by electroporation. The application of short electrical impulses above a certain field strength results in a transient increase in plasma membrane permeability, facilitating the transfer of material across the membrane 1,2,3,4. Groundbreaking work demonstrated that electroporation could be utilized as a method of gene transfer into mammalian cells by inducing the formation of hydrophilic plasma membrane pores allowing the passage of highly charged DNA through the lipid bilayer 5. Continuous technical development has resulted in the viability of electroporation as a method for in vivo gene transfer in multiple mouse tissues including the retina, the method for which is described herein 6, 7, 8, 9, 10. 
DNA solution is injected into the subretinal space so that DNA is placed between the retinal pigmented epithelium and retina of the neonatal (P0) mouse and electrical pulses are applied using a tweezer electrode. The lateral placement of the eyes in the mouse allows for the easy orientation of the tweezer electrode to the necessary negative pole-DNA-retina-positive pole alignment. Extensive incorporation and expression of transferred genes can be identified by postnatal day 2 (P2). Due to the lack of significant lateral migration of cells in the retina, electroporated and non-electroporated regions are generated. Non-electroporated regions may serve as internal histological controls where appropriate. 
Retinal electroporation can be used to express a gene under a ubiquitous promoter, such as CAG, or to disrupt gene function using shRNA constructs or Cre-recombinase. More targeted expression can be achieved by designing constructs with cell specific gene promoters. Visualization of electroporated cells is achieved using bicistronic constructs expressing GFP or by co-electroporating a GFP expression construct. Furthermore, multiple constructs may be electroporated for the study of combinatorial gene effects or simultaneous gain and loss of function of different genes. Retinal electroporation may also be utilized for the analysis of genomic cis-regulatory elements by generating appropriate expression constructs and deletion mutants. Such experiments can be used to identify cis-regulatory regions sufficient or required for cell specific gene expression 11. Potential experiments are limited only by construct availability.

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

A method for the incorporation of plasmid DNA into murine retinal cells for the purpose of performing either gain- or loss of function studies in vivo is presented. This method capitalizes on the transient increase in permeability of cell plasma membranes induced by the application of an external electrical field.

In elettroporazione in vivo di Retina topo in via di sviluppo

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge.  Gene targeting to generate ...

Retinal Detachment Model in Rodents by Subretinal Injection of Sodium Hyaluronate

Subretinal injection of sodium hyaluronate is a widely accepted method of inducing retinal detachment (RD). However, the height and duration of RD or the occurrence of subretinal hemorrhage can affect photoreceptor cell death in the detached retina. Hence, it is advantageous to create reproducible RDs without subretinal hemorrhage for evaluating photoreceptor cell death. We modified a previously reported method to create bullous and persistent RDs in a reproducible location with rare occurrence of subretinal hemorrhage. The critical step of this modified method is the creation of a self-sealing scleral incision, which can prevent leakage of sodium hyaluronate after injection into the subretinal space. To make the self-sealing scleral incision, a scleral tunnel is created, followed by scleral penetration into the choroid with a 30 G needle. Although choroidal hemorrhage may occur during this step, astriction with a surgical spear reduces the rate of choroidal hemorrhage. This method allows a more reproducible and reliable model of photoreceptor death in diseases that involve RD such as rhegmatogenous RD, retinopathy of prematurity, diabetic retinopathy, central serous chorioretinopathy, and age-related macular degeneration (AMD).

Creating experimental retinal detachments with a reproducible and sustained height of detachment, and without subretinal hemorrhage, is important for studying the pathophysiology of photoreceptor cell loss in retinal disease and evaluating potential therapeutic interventions. Here, we report such a method in detail.

Distacco della retina Modello in Roditori da iniezione sottoretinico di ialuronato di sodio

Subretinal injection of sodium hyaluronate is a widely accepted method of inducing retinal detachment (RD). However, the height and duration of RD or the ...

Medicina

In utero and ex vivo Electroporation for Gene Expression in Mouse Retinal Ganglion Cells

The retina and its sole output neuron, the retinal ganglion cell (RGC), comprise an excellent model in which to examine biological questions such as cell differentiation, axon guidance, retinotopic organization and synapse formation[1]. One drawback is the inability to efficiently and reliably manipulate gene expression in RGCs in vivo, especially in the otherwise accessible murine visual pathways. Transgenic mice can be used to manipulate gene expression, but this approach is often expensive, time consuming, and can produce unwanted side effects. In chick, in ovo electroporation is used to manipulate gene expression in RGCs for examining retina and RGC development. Although similar electroporation techniques have been developed in neonatal mouse pups[2], adult rats[3], and embryonic murine retinae in vitro[4], none of these strategies allow full characterization of RGC development and axon projections in vivo. To this end, we have developed two applications of electroporation, one in utero and the other ex vivo, to specifically target embryonic murine RGCs[5, 6]. 
With in utero retinal electroporation, we can misexpress or downregulate specific genes in RGCs and follow their axon projections through the visual pathways in vivo, allowing examination of guidance decisions at intermediate targets, such as the optic chiasm, or at target regions, such as the lateral geniculate nucleus. Perturbing gene expression in a subset of RGCs in an otherwise wild-type background facilitates an understanding of gene function throughout the retinal pathway. Additionally, we have developed a companion technique for analyzing RGC axon growth in vitro. We electroporate embryonic heads ex vivo, collect and incubate the whole retina, then prepare explants from these retinae several days later. Retinal explants can be used in a variety of in vitro assays in order to examine the response of electroporated RGC axons to guidance cues or other factors. In sum, this set of techniques enhances our ability to misexpress or downregulate genes in RGCs and should greatly aid studies examining RGC development and axon projections.

In utero and ex vivo Electroporation for Gene Expression in Mouse Retinal Ganglion Cells

Here we present two techniques for manipulating gene expression in murine retinal ganglion cells (RGCs) by in utero and ex vivo electroporation. These techniques enable one to examine how alterations in gene expression affect RGC development, axon guidance, and functional properties.

In elettroporazione in vivo ed ex utero per l&#39;espressione genica in cellule gangliari della retina del mouse

The retina and its sole output neuron, the retinal ganglion cell (RGC), comprise an excellent model in which to examine biological questions such as cell ...

Biologia

Performing Subretinal Injections in Rodents to Deliver Retinal Pigment Epithelium Cells in Suspension

The conversion of light into electrical impulses occurs in the outer retina and is accomplished largely by rod and cone photoreceptors and retinal pigment epithelium (RPE) cells. RPE provide critical support for photoreceptors and death or dysfunction of RPE cells is characteristic of age-related macular degeneration (AMD), the leading cause of permanent vision loss in people age 55 and older. While no cure for AMD has been identified, implantation of healthy RPE in diseased eyes may prove to be an effective treatment, and large numbers of RPE cells can be readily generated from pluripotent stem cells. Several interesting questions regarding the safety and efficacy of RPE cell delivery can still be examined in animal models, and well-accepted protocols used to inject RPE have been developed. The technique described here has been used by multiple groups in various studies and involves first creating a hole in the eye with a sharp needle. Then a syringe with a blunt needle loaded with cells is inserted through the hole and passed through the vitreous until it gently touches the RPE. Using this injection method, which is relatively simple and requires minimal equipment, we achieve consistent and efficient integration of stem cell-derived RPE cells in between the host RPE that prevents significant amount of photoreceptor degeneration in animal models. While not part of the actual protocol, we also describe how to determine the extent of the trauma induced by the injection, and how to verify that the cells were injected into the subretinal space using in vivo imaging modalities. Finally, the use of this protocol is not limited to RPE cells; it may be used to inject any compound or cell into the subretinal space.

Here we present a community accepted protocol in multimedia format for subretinally injecting a bolus of RPE cells in rats and mice. This approach can be used for determining rescue potentials, safety profiles, and survival capacities of grafted RPE cells upon implantation in animal models of retinal degeneration.

Esecuzione sottoretinico Iniezioni in roditori di agire cellule retiniche epitelio pigmentato in sospensione

The conversion of light into electrical impulses occurs in the outer retina and is accomplished largely by rod and cone photoreceptors and retinal pigment ...

Limbal Approach-Subretinal Injection of Viral Vectors for Gene Therapy in Mice Retinal Pigment Epithelium

The eye is a small and enclosed organ which makes it an ideal target for gene therapy. Recently various strategies have been applied to gene therapy in retinopathies using non-viral and viral gene delivery to the retina and retinal pigment epithelium (RPE). Subretinal injection is the best approach to deliver viral vectors directly to RPE cells. Before the clinical trial of a gene therapy, it is inevitable to validate the efficacy of the therapy in animal models of various retinopathies. Thus, subretinal injection in mice becomes a fundamental technique for an ocular gene therapy. In this protocol, we provide the easy and replicable technique for subretinal injection of viral vectors to experimental mice. This technique is modified from the intravitreal injection, which is widely used technique in ophthalmology clinics. The representative results of RPE/choroid/scleral complex flat-mount will help to understand the efficacy of this technique and adjust the volume and titer of viral vectors for the extent of gene transduction.

Subretinal injection is a surgical technique for effective gene delivery to retinal pigment epithelium in the mouse eye. Here we describe an easy and replicable method for subretinal injection of viral vectors to retinal pigment epithelium in experimental mice.

Limbare Approccio-sottoretinico iniezione di vettori virali per la terapia genica nei topi retina epitelio pigmentato

The eye is a small and enclosed organ which makes it an ideal target for gene therapy. Recently various strategies have been applied to gene therapy in ...

An Alternative and Validated Injection Method for Accessing the Subretinal Space via a Transcleral Posterior Approach

Subretinal injections have been successfully used in both humans and rodents to deliver therapeutic interventions of proteins, viral agents, and cells to the interphotoreceptor/subretinal compartment that has direct exposure to photoreceptors and the retinal pigment epithelium (RPE). Subretinal injections of plasminogen as well as recent preclinical and clinical trials have demonstrated safety and/or efficacy of delivering viral vectors and stem cells to individuals with advanced retinal disease. Mouse models of retinal disease, particularly hereditary retinal dystrophies, are essential for testing these therapies. The most common injection procedure in rodents is to use small transcorneal or transcleral incisions with an anterior approach to the retina. With this approach, the injection needle penetrates the neurosensory retina disrupting the underlying RPE and on insertion can easily nick the lens, causing lens opacification and impairment of noninvasive imaging. Accessing the subretinal space via a transcleral, posterior approach avoids these problems: the needle crosses the sclera approximately 0.5 mm from the optic nerve, without retinal penetration and avoids disrupting the vitreous. Collateral damage is limited to that associated with the focal sclerotomy and the effects of a transient, serous retinal detachment. The simplicity of the method minimizes ocular injury, ensures rapid retinal reattachment and recovery, and has a low failure rate. The minimal damage to the retina and RPE allows for clear assessment of the efficacy and direct effects of the therapeutic agents themselves. This manuscript describes a novel subretinal injection technique that can be used to target viral vectors, pharmacological agents, stem cells or induced pluripotent stem (iPS) cells to the subretinal space in mice with high efficacy, minimal damage, and fast recovery.

An Alternative and Validated Injection Method for Accessing the Subretinal Space via a Transcleral Posterior Approach

Subretinal injections are the most common technique for delivering large therapeutic agents such as proteins and viral vectors to photoreceptors and the retinal pigment epithelium. An alternative method in mice that successfully targets the subretinal space with minimal collateral damage and fast recovery times is described here.

Un metodo alternativo e validate iniezione per l&#39;accesso ai sottoretinico Spazio<i&gt; via</i&gt; Un approccio Transcleral posteriore

Subretinal injections have been successfully used in both humans and rodents to deliver therapeutic interventions of proteins, viral agents, and cells to ...

Ultrahigh Resolution Mouse Optical Coherence Tomography to Aid Intraocular Injection in Retinal Gene Therapy Research

HR-SD-OCT is utilized to monitor the progression of photoreceptor degeneration in live mouse models, assess the delivery of therapeutic agents into the subretinal space, and to evaluate toxicity and efficacy in vivo. HR-SD-OCT uses near infrared light (800-880 nm) and has optics specifically designed for the unique optics of the mouse eye with sub-2-micron axial resolution. Transgenic mouse models of outer retinal (photoreceptor) degeneration and controls were imaged to assess the disease progression. Pulled glass microneedles were used to deliver sub retinal injections of adeno-associated virus (AAV) or nanoparticles (NP) via a trans-scleral and trans-choroidal approach. Careful positioning of the needle into the subretinal space was required prior to a calibrated pressure injection, which delivers fluid into the sub retinal space. Real time subretinal surgery was conducted on our retinal imaging system (RIS). HR-SD-OCT demonstrated progressive uniform retinal degeneration due to expression of a toxic mutant human mutant rhodopsin (P347S) (RHOP347S) transgene in mice. HR-SD-OCT allows rigorous quantification of all the retinal layers. Outer nuclear layer (ONL) thickness and photoreceptor outer segment length (OSL) measurements correlate with photoreceptor vitality, degeneration, or rescue. The RIS delivery system allows real-time visualization of subretinal injections in neonatal (~P10-14) or adult mice, and HR-SD-OCT immediately determines success of delivery and maps areal extent. HR-SD-OCT is a powerful tool that can evaluate the success of subretinal surgery in mice, in addition to measuring vitality of photoreceptors in vivo. HR-SD-OCT can also be used to identify uniform animal cohorts to evaluate the extent of retinal degeneration, toxicity, and therapeutic rescue in preclinical gene therapy research studies.

Here we demonstrate a novel approach to using high resolution spectral-domain optical coherence tomography (HR-SD-OCT) to assist delivery of gene therapy agents into the subretinal space, assess its areal coverage, and characterize photoreceptor vitality.

Tomografia ottica di coerenza di risoluzione ultraelevata Mouse per aiutare l'iniezione intraoculare nella ricerca retinica terapia genica

HR-SD-OCT is utilized to monitor the progression of photoreceptor degeneration in live mouse models, assess the delivery of therapeutic agents into the ...

Subretinal Transplantation of Human Embryonic Stem Cell-Derived Retinal Tissue in a Feline Large Animal Model

Retinal degenerative (RD) conditions associated with photoreceptor loss such as age-related macular degeneration (AMD), retinitis pigmentosa (RP) and Leber Congenital Amaurosis (LCA) cause progressive and debilitating vision loss. There is an unmet need for therapies that can restore vision once photoreceptors have been lost. Transplantation of human pluripotent stem cell (hPSC)-derived retinal tissue (organoids) into the subretinal space of an eye with advanced RD brings retinal tissue sheets with thousands of healthy mutation-free photoreceptors and has a potential to treat most/all blinding diseases associated with photoreceptor degeneration with one approved protocol. Transplantation of fetal retinal tissue into the subretinal space of animal models and people with advanced RD has been developed successfully but cannot be used as a routine therapy due to ethical concerns and limited tissue supply. Large eye inherited retinal degeneration (IRD) animal models are valuable for developing vision restoration therapies utilizing advanced surgical approaches to transplant retinal cells/tissue into the subretinal space. The similarities in globe size, and photoreceptor distribution (e.g., presence of macula-like region area centralis) and availability of IRD models closely recapitulating human IRD would facilitate rapid translation of a promising therapy to the clinic. Presented here is a surgical technique of transplanting hPSC-derived retinal tissue into the subretinal space of a large animal model allowing assessment of this promising approach in animal models.

Presented here is a surgical technique for transplanting human pluripotent stem cell (hPSC)-derived retinal tissue into the subretinal space of a large animal model.

Trapianto sottoretinico di tessuto retinico derivato da cellule staminali embrionali umane in un modello animale felino di grandi dimensioni

Retinal degenerative (RD) conditions associated with photoreceptor loss such as age-related macular degeneration (AMD), retinitis pigmentosa (RP) and ...

Transpupillary-Guided Trans-Scleral Transplantation of Subretinal Grafts in a Retinal Degeneration Mouse Model

Transplantation of photoreceptor cells and retinal pigment&#160;epithelial (RPE) cells provide a potential therapy for retinal degeneration diseases. Subretinal transplantation of therapeutic donor cells into mouse recipients is challenging due to the limited surgical space allowed by the small volume of the mouse eye. We developed a trans-scleral surgical transplantation platform with direct transpupillary vision guidance to facilitate the subretinal delivery of exogenous cells in mouse recipients. The platform was tested using retinal cell suspensions and three-dimensional retinal sheets collected from rod-rich Rho::EGFP mice and cone-rich OPN1LW-EGFP;NRL-/- mice, respectively. Live/dead assay showed low cell mortality for both forms of donor cells. Retinal grafts were successfully delivered into the subretinal space of a mouse model of retinal degeneration, Rd1/NS, with minimum surgical complications as detected by multimodal confocal scanning laser ophthalmoscope (cSLO) imaging. Two months post-transplantation, histological staining demonstrated evidence of advanced maturation of the retinal grafts into &#39;adult&#39; rods and cones (by robust Rho::EGFP, S-opsin, and OPN1LW:EGFP expression, respectively) in the subretinal space. Here, we provide a surgical platform that can enable highly accurate subretinal delivery with a low rate of complications in mouse recipients. This technique offers precision and relative ease of skill acquisition. Furthermore, the technique could be used not only for studies of subretinal cell transplantation but also for other intraocular therapeutic studies including gene therapies.

This protocol presents a transpupillary vision-guided trans-scleral approach to safely and precisely deliver subretinal cellular grafts, with a low rate of surgical complications, in mouse recipients with or without retinal degeneration.

Trapianto trans-sclerale transpupillare guidato di innesti sottoretinici in un modello murino di degenerazione retinica

Transplantation of photoreceptor cells and retinal pigment&#160;epithelial (RPE) cells provide a potential therapy for retinal degeneration diseases. ...

Iniezione sottoretinico di vettori di terapia genica e cellule staminali nel Eye mouse

Riepilogo

Esplora Altri Video

PLAYLIST