Name: subretinal injection of gene therapy vectors and stem cells in the perinatal mouse eye
Uploaded: 2012-11-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 9 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Subretinal Injection of Gene Therapy Vectors and Stem Cells in the Perinatal Mouse Eye at JoVE.com

Research to Prevent Blindness, l&#39;assistance expérimentale de Takayuki Nagasaki; Cette recherche est conforme à la Déclaration ARVO pour l&#39;utilisation des animaux en ophtalmologie et de la recherche visuelle. KJW est financée par des subventions du NIH 5T32EY013933 et 5T32DK007647-20. VBM est soutenu par NIH K08EY020530.

1. Dispositifs pour assembler l&#39;injection sous-rétinienne <ol><li> Acheter ou fabriquer une aiguille 100 um de diamètre à partir d&#39;un tube capillaire en verre. Cela peut être fait manuellement à l&#39;aide d&#39;un extracteur de Sutter P-97 pipette ou tout autre équipement similaire. L&#39;extrémité du tube capillaire est chauffé et tiré jusqu&#39;à ce qu&#39;il atteigne le diamètre souhaité (100 um). Une aiguille de diamètre plus petit peut être utilisé pour les vecteurs de thérapie génique, mais c&#39;est le diamètre recommandé pour l&#39;injection des cellules, sans endommager les cellules ou les yeux. Par rapport à aiguilles en acier, l&#39;aiguille capillaire en verre a une pointe très fine, mais émoussé, afin de permettre la visualisation de l&#39;injection de fluide et l&#39;accès à l&#39;espace sous-rétinien sans causer de bris de la rétine. Nettoyez ces aiguilles tiré si nécessaire à l&#39;aide d&#39;éthanol à 70%, et les entreposer dans un contenant stérile. Un plat de 15 cm stérile culture de tissu avec du ruban adhésif pour tenir les aiguilles en place est un moyen par lequel de garder les aiguilles d&#39;injection couvert et dans un environnement stérile. À ce stade, complEté la mise en place au sein de la salle d&#39;opération où la procédure aura lieu. Il est plus facile de garder tous les équipements de la salle de chirurgie en tout temps pour lui permettre de rester stérile, surtout si cette procédure est faite dans un établissement de barrière. </li><li> Aspirer de silicone dans l&#39;aiguille d&#39;injection et éjecter la silicone pour laisser un revêtement sur les parois internes de l&#39;aiguille. Le revêtement de silicone maximise le passage des cellules et des virus à travers l&#39;alésage d&#39;aiguille, qui, autrement, se coller aux parois de verre capillaire interne. </li><li> Obtenir une longueur d&#39;environ 8 cm de tube en plastique stérile en coupant une collection de sang 25 ¾ calibre réglé avec luer-lock au point directement après que l&#39;aiguille (retirer l&#39;aiguille de la tubulure). </li><li> Remplissez un 1 ml Sous-Q 26 5/8-gauge glissement embout de la seringue avec une solution saline stérile et retirer l&#39;aiguille de la seringue. </li><li> Fixer l&#39;aiguille d&#39;injection à l&#39;extrémité coupée du tube en plastique et fixer la seringue au Luer-Lok à l&#39;autrefin. </li><li> Aspirer une solution saline stérile pour remplir l&#39;espace vide dans la tubulure et aiguille capillaire, éjectant une solution saline à travers l&#39;aiguille afin de s&#39;assurer qu&#39;il est correctement fixé sans aucune fuite. Ensuite, aspirer une petite quantité d&#39;environ 1 microlitre d&#39;air, dans la pointe de l&#39;aiguille d&#39;injection. Cela séparer le sérum du fluide d&#39;injection et fournir un signal visuel indiquant la fin de l&#39;injection du fluide au cours de l&#39;intervention chirurgicale. Le dispositif d&#39;injection doit être maintenu sur une surface propre essuyés avec de l&#39;éthanol à 70% pendant l&#39;intervention chirurgicale. De plus, tout le matériel utilisé au cours de l&#39;intervention chirurgicale doit être nettoyé avant et après avec de l&#39;éthanol 70%, pour l&#39;exception des aiguilles d&#39;injection qui doit être conservé déjà stérilisé et prêt à l&#39;emploi. Ces aiguilles doivent être éliminés après la chirurgie, et non réutilisé. </li><li> Enfin, aspirer solution injectable contenant le vecteur désiré emballé thérapie génique virale ou les cellules souches. Cela peut être fait parprise de la solution d&#39;injection dans une pointe de pipette stérile, puis la solution de pipetage sur la surface d&#39;une boîte de culture cellulaire stérile. La solution peut maintenant être facilement aspiré dans l&#39;aiguille d&#39;injection à l&#39;aide de la seringue. Le montant nécessaire varie en fonction de l&#39;âge de la souris. Pour nos besoins, nous utilisons post-natales jour 5 souris, qui peuvent être injectés avec de 0,5 à 0,8 l de liquide d&#39;injection. De plus petites quantités, 0,5 pi ou moins, peuvent être utilisés pour souris plus jeunes et de plus grandes quantités, tels que 1 pl, peut être utilisé pour les souris adultes. Le titre viral ou le nombre de cellules doit être déterminée sur la base des virus / cellules étant injectés et leur tissu cible désiré, comme un trop grand nombre de particules virales ou de cellules dans un petit volume peut conduire à une toxicité pour les cellules de la rétine. Dans la vidéo, à des fins de visualisation, nous avons utilisé 1,5 pl, une plus grande quantité de colorant que nécessaire d&#39;injecter dans l&#39;œil. </li></ol> 2. Accès à l&#39;espace sous-rétinien <ol><li> Dans la salle chirurgicale stérile,stabiliser ou anesthésier la souris selon le protocole de manipulation des animaux approuvés localement, qui varient selon l&#39;âge de la souris. Anesthésie commun pour les souris adultes inclut l&#39;utilisation du gaz isoflurane ou une injection intra-péritonéale de 0,1 poids corporel ml/10g de kétamine (100 mg / ml) et de xylazine (20 mg / ml) dans une solution saline stérile. Pour les souris périnatales, les techniques d&#39;anesthésie communs incluent l&#39;utilisation du gaz isoflurane ou cryoanesthesia (hypothermie). Toutes les techniques d&#39;anesthésie doit être approuvé par le comité IACUC locale avant utilisation. Nous utilisons généralement post-natal jour (P) 5 souris, bien que des techniques similaires peuvent être appliquées à des souris dès l&#39;âge de P0 ou à des souris adultes. L&#39;intervention chirurgicale ne peut pas commencer tant que la souris a cessé bouger les membres et ne répond plus aux pieds pincées. Pour les souris périnatales, ils deviendront nettement plus légers en couleur depuis le flux sanguin va ralentir, une autre clé pour savoir qui ils sont entièrement sous anesthésie. </li><li> Chez les souris périnatales, utilisez des ciseaux Vannas droites à mefforcer d&#39;environ 1,5 mm incision le long de la fissure couvercle fermé. Veillez à couper à la mise en retrait, où l&#39;œil va naturellement ouvrir à l&#39;avenir. Cela garantit que les couvercles va guérir et ouvrir correctement lors de l&#39;élaboration de la souris. Une lame chirurgicale peut être utilisé à cette fin, même si nous préférons ciseaux Vannas car ils réduisent le risque de perforation de l&#39;œil au cours de cette procédure. Dans la vidéo, les ciseaux ont été utilisés pour percer et couper directement le long de la marge de la paupière. Lors de l&#39;apprentissage de cette technique, pince doit être utilisé pour soulever la paupière avant de couper et de réduire le risque d&#39;endommager l&#39;œil. </li><li> Séparez les paupières avec pinces à pansement courbes pour proptose l&#39;œil et pincer les paupières légèrement en dessous de l&#39;oeil pour le maintenir proptosed pour injection. Si l&#39;incision couvercle faite en deux étapes est trop grande, l&#39;œil de retomber sous les paupières et éviter une exposition adéquate au cours de la procédure d&#39;injection. Pour les souris adultes, en appliquant une légère pression autour de l&#39;œil avec le dresser pince peut tenir l&#39;œil proptosed pour injection. </li><li> Faire une petite incision sclérale postérieure à ou à l&#39;équateur du globe en grattant la surface avec une lame de microchirurgie de 15 degrés. Cette incision doit être juste assez grande pour passer la pointe de l&#39;aiguille d&#39;injection, mais pas plus que cela. Si l&#39;on préfère, une petite aiguille pointue comme une aiguille d&#39;acupuncture peut être utilisée pour faire cette incision dans l&#39;espace sous-rétinien au lieu de la lame de microchirurgie. Chez les animaux pigmentation foncée, d&#39;un brun foncé à pigmentation des tissus (la choroïde-rétine épithélium pigmentaire) deviendra visible au point d&#39;incision. En plus légers souris albinos ou pigmentées, un stylo de marquage chirurgical peut être appliqué à la pointe de la lame de microchirurgie à laisser une tache d&#39;encre indiquant le site d&#39;incision. Si claires reflux de liquide (vitré) du site d&#39;incision, la lame a été placée trop profondément et entra dans la cavité vitréenne et le virus thérapeutique ou cellules peuvent entrer dans l&#39;espace lors de l&#39;injection intravitréenne. Pour visualizatisur les fins, nous avons fait l&#39;incision sur ce point dans la vidéo. Il est encore possible de remplir une injection sous-rétinienne dans ce cas, toutefois, le décollement de la rétine causée par la présence du fluide d&#39;injection ne peut pas guérir complètement de cette souris. Par conséquent, des précautions doivent être prises pour ne couper que la surface externe de l&#39;œil et non à travers la rétine avant l&#39;injection. </li><li> Soigneusement insérer l&#39;aiguille d&#39;injection dans le site d&#39;incision et de faire avancer ce parallèlement à la paroi externe de l&#39;œil de pénétrer dans l&#39;espace sous-rétinien. Avancer trop près de la paroi extérieure ou trop profondément dans l&#39;œil dirigera l&#39;injection dans le mauvais endroit. La meilleure méthode pour comprendre si l&#39;aiguille est dans la position correcte consiste à pratiquer la technique. Pratiquer sur des souris albinos ou légèrement pigmentées peuvent aider à faire des injections précises et exactes dans l&#39;espace sous-rétinien. C&#39;est parce que le fluide d&#39;aiguille et l&#39;injection est visible dans ces yeux. </li><li> Appliquez une légère pression sur le piston de la seringue et êtregin injection du fluide désiré. Si l&#39;aiguille est correctement placée dans l&#39;espace sous-rétinien, contre-pression modérée se fera sentir. Si l&#39;aiguille se trouve dans le corps vitré, il y aura beaucoup moins de contre-pression et éventuellement certains reflux de fluide lors de l&#39;injection. S&#39;il ya contre-pression importante, maintenir l&#39;aiguille en place depuis au moins 15 secondes supplémentaires avant de retirer l&#39;aiguille lentement. Cela permettra à la haute pression intra-oculaire pour égaliser au lieu de reflux du virus injecté ou cellules vers le site de l&#39;incision. Partie de l&#39;air et de solution saline peut être injecté dans l&#39;espace sous-rétinien dû à l&#39;augmentation de la pression nécessaire au cours de la procédure d&#39;injection. Il faut prendre soin de ne pas trop injecter de l&#39;air ou de sérum physiologique, car il peut éliminer le virus injecté ou des cellules de l&#39;œil. Il est également possible de provoquer un décollement de rétine permanente de la présence de trop de liquide injecté dans l&#39;espace sous-rétinien. Aux fins de visualisation, la teinture et de l&#39;air a été injecté into la sous-rétinien dans l&#39;espace vidéo. Il peut être clairement vu comment certains de colorant seront évacués de retour de l&#39;espace sous-rétinien si trop est injecté, mais aussi comment la bulle d&#39;air reste dans l&#39;espace sous-rétinien et ne disparaît pas dans le corps vitré. Il a été utilisé pour souligner que ces injections étaient tous dans l&#39;emplacement correct de l&#39;œil, si l&#39;on peut visualiser comment l&#39;aiguille doit entrer dans le site de l&#39;incision. Toutes les injections dans l&#39;espace sous-rétinien de provoquer un décollement de la rétine temporaire en raison de la présence du fluide d&#39;injection. Si la procédure d&#39;injection est correctement rempli, ce détachement temporaire rétine va guérir dans les 24 heures et la souris peut être utilisée pour toutes les autres expériences. L&#39;œil peut rester doux pendant environ une semaine en raison de l&#39;intervention chirurgicale, donc une deuxième injection doit être évitée au cours de cette période de temps. </li><li> Pour souriceaux nouveau-nés, utilisez les pinces à pansement courbes pour pousser doucement les yeux derrière les paupières et dans l&#39;orbite. Il peut être utileattendre une minute afin de permettre au virus de s&#39;installer dans l&#39;espace sous-rétinien et non l&#39;amener à être évacuée du site d&#39;incision quand poussant doucement l&#39;œil en arrière sur son orbite. Après la chirurgie, une goutte de bupivacaïne à 0,5% (marcaïne) diluée à 0,25% dans une solution saline stérile à partir d&#39;une aiguille de calibre 25 peut être placé sur le site d&#39;injection. Les souris ne présentent pas de signes évidents de détresse après la chirurgie sous-rétinienne et l&#39;utilisation de la bupivacaïne comme un analgésique à action prolongée actualité a été suffisant pour les trois années précédentes. Les souris doivent toujours être surveillés après l&#39;intervention chirurgicale pour rechercher des signes de détresse; telles que l&#39;infection, une enflure ou une diminution dans les activités journalières habituelles de la souris. Si ceci se produit, le vétérinaire doit être notifié et d&#39;autres médicaments contre la douleur tels que la buprénorphine (0,05 mg / kg) peut être administré par injection intrapéritonéale. </li><li> Réveillez la souris de l&#39;anesthésie selon le protocole de manipulation des animaux approuvée localement. La souris doit être maintenu sur une p chauffageannonce à maintenir la température normale du corps car il se réveille de l&#39;anesthésie. La procédure chirurgicale devrait prendre moins de cinq minutes à remplir, sans compter le temps de la souris pour subir une anesthésie. Par conséquent, un coussin chauffant n&#39;est pas nécessaire lors de la procédure proprement dite, mais il peut être nécessaire alors que l&#39;on apprend la technique que la procédure pourrait prendre une plus longue durée de temps. La souris ne doit pas être remis dans une cage propre jusqu&#39;à ce qu&#39;il a commencé à se déplacer tout seul. Pour les nouveau-nés, pincées orteils doux aidera pour eux de se remettre complètement de l&#39;anesthésie, et ils devraient retrouver leur couleur rose et le mouvement avant d&#39;être remis à la mère. Les souris doivent être suivies dans le temps pour détecter tout signe de détresse comme indiqué précédemment. </li></ol>

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	<li>Abe, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+the+retina+using+pigment+epithelial+cell+transplantation.">Regeneration of the retina using pigment epithelial cell transplantation.</a> Nihon Ganka Gakkai Zasshi. 106, 778-803 (2002).</li><li>Jacobson, S. G., Cideciyan, A. V., Ratnakaram, R., Heon, E., Schwartz, S. B., Roman, A. J., Peden, M. C., Aleman, T. S., Boye, S. L., Sumaroka, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+therapy+for+Leber+congenital+amaurosis+caused+by+RPE65+mutations:+safety+and+efficacy+in+15+children+and+adults+followed+up+to+3+years.">Gene therapy for Leber congenital amaurosis caused by RPE65 mutations: safety and efficacy in 15 children and adults followed up to 3 years.</a> Arch. Ophthalmol. 130, 9-24 (2011).</li><li>Schwartz, S. D., Hubschman, J. P., Heilwell, G., Franco-Cardenas, V., Pan, C. K., Ostrick, R. M., Mickunas, E., Gay, R., Klimanskaya, I., Lanza, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell+trials+for+macular+degeneration:+a+preliminary+report.">Embryonic stem cell trials for macular degeneration: a preliminary report.</a> Lancet. 379, 713-720 (2012).</li><li>Wang, N. K., Tosi, J., Kasanuki, J. M., Chou, C. L., Kong, J., Parmalee, N., Wert, K. J., Allikmets, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+reprogrammed+embryonic+stem+cells+improves+visual+function+in+a+mouse+model+for+retinitis+pigmentosa.">Transplantation of reprogrammed embryonic stem cells improves visual function in a mouse model for retinitis pigmentosa.</a> Transplantation. 89, 911-919 (2010).</li><li>Song, B. J., Tsang, S. H., Lin, C. -. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+models+of+retinal+degeneration+and+targets+for+gene+therapy.">Genetic models of retinal degeneration and targets for gene therapy.</a> Gene Ther. Mol. Biol. 11, 229-262 (2007).</li><li>Tosi, J., Sancho-Pelluz, J., Davis, R. J., Hsu, C. W., Wolpert, K. V., Sengillo, J. D., Lin, C. S., Tsang, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentivirus-mediated+expression+of+cDNA+and+shRNA+slows+degeneration+in+retinitis+pigmentosa.">Lentivirus-mediated expression of cDNA and shRNA slows degeneration in retinitis pigmentosa.</a> Exp. Biol. Med. 236, 1211-1217 (2011).</li><li>Tucker, B. A., Park, I. H., Qi, S. D., Klassen, H. J., Jiang, C., Yao, J., Redenti, S., Daley, G. Q., Young, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+adult+mouse+iPS+cell-derived+photoreceptor+precursors+restores+retinal+structure+and+function+in+degenerative+mice.">Transplantation of adult mouse iPS cell-derived photoreceptor precursors restores retinal structure and function in degenerative mice.</a> PLoS One. 6, e189992 (2011).</li><li>Mahajan, V. B., Mondino, B. J., Tsang, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> A high-throughput Mouse Eye Phenomics System. , (2010).</li><li>Chang, B., Hawes, N. L., Hurd, R. E., Davisson, M. T., Nusinowitz, S., Heckenlively, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+degeneration+mutants+in+the+mouse.">Retinal degeneration mutants in the mouse.</a> Vision Res. 42, 517-525 (2002).</li><li>Hawes, N. L., Smith, R. S., Chang, B., Davisson, M., Heckenlively, J. R., John, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+fundus+photography+and+angiography:+a+catalogue+of+normal+and+mutant+phenotypes.">Mouse fundus photography and angiography: a catalogue of normal and mutant phenotypes.</a> Mol. Vis. 5, 22 (1999).</li><li>Won, J., Shi, L. Y., Hicks, W., Wang, J., Hurd, R., Naggert, J. K., Chang, B., Nishina, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+model+resources+for+vision+research.">Mouse model resources for vision research.</a> J. Ophthalmol. 2011, 391384 (2011).</li></ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Cette technique vidéo fournit des instructions sur l&#39;achèvement de la procédure chirurgicale injection sous-rétinienne avec succès, et veiller à ce que le vecteur de thérapie génique ou les cellules souches sont placés dans l&#39;emplacement nécessaire pour traiter efficacement la maladie ophtalmique. Cette technique permet le ciblage des cellules de la rétine comme l&#39;EPR ou photorécepteurs, car il place les vecteurs de thérapie génique ou de cellules souches dérivées de tissus dans le voisinage ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom </td><td> Entreprise </td><td> Catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> 0,8 à 1,10 x 100 mm Tube capillaire (verre) </td><td> Kimble Glass, Inc </td><td> 34502 99 </td><td></td></tr><tr><td> Flaming / Brown Micropipette Puller </td><td> Instrument Sutter </td><td> P-97 </td><td> Narishige microforge peut être utilisé à la place. Catalogue MF-900 </td></tr><tr><td> Sigmacote </td><td> Sigma Aldrich </td><td> SL2-25ML </td><td> Silicone </td></tr><tr><td> Phosphate Buffered Saline Dubecco de chlorure de calcium et chlorure de magnésium </td><td> Gibco Invitrogen- </td><td> 14040-133 </td><td></td></tr><tr><td> Safety-Lok 25 3/4G x 12 &quot;; de prélèvement sanguin </td><td> BD Vacutainer </td><td> 367298 </td><td></td></tr><tr><td> 1 ml Sous-Q 265/8G Slip-Tip Syringe </td><td> Becton-Dickinson </td><td> 309597 </td><td></td></tr><tr><td> 0,5 à 10 ul Finnpipette II-Volume réglable Pipette </td><td> Fisherbrand </td><td> 21-377-815 </td><td></td></tr><tr><td> 1-200 ul Conseils naturelles biseautés </td><td> USA Scientific, Inc </td><td> 1111-1700 </td><td></td></tr><tr><td> Discovery.V8 Microscope stéréo </td><td> Zeiss </td><td> MC1500 </td><td></td></tr><tr><td> 60 mm x 15 mm Style de traité vaisselle culture cellulaire Polystyrène </td><td> Corning Incorporated </td><td> 430166 </td><td></td></tr><tr><td> Ciseaux Vannas droites </td><td> Storz Ophthalmics </td><td> E3383 S </td><td></td></tr><tr><td> Curved Forceps Dressing avec des dentelures délicates </td><td> Storz Ophthalmics </td><td> E1408 </td><td></td></tr><tr><td> 15 Couteau microchirurgie Degré </td><td> Wilssur ophtalmique Corp </td><td> 091204 </td><td></td></tr><tr><td> La kétamine </td><td> Ketaset III </td><td> NADA # 45-290 </td><td></td></tr><tr><td> Xylazine </td><td> Laboratoires Lloyd </td><td> NADA # 139-236 </td><td></td></tr><tr><td> La bupivacaïne (Marcaïne) </td><td> AstraZeneca </td><td> N / A </td><td></td></tr><tr><td> La buprénorphine </td><td> Sigma Aldrich </td><td> B9275 </td><td></td></tr></tbody></table>

subretinal injection of gene therapy vectors and stem cells in the perinatal mouse eye

La perte de la vue affecte environ 3,4 millions de personnes aux États-Unis et devrait augmenter dans les années à venir. 1 Récemment, la thérapie génique et les transplantations de cellules souches sont devenus les principaux outils thérapeutiques pour le traitement de la cécité due à des maladies dégénératives rétiniennes. Plusieurs formes de transplantation autologue pour la dégénérescence maculaire liée à l&#39;âge (DMLA), comme l&#39;iris pigment transplantation de cellules épithéliales, ont généré des résultats encourageants, et les essais cliniques humains ont commencé pour d&#39;autres formes de thérapies cellulaires de gènes et la tige. 2 Il s&#39;agit de remplacement de gène RPE65 chez des patients souffrant amaurose congénitale de Leber et une greffe de cellules RPE en utilisant de l&#39;homme souches embryonnaires (ES) cellules dans la maladie de Stargardt. 3-4 Maintenant qu&#39;il ya des vecteurs de thérapie génique et les cellules souches disponibles pour le traitement de patients atteints de maladies rétiniennes, il est important de vérifier ces thérapies potentielles dans les modèles animaux avant d&#39;appliquertion entre eux dans les études humaines. La souris est devenue un modèle important scientifique pour tester l&#39;efficacité thérapeutique de vecteurs de thérapie génique et de la transplantation de cellules souches dans l&#39;œil. 5-8 Dans cet article, vidéo, nous présentons une technique pour injecter des vecteurs de thérapie génique et les cellules souches dans l&#39;espace sous-rétinien de l&#39;œil de la souris tout en minimisant les dommages aux tissus environnants.

Un dessin de l&#39;oeil de la souris est démontré à de grandes structures étiquetées à titre de référence, avec des flèches montrant les emplacements pour les procédures d&#39;injection intravitréenne et sous-rétinien tant chirurgicales (pointes de flèches, figure 1). Vecteurs de thérapie génique, tels que le vecteur lentiviral lacZ (figure 2), peut être injecté à l&#39;aide de ces endroits. En outre, les cellules souches, comme les cellules souches embryonnai...

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Subretinal Injection of Gene Therapy Vectors and Stem Cells in the Perinatal Mouse Eye

Cette technique chirurgicale illustre l&#39;injection de vecteurs de thérapie génique et les cellules souches dans l&#39;espace sous-rétinien de l&#39;oeil de la souris.

Injection sous-rétinien de vecteurs de thérapie génique et les cellules souches dans l&#39;œil de la souris

The loss of sight affects approximately 3.4 million people in the United States and is expected to increase in the upcoming years.1 Recently, gene therapy ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

33.1K vues.  Columbia University. Cette technique chirurgicale illustre l'injection de vecteurs de thérapie génique et les cellules souches dans l'espace sous-rétinien de l'oeil de la souris.

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Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural connectivity form during development. In mice, retinofugal projections are arranged in a topographic manner and form eye-specific layers in the Lateral Geniculate Nucleus (dLGN) of the thalamus and the Superior Colliculus (SC). The development of these precise patterns of retinofugal projections has typically been studied by labeling populations of RGCs with fluorescent dyes and tracers, such as horseradish peroxidase1-4. However, these methods are too coarse to provide insight into developmental changes in individual RGC axonal arbor morphology that are the basis of retinotopic map formation. They also do not allow for the genetic manipulation of RGCs.
Recently, electroporation has become an effective method for providing precise spatial and temporal control for delivery of charged molecules into the retina5-11. Current retinal electroporation protocols do not allow for genetic manipulation and tracing of retinofugal projections of a single or small cluster of RGCs in postnatal mice. It has been argued that postnatal in vivo electroporation is not a viable method for transfecting RGCs since the labeling efficiency is extremely low and hence requires targeting at embryonic ages when RGC progenitors are undergoing differentiation and proliferation6. 
In this video we describe an in vivo electroporation protocol for targeted delivery of genes, shRNA, and fluorescent dextrans to murine RGCs postnatally. This technique provides a cost effective, fast and relatively easy platform for efficient screening of candidate genes involved in several aspects of neural development including axon retraction, branching, lamination, regeneration and synapse formation at various stages of circuit development. In summary we describe here a valuable tool which will provide further insights into the molecular mechanisms underlying sensory map development.

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

We demonstrate an in vivo electroporation protocol for transfecting single or small clusters of retinal ganglion cells (RGCs) and other retinal cell types in postnatal mice over a wide range of ages. The ability to label and genetically manipulate postnatal RGCs in vivo is a powerful tool for developmental studies.

La transfection des cellules ganglionnaires de la rétine de la souris par In vivo L&#39;électroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

Recherche

Neurosciences

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge. Gene targeting to generate constitutive or conditional loss of function knockouts remains cost and labor intensive, as well as time consuming. Adding to these challenges, retina expressed genes may have essential roles outside the retina leading to unintended confounds when using a knockout approach. Furthermore, the ability to ectopically express a gene in a gain of function experiment can be extremely valuable when attempting to identify a role in cell fate specification and/or terminal differentiation.
We present a method for the rapid and efficient incorporation of DNA plasmids into the neonatal mouse retina by electroporation. The application of short electrical impulses above a certain field strength results in a transient increase in plasma membrane permeability, facilitating the transfer of material across the membrane 1,2,3,4. Groundbreaking work demonstrated that electroporation could be utilized as a method of gene transfer into mammalian cells by inducing the formation of hydrophilic plasma membrane pores allowing the passage of highly charged DNA through the lipid bilayer 5. Continuous technical development has resulted in the viability of electroporation as a method for in vivo gene transfer in multiple mouse tissues including the retina, the method for which is described herein 6, 7, 8, 9, 10. 
DNA solution is injected into the subretinal space so that DNA is placed between the retinal pigmented epithelium and retina of the neonatal (P0) mouse and electrical pulses are applied using a tweezer electrode. The lateral placement of the eyes in the mouse allows for the easy orientation of the tweezer electrode to the necessary negative pole-DNA-retina-positive pole alignment. Extensive incorporation and expression of transferred genes can be identified by postnatal day 2 (P2). Due to the lack of significant lateral migration of cells in the retina, electroporated and non-electroporated regions are generated. Non-electroporated regions may serve as internal histological controls where appropriate. 
Retinal electroporation can be used to express a gene under a ubiquitous promoter, such as CAG, or to disrupt gene function using shRNA constructs or Cre-recombinase. More targeted expression can be achieved by designing constructs with cell specific gene promoters. Visualization of electroporated cells is achieved using bicistronic constructs expressing GFP or by co-electroporating a GFP expression construct. Furthermore, multiple constructs may be electroporated for the study of combinatorial gene effects or simultaneous gain and loss of function of different genes. Retinal electroporation may also be utilized for the analysis of genomic cis-regulatory elements by generating appropriate expression constructs and deletion mutants. Such experiments can be used to identify cis-regulatory regions sufficient or required for cell specific gene expression 11. Potential experiments are limited only by construct availability.

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

A method for the incorporation of plasmid DNA into murine retinal cells for the purpose of performing either gain- or loss of function studies in vivo is presented. This method capitalizes on the transient increase in permeability of cell plasma membranes induced by the application of an external electrical field.

En électroporation in vivo de la rétine de souris en développement

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge.  Gene targeting to generate ...

Retinal Detachment Model in Rodents by Subretinal Injection of Sodium Hyaluronate

Subretinal injection of sodium hyaluronate is a widely accepted method of inducing retinal detachment (RD). However, the height and duration of RD or the occurrence of subretinal hemorrhage can affect photoreceptor cell death in the detached retina. Hence, it is advantageous to create reproducible RDs without subretinal hemorrhage for evaluating photoreceptor cell death. We modified a previously reported method to create bullous and persistent RDs in a reproducible location with rare occurrence of subretinal hemorrhage. The critical step of this modified method is the creation of a self-sealing scleral incision, which can prevent leakage of sodium hyaluronate after injection into the subretinal space. To make the self-sealing scleral incision, a scleral tunnel is created, followed by scleral penetration into the choroid with a 30 G needle. Although choroidal hemorrhage may occur during this step, astriction with a surgical spear reduces the rate of choroidal hemorrhage. This method allows a more reproducible and reliable model of photoreceptor death in diseases that involve RD such as rhegmatogenous RD, retinopathy of prematurity, diabetic retinopathy, central serous chorioretinopathy, and age-related macular degeneration (AMD).

Creating experimental retinal detachments with a reproducible and sustained height of detachment, and without subretinal hemorrhage, is important for studying the pathophysiology of photoreceptor cell loss in retinal disease and evaluating potential therapeutic interventions. Here, we report such a method in detail.

Décollement de la rétine modèle chez les rongeurs par injection sous-rétinienne de hyaluronate de sodium

Subretinal injection of sodium hyaluronate is a widely accepted method of inducing retinal detachment (RD). However, the height and duration of RD or the ...

Médecine

In utero and ex vivo Electroporation for Gene Expression in Mouse Retinal Ganglion Cells

The retina and its sole output neuron, the retinal ganglion cell (RGC), comprise an excellent model in which to examine biological questions such as cell differentiation, axon guidance, retinotopic organization and synapse formation[1]. One drawback is the inability to efficiently and reliably manipulate gene expression in RGCs in vivo, especially in the otherwise accessible murine visual pathways. Transgenic mice can be used to manipulate gene expression, but this approach is often expensive, time consuming, and can produce unwanted side effects. In chick, in ovo electroporation is used to manipulate gene expression in RGCs for examining retina and RGC development. Although similar electroporation techniques have been developed in neonatal mouse pups[2], adult rats[3], and embryonic murine retinae in vitro[4], none of these strategies allow full characterization of RGC development and axon projections in vivo. To this end, we have developed two applications of electroporation, one in utero and the other ex vivo, to specifically target embryonic murine RGCs[5, 6]. 
With in utero retinal electroporation, we can misexpress or downregulate specific genes in RGCs and follow their axon projections through the visual pathways in vivo, allowing examination of guidance decisions at intermediate targets, such as the optic chiasm, or at target regions, such as the lateral geniculate nucleus. Perturbing gene expression in a subset of RGCs in an otherwise wild-type background facilitates an understanding of gene function throughout the retinal pathway. Additionally, we have developed a companion technique for analyzing RGC axon growth in vitro. We electroporate embryonic heads ex vivo, collect and incubate the whole retina, then prepare explants from these retinae several days later. Retinal explants can be used in a variety of in vitro assays in order to examine the response of electroporated RGC axons to guidance cues or other factors. In sum, this set of techniques enhances our ability to misexpress or downregulate genes in RGCs and should greatly aid studies examining RGC development and axon projections.

In utero and ex vivo Electroporation for Gene Expression in Mouse Retinal Ganglion Cells

Here we present two techniques for manipulating gene expression in murine retinal ganglion cells (RGCs) by in utero and ex vivo electroporation. These techniques enable one to examine how alterations in gene expression affect RGC development, axon guidance, and functional properties.

En électroporation in vivo et ex utero pour l&#39;expression génique dans les cellules ganglionnaires de la rétine de la souris

The retina and its sole output neuron, the retinal ganglion cell (RGC), comprise an excellent model in which to examine biological questions such as cell ...

Biologie

Performing Subretinal Injections in Rodents to Deliver Retinal Pigment Epithelium Cells in Suspension

The conversion of light into electrical impulses occurs in the outer retina and is accomplished largely by rod and cone photoreceptors and retinal pigment epithelium (RPE) cells. RPE provide critical support for photoreceptors and death or dysfunction of RPE cells is characteristic of age-related macular degeneration (AMD), the leading cause of permanent vision loss in people age 55 and older. While no cure for AMD has been identified, implantation of healthy RPE in diseased eyes may prove to be an effective treatment, and large numbers of RPE cells can be readily generated from pluripotent stem cells. Several interesting questions regarding the safety and efficacy of RPE cell delivery can still be examined in animal models, and well-accepted protocols used to inject RPE have been developed. The technique described here has been used by multiple groups in various studies and involves first creating a hole in the eye with a sharp needle. Then a syringe with a blunt needle loaded with cells is inserted through the hole and passed through the vitreous until it gently touches the RPE. Using this injection method, which is relatively simple and requires minimal equipment, we achieve consistent and efficient integration of stem cell-derived RPE cells in between the host RPE that prevents significant amount of photoreceptor degeneration in animal models. While not part of the actual protocol, we also describe how to determine the extent of the trauma induced by the injection, and how to verify that the cells were injected into the subretinal space using in vivo imaging modalities. Finally, the use of this protocol is not limited to RPE cells; it may be used to inject any compound or cell into the subretinal space.

Here we present a community accepted protocol in multimedia format for subretinally injecting a bolus of RPE cells in rats and mice. This approach can be used for determining rescue potentials, safety profiles, and survival capacities of grafted RPE cells upon implantation in animal models of retinal degeneration.

Exécution sous-rétinienne injections chez les rongeurs de produire des cellules de l&#39;épithélium pigmentaire rétinien Suspension

The conversion of light into electrical impulses occurs in the outer retina and is accomplished largely by rod and cone photoreceptors and retinal pigment ...

Limbal Approach-Subretinal Injection of Viral Vectors for Gene Therapy in Mice Retinal Pigment Epithelium

The eye is a small and enclosed organ which makes it an ideal target for gene therapy. Recently various strategies have been applied to gene therapy in retinopathies using non-viral and viral gene delivery to the retina and retinal pigment epithelium (RPE). Subretinal injection is the best approach to deliver viral vectors directly to RPE cells. Before the clinical trial of a gene therapy, it is inevitable to validate the efficacy of the therapy in animal models of various retinopathies. Thus, subretinal injection in mice becomes a fundamental technique for an ocular gene therapy. In this protocol, we provide the easy and replicable technique for subretinal injection of viral vectors to experimental mice. This technique is modified from the intravitreal injection, which is widely used technique in ophthalmology clinics. The representative results of RPE/choroid/scleral complex flat-mount will help to understand the efficacy of this technique and adjust the volume and titer of viral vectors for the extent of gene transduction.

Subretinal injection is a surgical technique for effective gene delivery to retinal pigment epithelium in the mouse eye. Here we describe an easy and replicable method for subretinal injection of viral vectors to retinal pigment epithelium in experimental mice.

Limbal injection Approche-sous-rétinienne de vecteurs viraux pour la thérapie génique chez la souris épithélium pigmentaire rétinien

The eye is a small and enclosed organ which makes it an ideal target for gene therapy. Recently various strategies have been applied to gene therapy in ...

An Alternative and Validated Injection Method for Accessing the Subretinal Space via a Transcleral Posterior Approach

Subretinal injections have been successfully used in both humans and rodents to deliver therapeutic interventions of proteins, viral agents, and cells to the interphotoreceptor/subretinal compartment that has direct exposure to photoreceptors and the retinal pigment epithelium (RPE). Subretinal injections of plasminogen as well as recent preclinical and clinical trials have demonstrated safety and/or efficacy of delivering viral vectors and stem cells to individuals with advanced retinal disease. Mouse models of retinal disease, particularly hereditary retinal dystrophies, are essential for testing these therapies. The most common injection procedure in rodents is to use small transcorneal or transcleral incisions with an anterior approach to the retina. With this approach, the injection needle penetrates the neurosensory retina disrupting the underlying RPE and on insertion can easily nick the lens, causing lens opacification and impairment of noninvasive imaging. Accessing the subretinal space via a transcleral, posterior approach avoids these problems: the needle crosses the sclera approximately 0.5 mm from the optic nerve, without retinal penetration and avoids disrupting the vitreous. Collateral damage is limited to that associated with the focal sclerotomy and the effects of a transient, serous retinal detachment. The simplicity of the method minimizes ocular injury, ensures rapid retinal reattachment and recovery, and has a low failure rate. The minimal damage to the retina and RPE allows for clear assessment of the efficacy and direct effects of the therapeutic agents themselves. This manuscript describes a novel subretinal injection technique that can be used to target viral vectors, pharmacological agents, stem cells or induced pluripotent stem (iPS) cells to the subretinal space in mice with high efficacy, minimal damage, and fast recovery.

An Alternative and Validated Injection Method for Accessing the Subretinal Space via a Transcleral Posterior Approach

Subretinal injections are the most common technique for delivering large therapeutic agents such as proteins and viral vectors to photoreceptors and the retinal pigment epithelium. An alternative method in mice that successfully targets the subretinal space with minimal collateral damage and fast recovery times is described here.

Une méthode alternative et Validé Injection pour l&#39;accès à l&#39;espace sous-rétinien<i&gt; via</i&gt; Une approche transclérale Postérieur

Subretinal injections have been successfully used in both humans and rodents to deliver therapeutic interventions of proteins, viral agents, and cells to ...

Ultrahigh Resolution Mouse Optical Coherence Tomography to Aid Intraocular Injection in Retinal Gene Therapy Research

HR-SD-OCT is utilized to monitor the progression of photoreceptor degeneration in live mouse models, assess the delivery of therapeutic agents into the subretinal space, and to evaluate toxicity and efficacy in vivo. HR-SD-OCT uses near infrared light (800-880 nm) and has optics specifically designed for the unique optics of the mouse eye with sub-2-micron axial resolution. Transgenic mouse models of outer retinal (photoreceptor) degeneration and controls were imaged to assess the disease progression. Pulled glass microneedles were used to deliver sub retinal injections of adeno-associated virus (AAV) or nanoparticles (NP) via a trans-scleral and trans-choroidal approach. Careful positioning of the needle into the subretinal space was required prior to a calibrated pressure injection, which delivers fluid into the sub retinal space. Real time subretinal surgery was conducted on our retinal imaging system (RIS). HR-SD-OCT demonstrated progressive uniform retinal degeneration due to expression of a toxic mutant human mutant rhodopsin (P347S) (RHOP347S) transgene in mice. HR-SD-OCT allows rigorous quantification of all the retinal layers. Outer nuclear layer (ONL) thickness and photoreceptor outer segment length (OSL) measurements correlate with photoreceptor vitality, degeneration, or rescue. The RIS delivery system allows real-time visualization of subretinal injections in neonatal (~P10-14) or adult mice, and HR-SD-OCT immediately determines success of delivery and maps areal extent. HR-SD-OCT is a powerful tool that can evaluate the success of subretinal surgery in mice, in addition to measuring vitality of photoreceptors in vivo. HR-SD-OCT can also be used to identify uniform animal cohorts to evaluate the extent of retinal degeneration, toxicity, and therapeutic rescue in preclinical gene therapy research studies.

Here we demonstrate a novel approach to using high resolution spectral-domain optical coherence tomography (HR-SD-OCT) to assist delivery of gene therapy agents into the subretinal space, assess its areal coverage, and characterize photoreceptor vitality.

Tomographie à cohérence optique souris ultra haute résolution pour faciliter l’Injection intraoculaire dans la recherche de la thérapie génique rétinienne

HR-SD-OCT is utilized to monitor the progression of photoreceptor degeneration in live mouse models, assess the delivery of therapeutic agents into the ...

Subretinal Transplantation of Human Embryonic Stem Cell-Derived Retinal Tissue in a Feline Large Animal Model

Retinal degenerative (RD) conditions associated with photoreceptor loss such as age-related macular degeneration (AMD), retinitis pigmentosa (RP) and Leber Congenital Amaurosis (LCA) cause progressive and debilitating vision loss. There is an unmet need for therapies that can restore vision once photoreceptors have been lost. Transplantation of human pluripotent stem cell (hPSC)-derived retinal tissue (organoids) into the subretinal space of an eye with advanced RD brings retinal tissue sheets with thousands of healthy mutation-free photoreceptors and has a potential to treat most/all blinding diseases associated with photoreceptor degeneration with one approved protocol. Transplantation of fetal retinal tissue into the subretinal space of animal models and people with advanced RD has been developed successfully but cannot be used as a routine therapy due to ethical concerns and limited tissue supply. Large eye inherited retinal degeneration (IRD) animal models are valuable for developing vision restoration therapies utilizing advanced surgical approaches to transplant retinal cells/tissue into the subretinal space. The similarities in globe size, and photoreceptor distribution (e.g., presence of macula-like region area centralis) and availability of IRD models closely recapitulating human IRD would facilitate rapid translation of a promising therapy to the clinic. Presented here is a surgical technique of transplanting hPSC-derived retinal tissue into the subretinal space of a large animal model allowing assessment of this promising approach in animal models.

Presented here is a surgical technique for transplanting human pluripotent stem cell (hPSC)-derived retinal tissue into the subretinal space of a large animal model.

Transplantation sous-rétinienne de tissu rétinien dérivé de cellules souches embryonnaires humaines dans un modèle félin de grand animal

Retinal degenerative (RD) conditions associated with photoreceptor loss such as age-related macular degeneration (AMD), retinitis pigmentosa (RP) and ...

Transpupillary-Guided Trans-Scleral Transplantation of Subretinal Grafts in a Retinal Degeneration Mouse Model

Transplantation of photoreceptor cells and retinal pigment&#160;epithelial (RPE) cells provide a potential therapy for retinal degeneration diseases. Subretinal transplantation of therapeutic donor cells into mouse recipients is challenging due to the limited surgical space allowed by the small volume of the mouse eye. We developed a trans-scleral surgical transplantation platform with direct transpupillary vision guidance to facilitate the subretinal delivery of exogenous cells in mouse recipients. The platform was tested using retinal cell suspensions and three-dimensional retinal sheets collected from rod-rich Rho::EGFP mice and cone-rich OPN1LW-EGFP;NRL-/- mice, respectively. Live/dead assay showed low cell mortality for both forms of donor cells. Retinal grafts were successfully delivered into the subretinal space of a mouse model of retinal degeneration, Rd1/NS, with minimum surgical complications as detected by multimodal confocal scanning laser ophthalmoscope (cSLO) imaging. Two months post-transplantation, histological staining demonstrated evidence of advanced maturation of the retinal grafts into &#39;adult&#39; rods and cones (by robust Rho::EGFP, S-opsin, and OPN1LW:EGFP expression, respectively) in the subretinal space. Here, we provide a surgical platform that can enable highly accurate subretinal delivery with a low rate of complications in mouse recipients. This technique offers precision and relative ease of skill acquisition. Furthermore, the technique could be used not only for studies of subretinal cell transplantation but also for other intraocular therapeutic studies including gene therapies.

This protocol presents a transpupillary vision-guided trans-scleral approach to safely and precisely deliver subretinal cellular grafts, with a low rate of surgical complications, in mouse recipients with or without retinal degeneration.

Transplantation transsclérale guidée par voie transpupillaire de greffons sous-rétiniens dans un modèle murin de dégénérescence rétinienne

Transplantation of photoreceptor cells and retinal pigment&#160;epithelial (RPE) cells provide a potential therapy for retinal degeneration diseases. ...

Injection sous-rétinien de vecteurs de thérapie génique et les cellules souches dans l'œil de la souris

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