Name: subretinal injection of gene therapy vectors and stem cells in the perinatal mouse eye
Uploaded: 2012-11-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 9 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Subretinal Injection of Gene Therapy Vectors and Stem Cells in the Perinatal Mouse Eye at JoVE.com

Pesquisar para prevenir a cegueira, assistência Experimental de Takayuki Nagasaki; Esta pesquisa está em conformidade com a Declaração de ARVO para o Uso de Animais em Oftalmologia e Pesquisa Visual. KJW é suportado pelo NIH e 5T32EY013933 5T32DK007647-20. VBM é suportado pelo NIH concessão K08EY020530.

1. Montar dispositivos para a injeção sub-retiniana <ol><li> Comprar ou fazer uma agulha 100 um de diâmetro a partir de um tubo de vidro capilar. Isto pode ser feito manualmente utilizando um extractor Sutter P-97 da pipeta ou outro equipamento semelhante. A extremidade do tubo capilar irá ser aquecido e puxado até atingir o diâmetro desejado (100 mm). Uma agulha de menor diâmetro podem ser utilizados para vectores de terapia génica, no entanto, isto é o diâmetro recomendado para a injecção das células, sem danificar as células ou o olho. Em comparação com as agulhas de aço, a agulha capilar de vidro tem uma ponta muito fina, mas sem corte, para permitir a visualização do fluido de injecção e de acesso ao espaço sub-retiniano, sem causar a ruptura da retina. Limpe estas agulhas puxado, se necessário usando etanol 70%, e guarde em um recipiente estéril. Uma placa de cultura de 15 centímetros estéril tecido com fita adesiva para segurar as agulhas no lugar é uma forma em que para manter as agulhas de injecção e coberto em um ambiente estéril. Neste ponto, complete o set-up dentro da sala cirúrgica onde o procedimento será realizado. É mais fácil manter todos os equipamentos na sala cirúrgica em todos os momentos para que ele permaneça estéril, especialmente se este procedimento é feito dentro de uma instalação de barreira. </li><li> Aspirar silicone para dentro da agulha de injecção e ejetar o silicone para deixar um revestimento ao longo das paredes internas da agulha. O revestimento de silicone maximiza a passagem de células e vírus através do furo da agulha, que, de outro modo aderir às paredes interiores de vidro capilar. </li><li> Obter um comprimento de aproximadamente 8 cm de tubagem de plástico estéril, cortando uma colheita de sangue 25 ¾ calibre definido com luer-lock no ponto imediatamente após a agulha (remover a agulha do tubo). </li><li> Encher um 1 ml Sub-Q 26 5/8-gauge seringa de ponta de deslizamento com uma solução salina estéril e retire a agulha da seringa. </li><li> Fixar a agulha de injecção para a extremidade cortada do tubo de plástico e encaixe a seringa para o luer-lock na outrafim. </li><li> Aspirar solução salina estéril para preencher o espaço morto na agulha e tubo capilar, uma solução salina de ejecção através da agulha para assegurar que ele está correctamente ligado sem qualquer fuga. Em seguida, aspirar uma pequena quantidade de cerca de 1 ul de ar, para dentro da ponta da agulha de injecção. Isto vai separar o soro fisiológico do fluido de injecção e proporcionar uma indicação visual que indica o fim do fluido de injecção, durante o procedimento cirúrgico. O aparelho de injeção deve ser mantido em uma superfície limpa limpo com etanol 70% durante o procedimento cirúrgico. Além disso, todo o equipamento utilizado durante o procedimento cirúrgico deve ser limpo, tanto antes como depois com etanol a 70%, com excepção de que as agulhas de injecção deve ser mantido já esterilizado e pronto para ser utilizado. Estas agulhas devem ser eliminados após a cirurgia e não reutilizado. </li><li> Finalmente, aspirar solução injectável que contém o vector de terapia desejado embalados gene viral ou células estaminais. Isto pode ser feito pelatendo-se a solução de injecção uma ponta de pipeta estéril, em seguida pipetando a solução sobre a superfície de um prato de cultura de células estéril. A solução pode agora ser facilmente aspirada para dentro da agulha de injecção com a seringa. A quantidade necessária irá variar, dependendo da idade do rato. Para os nossos propósitos, usamos pós-natais dia 5 ratos, que podem ser injectados com 0,5-0,8 uL de fluido de injecção. Quantidades menores, 0,5 ul ou menos, podem ser utilizadas para os ratos mais jovens e maiores quantidades, tais como 1 uL, pode ser utilizado para ratinhos adultos. O título virai ou o número de células tem de ser determinado com base nos vírus / células serem injectados e seus tecidos-alvo desejado, como muitas partículas virais ou células num pequeno volume pode levar à toxicidade para as células da retina. No vídeo, para efeitos de visualização, utilizou 1,5 ul, uma maior quantidade de corante que é necessário para injectar no olho. </li></ol> 2. Acessando o espaço sub-retiniana <ol><li> Dentro do ambiente estéril cirúrgico,estabilizar ou anestesiar o rato de acordo com o protocolo aprovado localmente manuseamento dos animais, a qual irá variar de acordo com a idade do rato. Anestesia comum para ratinhos adultos inclui o uso de gás isoflurano ou de uma injecção intra-peritoneal de 0,1 mL/10 g de peso corporal de cetamina (100 mg / ml) e xilazina (20 mg / ml) em solução salina estéril. Para ratinhos perinatais, as técnicas de anestesia comuns incluem o uso de gás ou isoflurano Crioanestesia (hipotermia). Todas as técnicas de anestesia deve ser aprovado pelo seu comitê local IACUC antes do uso. Normalmente usamos dia pós-natal (P) 5 murganhos, embora as técnicas similares podem ser aplicadas a ratinhos jovens como P0 ou camundongos adultos. O procedimento cirúrgico não pode começar até que o mouse deixou mover os membros e não responde mais aos pés pitadas. Para ratos perinatais, eles vão tornar-se visivelmente mais leve na cor já que o fluxo de sangue irá desacelerar, outra chave para saber que eles são totalmente sob anestesia. </li><li> Em camundongos perinatais, use Vannas tesouras retas para make uma incisão milímetros aproximado 1,5 ao longo da fissura a tampa fechada. Tenha o cuidado de cortar no recuo, onde o olho vai abrir naturalmente no futuro. Isso garante que as tampas se curar e abrir adequadamente durante o desenvolvimento do ratinho. A lâmina cirúrgica pode ser utilizada para esta finalidade, apesar de preferirmos Vannas tesoura, uma vez que reduzem o risco de perfurar o olho durante este procedimento. No vídeo, a tesoura foram usados ​​diretamente punção e corte ao longo da margem palpebral. Quando esta técnica de aprendizagem, uma pinça deve ser usada para levantar a pálpebra antes do corte, e reduzir o risco de danificar o olho. </li><li> Separar as pálpebras com uma pinça de vestir curvas para proptose do olho e beliscar as pálpebras ligeiramente debaixo do olho para mantê-lo proptose injectável. Se a incisão tampa feita em duas etapas é muito grande, o olho irá deslizar para trás sob as pálpebras e evitar a exposição adequada durante o processo de injecção. Para camundongos adultos, aplicando uma leve pressão ao redor dos olhos com o Dr.essing fórceps pode manter o olho proptose injectável. </li><li> Fazer uma pequena incisão escleral no ou posterior ao equador do globo arranhando a superfície com uma lâmina de microcirurgia de 15 graus. Esta incisão deve ser apenas suficientemente grande para passar a ponta da agulha de injecção, mas não maior do que isso. Se preferido, uma agulha de pequeno e afiado tal como uma agulha de acupuntura pode ser usada para fazer essa incisão para o espaço sub-retiniano, em vez da lâmina de microcirurgia. Em animais pigmentadas, um tecido de cor castanha-escura pigmentada (a coróide-retinal do epitélio pigmentar) irá tornar-se visível no ponto de incisão. Em mais leves ratos pigmentados ou albinos, uma caneta de marcação cirúrgica pode ser aplicada à ponta da lâmina da microcirurgia para deixar uma mancha de tinta que indica o local da incisão. Se claros refluxos (vítreo) de fluido a partir do local da incisão, a lâmina foi colocada demasiado profunda e entrou na cavidade vítrea e o vírus terapêutico ou células podem entrar no espaço durante a injecção intravítrea. Para visualizatiem fins, fizemos a incisão para este ponto do vídeo. É ainda possível realizar uma injecção sub-retiniana, neste caso, no entanto, o descolamento da retina causada pela presença do líquido de injecção não pode curar completamente neste rato. Por conseguinte, deve ser tomado cuidado para cortar apenas a superfície exterior do olho, e não através da retina, antes da injecção. </li><li> Cuidadosamente insira a agulha de injecção no local da incisão e fazê-la avançar paralelamente à parede exterior do olho para entrar no espaço sub-retiniano. Avançando muito perto da parede exterior ou demasiado profunda no interior do olho vai dirigir a injecção no local errado. O melhor método para compreender se a agulha está no local correto é praticar a técnica. Praticar em ratos levemente pigmentadas ou albino pode ajudar a fazer injeções precisos e exatos para o espaço sub-retiniano. Isto é porque o fluido de injecção da agulha e é visível dentro destes olhos. </li><li> Aplicar uma leve pressão sobre o êmbolo da seringa e havergin injecção do fluido desejado. Se a agulha é colocada corretamente dentro do espaço sub-retiniana, contrapressão moderada será sentida. Se a agulha se encontra dentro do corpo vítreo, haverá contrapressão significativamente menor e, potencialmente, um pouco de fluido de refluxo durante a injecção. Se houver contrapressão significativa, segure a agulha no lugar para, pelo menos, um período adicional de 15 segundos antes de remover a agulha lentamente. Isto irá permitir que a pressão intra-ocular elevada para igualar a refluxo em vez de vírus ou as células injectadas para trás para fora do local da incisão. Parte do ar e solução salina pode ser injectada no espaço sub-retiniano devido ao aumento da pressão necessária durante o processo de injecção. Cuidados devem ser tomados para não sobre-injetar ar ou salina, uma vez que pode expulsar o vírus injetado ou células do olho. É também possível provocar o descolamento da retina permanente da presença de muito líquido injectado no espaço sub-retiniano. Para efeitos de visualização, o excesso de corante e ar foi injectado into o espaço sub-retiniano do vídeo. Pode ser claramente visto como parte do corante será liberado de volta para fora do espaço sub-retiniano se muito é injectado, mas também como a bolha de ar permanece no interior do espaço sub-retinal e não desaparece para dentro do vítreo. Este foi usado para enfatizar que estas injecções estavam todos dentro do local correto do olho, para que se possa visualizar como a agulha deve entrar no local da incisão. Todas as injecções no espaço sub-retiniano provocar um descolamento da retina temporária devido à presença do fluido de injecção. Se o procedimento de injecção está terminada correctamente, este descolamento da retina temporária curará dentro de 24 horas e ratos podem ser utilizados para todas as experiências adicionais. O olho pode permanecer macio durante aproximadamente uma semana em função do procedimento cirúrgico, para uma segunda injecção deve ser evitado durante este período de tempo. </li><li> Para ratos neonatos, use a pinça de vestir curvas para empurrar cuidadosamente o olho para trás das pálpebras e na órbita. Pode ser útilde esperar por um minuto, a fim de permitir que o vírus se estabelecer no interior do espaço sub-retinal e não fazer com que seja empurrado para fora do local da incisão quando suavemente empurrando o olho de volta para a sua órbita. Após a cirurgia, uma gota de 0,5% de bupivacaína (marcaína) diluída a 0,25% em solução salina estéril a partir de uma agulha de calibre 25 pode ser colocado no local da injecção. Ratos não mostram sinais evidentes de desconforto após a cirurgia sub-retiniana e do uso de bupivacaína como um analgésico de longa ação tópica tem sido suficiente para os três anos anteriores. Ratos deve ser sempre monitorado após o procedimento cirúrgico para procurar por sinais de angústia, como infecção, inchaço, ou uma diminuição nas atividades habituais diárias do mouse. Se isso ocorrer, o veterinário deve ser notificado e medicamentos para a dor mais como a buprenorfina (0,05 mg / kg) pode ser administrado como uma injecção intraperitoneal. </li><li> Acordar o mouse da anestesia acordo com o protocolo aprovado localmente animais manuseio. O rato deve ser mantido em um p aquecimentoad para manter a temperatura corporal normal, uma vez que acorda da anestesia. O procedimento cirúrgico deve levar menos de cinco minutos para completar, não contando o tempo para o mouse se submeter a anestesia. Assim, uma almofada de aquecimento não é necessário durante o procedimento real, mas podem ser necessários quando se está a aprender a técnica como o processo pode demorar um longo período de tempo. O mouse não deve ser colocado de volta em uma gaiola limpa, até que começou a se mover por conta própria. Para recém-nascidos, pitadas toe suaves vai ajudar para que eles se recuperar totalmente da anestesia, e eles devem recuperar a sua cor-de-rosa e movimento antes de serem colocados de volta com a mãe. Ratos deve ser monitorado ao longo do tempo por quaisquer sinais de angústia como listado anteriormente. </li></ol>

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	<li>Abe, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+the+retina+using+pigment+epithelial+cell+transplantation.">Regeneration of the retina using pigment epithelial cell transplantation.</a> Nihon Ganka Gakkai Zasshi. 106, 778-803 (2002).</li><li>Jacobson, S. G., Cideciyan, A. V., Ratnakaram, R., Heon, E., Schwartz, S. B., Roman, A. J., Peden, M. C., Aleman, T. S., Boye, S. L., Sumaroka, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+therapy+for+Leber+congenital+amaurosis+caused+by+RPE65+mutations:+safety+and+efficacy+in+15+children+and+adults+followed+up+to+3+years.">Gene therapy for Leber congenital amaurosis caused by RPE65 mutations: safety and efficacy in 15 children and adults followed up to 3 years.</a> Arch. Ophthalmol. 130, 9-24 (2011).</li><li>Schwartz, S. D., Hubschman, J. P., Heilwell, G., Franco-Cardenas, V., Pan, C. K., Ostrick, R. M., Mickunas, E., Gay, R., Klimanskaya, I., Lanza, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell+trials+for+macular+degeneration:+a+preliminary+report.">Embryonic stem cell trials for macular degeneration: a preliminary report.</a> Lancet. 379, 713-720 (2012).</li><li>Wang, N. K., Tosi, J., Kasanuki, J. M., Chou, C. L., Kong, J., Parmalee, N., Wert, K. J., Allikmets, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+reprogrammed+embryonic+stem+cells+improves+visual+function+in+a+mouse+model+for+retinitis+pigmentosa.">Transplantation of reprogrammed embryonic stem cells improves visual function in a mouse model for retinitis pigmentosa.</a> Transplantation. 89, 911-919 (2010).</li><li>Song, B. J., Tsang, S. H., Lin, C. -. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+models+of+retinal+degeneration+and+targets+for+gene+therapy.">Genetic models of retinal degeneration and targets for gene therapy.</a> Gene Ther. Mol. Biol. 11, 229-262 (2007).</li><li>Tosi, J., Sancho-Pelluz, J., Davis, R. J., Hsu, C. W., Wolpert, K. V., Sengillo, J. D., Lin, C. S., Tsang, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentivirus-mediated+expression+of+cDNA+and+shRNA+slows+degeneration+in+retinitis+pigmentosa.">Lentivirus-mediated expression of cDNA and shRNA slows degeneration in retinitis pigmentosa.</a> Exp. Biol. Med. 236, 1211-1217 (2011).</li><li>Tucker, B. A., Park, I. H., Qi, S. D., Klassen, H. J., Jiang, C., Yao, J., Redenti, S., Daley, G. Q., Young, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+adult+mouse+iPS+cell-derived+photoreceptor+precursors+restores+retinal+structure+and+function+in+degenerative+mice.">Transplantation of adult mouse iPS cell-derived photoreceptor precursors restores retinal structure and function in degenerative mice.</a> PLoS One. 6, e189992 (2011).</li><li>Mahajan, V. B., Mondino, B. J., Tsang, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> A high-throughput Mouse Eye Phenomics System. , (2010).</li><li>Chang, B., Hawes, N. L., Hurd, R. E., Davisson, M. T., Nusinowitz, S., Heckenlively, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+degeneration+mutants+in+the+mouse.">Retinal degeneration mutants in the mouse.</a> Vision Res. 42, 517-525 (2002).</li><li>Hawes, N. L., Smith, R. S., Chang, B., Davisson, M., Heckenlively, J. R., John, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+fundus+photography+and+angiography:+a+catalogue+of+normal+and+mutant+phenotypes.">Mouse fundus photography and angiography: a catalogue of normal and mutant phenotypes.</a> Mol. Vis. 5, 22 (1999).</li><li>Won, J., Shi, L. Y., Hicks, W., Wang, J., Hurd, R., Naggert, J. K., Chang, B., Nishina, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+model+resources+for+vision+research.">Mouse model resources for vision research.</a> J. Ophthalmol. 2011, 391384 (2011).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Esta técnica de vídeo fornece instruções sobre a conclusão do procedimento de injecção sub-retiniana cirúrgica com sucesso, e de assegurar que o vector de terapia de gene ou células estaminais são colocados no local necessário para tratar eficientemente a doença oftálmica. Esta técnica permite o direccionamento de células da retina, tais como o RPE ou fotorreceptores, uma vez que coloca os vectores de terapia genética e de células-tronco derivadas de tecidos na vizinhança destas células. Métodos ante...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome </td><td> Companhia </td><td> Catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> 0,8-1,10 x 100 mm Tubo Capilar (de vidro) </td><td> Kimble Glass, Inc. </td><td> 34502 99 </td><td></td></tr><tr><td> Flaming / Brown Micropipeta Puller </td><td> Instrumento Sutter </td><td> P-97 </td><td> Narishige microforge podem ser usados ​​em seu lugar. Catalog # MF-900 </td></tr><tr><td> Sigmacote </td><td> Sigma Aldrich </td><td> SL2-25ML </td><td> Silicone </td></tr><tr><td> Fosfato de Dubecco salina tamponada com cloreto de cálcio e cloreto de magnésio </td><td> Gibco-Invitrogen </td><td> 14040-133 </td><td></td></tr><tr><td> Safety-Lok 25 3/4G x 12 &quot;; Conjunto de coleta de sangue </td><td> BD Vacutainer </td><td> 367298 </td><td></td></tr><tr><td> 1 ml Sub-Q 26Seringa deslizamento Tip-5/8G </td><td> Becton-Dickinson </td><td> 309597 </td><td></td></tr><tr><td> 0,5-10 ul Finnpipette II pipeta ajustável-Volume </td><td> Fisherbrand </td><td> 21-377-815 </td><td></td></tr><tr><td> 1-200 uL Naturais Dicas chanfradas </td><td> EUA Scientific, Inc. </td><td> 1111-1700 </td><td></td></tr><tr><td> Discovery.V8 microscópio estéreo </td><td> Zeiss </td><td> MC1500 </td><td></td></tr><tr><td> 60 mm x 15 mm Estilo Tratada poliestireno placa de cultura celular </td><td> Corning Incorporated </td><td> 430166 </td><td></td></tr><tr><td> Tesoura Vannas retas </td><td> Storz Ophthalmics </td><td> E3383 S </td><td></td></tr><tr><td> Fórceps curvas de vestir com serrilhas delicadas </td><td> Storz Ophthalmics </td><td> E1408 </td><td></td></tr><tr><td> 15 Faca Microcirurgia Grau </td><td> Wilsem Oftalmologia Corp </td><td> 091204 </td><td></td></tr><tr><td> Cetamina </td><td> Ketaset III </td><td> NADA # 45-290 </td><td></td></tr><tr><td> Xilazina </td><td> Lloyd Laboratories </td><td> NADA # 139-236 </td><td></td></tr><tr><td> Bupivacaína (Marcaine) </td><td> AstraZeneca </td><td> N / A </td><td></td></tr><tr><td> Buprenorfina </td><td> Sigma Aldrich </td><td> B9275 </td><td></td></tr></tbody></table>

subretinal injection of gene therapy vectors and stem cells in the perinatal mouse eye

A perda de visão afeta cerca de 3,4 milhões de pessoas nos Estados Unidos e deverá aumentar nos próximos anos. 1 Recentemente, a terapia genética e os transplantes de células-tronco tornaram-se importantes ferramentas terapêuticas para o tratamento da cegueira resultante de doenças degenerativas da retina. Várias formas de transplante autólogo de idade degeneração macular relacionada à (AMD), como a íris transplante de células epiteliais pigmentares, têm gerado resultados animadores, e testes clínicos em humanos começaram a outras formas de terapias com células-tronco e genética. 2 Estes incluem a substituição RPE65 gene A terapia em pacientes com amaurose congénita de Leber e um transplante de células RPE humanas utilizando estaminais embrionárias (ES) células na doença de Stargardt. 3-4 Agora que existem vectores de terapia genética e de células estaminais disponíveis para o tratamento de pacientes com doenças da retina, é importante verificar estas terapias potenciais em modelos animais antes de aplicarção deles em estudos humanos. O ratinho tornou-se um modelo importante científica para testar a eficácia terapêutica de vectores de terapia génica e transplante de células estaminais no olho. 5-8 Neste artigo de vídeo, é apresentada uma técnica de injectar vectores de terapia génica ou de células estaminais para o espaço sub-retiniano do o olho do rato, minimizando os danos para o tecido circundante.

Um desenho do olho do rato é mostrado com grandes estruturas marcadas para referência, com setas que indicam os locais para os procedimentos de injeção intravítrea e sub-retiniana, tanto cirúrgicos (pontas de seta, Figura 1). Vectores de terapia génica, tais como a lentiviral vector lacZ (Figura 2), pode ser injectada usando estes locais. Além disso, as células estaminais, como células estaminais embrionárias de rato (Figura 3), podem também ser tra...

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Subretinal Injection of Gene Therapy Vectors and Stem Cells in the Perinatal Mouse Eye

Esta técnica cirúrgica ilustra a injecção de vectores de terapia genética e de células estaminais para o espaço sub-retiniano do olho do rato.

Injeção de sub-retiniana de Vetores da terapia genética e células-tronco no olho do rato

The loss of sight affects approximately 3.4 million people in the United States and is expected to increase in the upcoming years.1 Recently, gene therapy ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

33.1K visualizações.  Columbia University. Esta técnica cirúrgica ilustra a injecção de vectores de terapia genética e de células estaminais para o espaço sub-retiniano do olho do rato.

Vídeo: Subretinal Injection of Gene Therapy Vectors and Stem Cells in the Perinatal Mouse Eye

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural connectivity form during development. In mice, retinofugal projections are arranged in a topographic manner and form eye-specific layers in the Lateral Geniculate Nucleus (dLGN) of the thalamus and the Superior Colliculus (SC). The development of these precise patterns of retinofugal projections has typically been studied by labeling populations of RGCs with fluorescent dyes and tracers, such as horseradish peroxidase1-4. However, these methods are too coarse to provide insight into developmental changes in individual RGC axonal arbor morphology that are the basis of retinotopic map formation. They also do not allow for the genetic manipulation of RGCs.
Recently, electroporation has become an effective method for providing precise spatial and temporal control for delivery of charged molecules into the retina5-11. Current retinal electroporation protocols do not allow for genetic manipulation and tracing of retinofugal projections of a single or small cluster of RGCs in postnatal mice. It has been argued that postnatal in vivo electroporation is not a viable method for transfecting RGCs since the labeling efficiency is extremely low and hence requires targeting at embryonic ages when RGC progenitors are undergoing differentiation and proliferation6. 
In this video we describe an in vivo electroporation protocol for targeted delivery of genes, shRNA, and fluorescent dextrans to murine RGCs postnatally. This technique provides a cost effective, fast and relatively easy platform for efficient screening of candidate genes involved in several aspects of neural development including axon retraction, branching, lamination, regeneration and synapse formation at various stages of circuit development. In summary we describe here a valuable tool which will provide further insights into the molecular mechanisms underlying sensory map development.

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

We demonstrate an in vivo electroporation protocol for transfecting single or small clusters of retinal ganglion cells (RGCs) and other retinal cell types in postnatal mice over a wide range of ages. The ability to label and genetically manipulate postnatal RGCs in vivo is a powerful tool for developmental studies.

Transfecção de células de camundongo por Ganglionares da Retina In vivo Eletroporação

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

Neurociência

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge. Gene targeting to generate constitutive or conditional loss of function knockouts remains cost and labor intensive, as well as time consuming. Adding to these challenges, retina expressed genes may have essential roles outside the retina leading to unintended confounds when using a knockout approach. Furthermore, the ability to ectopically express a gene in a gain of function experiment can be extremely valuable when attempting to identify a role in cell fate specification and/or terminal differentiation.
We present a method for the rapid and efficient incorporation of DNA plasmids into the neonatal mouse retina by electroporation. The application of short electrical impulses above a certain field strength results in a transient increase in plasma membrane permeability, facilitating the transfer of material across the membrane 1,2,3,4. Groundbreaking work demonstrated that electroporation could be utilized as a method of gene transfer into mammalian cells by inducing the formation of hydrophilic plasma membrane pores allowing the passage of highly charged DNA through the lipid bilayer 5. Continuous technical development has resulted in the viability of electroporation as a method for in vivo gene transfer in multiple mouse tissues including the retina, the method for which is described herein 6, 7, 8, 9, 10. 
DNA solution is injected into the subretinal space so that DNA is placed between the retinal pigmented epithelium and retina of the neonatal (P0) mouse and electrical pulses are applied using a tweezer electrode. The lateral placement of the eyes in the mouse allows for the easy orientation of the tweezer electrode to the necessary negative pole-DNA-retina-positive pole alignment. Extensive incorporation and expression of transferred genes can be identified by postnatal day 2 (P2). Due to the lack of significant lateral migration of cells in the retina, electroporated and non-electroporated regions are generated. Non-electroporated regions may serve as internal histological controls where appropriate. 
Retinal electroporation can be used to express a gene under a ubiquitous promoter, such as CAG, or to disrupt gene function using shRNA constructs or Cre-recombinase. More targeted expression can be achieved by designing constructs with cell specific gene promoters. Visualization of electroporated cells is achieved using bicistronic constructs expressing GFP or by co-electroporating a GFP expression construct. Furthermore, multiple constructs may be electroporated for the study of combinatorial gene effects or simultaneous gain and loss of function of different genes. Retinal electroporation may also be utilized for the analysis of genomic cis-regulatory elements by generating appropriate expression constructs and deletion mutants. Such experiments can be used to identify cis-regulatory regions sufficient or required for cell specific gene expression 11. Potential experiments are limited only by construct availability.

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

A method for the incorporation of plasmid DNA into murine retinal cells for the purpose of performing either gain- or loss of function studies in vivo is presented. This method capitalizes on the transient increase in permeability of cell plasma membranes induced by the application of an external electrical field.

Em Eletroporação vivo de Retina do rato em desenvolvimento

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge.  Gene targeting to generate ...

Retinal Detachment Model in Rodents by Subretinal Injection of Sodium Hyaluronate

Subretinal injection of sodium hyaluronate is a widely accepted method of inducing retinal detachment (RD). However, the height and duration of RD or the occurrence of subretinal hemorrhage can affect photoreceptor cell death in the detached retina. Hence, it is advantageous to create reproducible RDs without subretinal hemorrhage for evaluating photoreceptor cell death. We modified a previously reported method to create bullous and persistent RDs in a reproducible location with rare occurrence of subretinal hemorrhage. The critical step of this modified method is the creation of a self-sealing scleral incision, which can prevent leakage of sodium hyaluronate after injection into the subretinal space. To make the self-sealing scleral incision, a scleral tunnel is created, followed by scleral penetration into the choroid with a 30 G needle. Although choroidal hemorrhage may occur during this step, astriction with a surgical spear reduces the rate of choroidal hemorrhage. This method allows a more reproducible and reliable model of photoreceptor death in diseases that involve RD such as rhegmatogenous RD, retinopathy of prematurity, diabetic retinopathy, central serous chorioretinopathy, and age-related macular degeneration (AMD).

Creating experimental retinal detachments with a reproducible and sustained height of detachment, and without subretinal hemorrhage, is important for studying the pathophysiology of photoreceptor cell loss in retinal disease and evaluating potential therapeutic interventions. Here, we report such a method in detail.

Descolamento de Retina modelo em roedores por injeção sub-retiniana de hialuronato de sódio

Subretinal injection of sodium hyaluronate is a widely accepted method of inducing retinal detachment (RD). However, the height and duration of RD or the ...

Medicina

In utero and ex vivo Electroporation for Gene Expression in Mouse Retinal Ganglion Cells

The retina and its sole output neuron, the retinal ganglion cell (RGC), comprise an excellent model in which to examine biological questions such as cell differentiation, axon guidance, retinotopic organization and synapse formation[1]. One drawback is the inability to efficiently and reliably manipulate gene expression in RGCs in vivo, especially in the otherwise accessible murine visual pathways. Transgenic mice can be used to manipulate gene expression, but this approach is often expensive, time consuming, and can produce unwanted side effects. In chick, in ovo electroporation is used to manipulate gene expression in RGCs for examining retina and RGC development. Although similar electroporation techniques have been developed in neonatal mouse pups[2], adult rats[3], and embryonic murine retinae in vitro[4], none of these strategies allow full characterization of RGC development and axon projections in vivo. To this end, we have developed two applications of electroporation, one in utero and the other ex vivo, to specifically target embryonic murine RGCs[5, 6]. 
With in utero retinal electroporation, we can misexpress or downregulate specific genes in RGCs and follow their axon projections through the visual pathways in vivo, allowing examination of guidance decisions at intermediate targets, such as the optic chiasm, or at target regions, such as the lateral geniculate nucleus. Perturbing gene expression in a subset of RGCs in an otherwise wild-type background facilitates an understanding of gene function throughout the retinal pathway. Additionally, we have developed a companion technique for analyzing RGC axon growth in vitro. We electroporate embryonic heads ex vivo, collect and incubate the whole retina, then prepare explants from these retinae several days later. Retinal explants can be used in a variety of in vitro assays in order to examine the response of electroporated RGC axons to guidance cues or other factors. In sum, this set of techniques enhances our ability to misexpress or downregulate genes in RGCs and should greatly aid studies examining RGC development and axon projections.

In utero and ex vivo Electroporation for Gene Expression in Mouse Retinal Ganglion Cells

Here we present two techniques for manipulating gene expression in murine retinal ganglion cells (RGCs) by in utero and ex vivo electroporation. These techniques enable one to examine how alterations in gene expression affect RGC development, axon guidance, and functional properties.

No útero e ex eletroporação in vivo para Expressão Gênica em células ganglionares da retina do rato

The retina and its sole output neuron, the retinal ganglion cell (RGC), comprise an excellent model in which to examine biological questions such as cell ...

Biologia

Performing Subretinal Injections in Rodents to Deliver Retinal Pigment Epithelium Cells in Suspension

The conversion of light into electrical impulses occurs in the outer retina and is accomplished largely by rod and cone photoreceptors and retinal pigment epithelium (RPE) cells. RPE provide critical support for photoreceptors and death or dysfunction of RPE cells is characteristic of age-related macular degeneration (AMD), the leading cause of permanent vision loss in people age 55 and older. While no cure for AMD has been identified, implantation of healthy RPE in diseased eyes may prove to be an effective treatment, and large numbers of RPE cells can be readily generated from pluripotent stem cells. Several interesting questions regarding the safety and efficacy of RPE cell delivery can still be examined in animal models, and well-accepted protocols used to inject RPE have been developed. The technique described here has been used by multiple groups in various studies and involves first creating a hole in the eye with a sharp needle. Then a syringe with a blunt needle loaded with cells is inserted through the hole and passed through the vitreous until it gently touches the RPE. Using this injection method, which is relatively simple and requires minimal equipment, we achieve consistent and efficient integration of stem cell-derived RPE cells in between the host RPE that prevents significant amount of photoreceptor degeneration in animal models. While not part of the actual protocol, we also describe how to determine the extent of the trauma induced by the injection, and how to verify that the cells were injected into the subretinal space using in vivo imaging modalities. Finally, the use of this protocol is not limited to RPE cells; it may be used to inject any compound or cell into the subretinal space.

Here we present a community accepted protocol in multimedia format for subretinally injecting a bolus of RPE cells in rats and mice. This approach can be used for determining rescue potentials, safety profiles, and survival capacities of grafted RPE cells upon implantation in animal models of retinal degeneration.

Realizando Subretinal Injeções em roedores para entregar epitélio pigmentar da retina células em suspensão

The conversion of light into electrical impulses occurs in the outer retina and is accomplished largely by rod and cone photoreceptors and retinal pigment ...

Limbal Approach-Subretinal Injection of Viral Vectors for Gene Therapy in Mice Retinal Pigment Epithelium

The eye is a small and enclosed organ which makes it an ideal target for gene therapy. Recently various strategies have been applied to gene therapy in retinopathies using non-viral and viral gene delivery to the retina and retinal pigment epithelium (RPE). Subretinal injection is the best approach to deliver viral vectors directly to RPE cells. Before the clinical trial of a gene therapy, it is inevitable to validate the efficacy of the therapy in animal models of various retinopathies. Thus, subretinal injection in mice becomes a fundamental technique for an ocular gene therapy. In this protocol, we provide the easy and replicable technique for subretinal injection of viral vectors to experimental mice. This technique is modified from the intravitreal injection, which is widely used technique in ophthalmology clinics. The representative results of RPE/choroid/scleral complex flat-mount will help to understand the efficacy of this technique and adjust the volume and titer of viral vectors for the extent of gene transduction.

Subretinal injection is a surgical technique for effective gene delivery to retinal pigment epithelium in the mouse eye. Here we describe an easy and replicable method for subretinal injection of viral vectors to retinal pigment epithelium in experimental mice.

Limbo Abordagem-Subretinal injeção de vetores virais para terapia genética em ratos Retinal Pigment Epithelium

The eye is a small and enclosed organ which makes it an ideal target for gene therapy. Recently various strategies have been applied to gene therapy in ...

An Alternative and Validated Injection Method for Accessing the Subretinal Space via a Transcleral Posterior Approach

Subretinal injections have been successfully used in both humans and rodents to deliver therapeutic interventions of proteins, viral agents, and cells to the interphotoreceptor/subretinal compartment that has direct exposure to photoreceptors and the retinal pigment epithelium (RPE). Subretinal injections of plasminogen as well as recent preclinical and clinical trials have demonstrated safety and/or efficacy of delivering viral vectors and stem cells to individuals with advanced retinal disease. Mouse models of retinal disease, particularly hereditary retinal dystrophies, are essential for testing these therapies. The most common injection procedure in rodents is to use small transcorneal or transcleral incisions with an anterior approach to the retina. With this approach, the injection needle penetrates the neurosensory retina disrupting the underlying RPE and on insertion can easily nick the lens, causing lens opacification and impairment of noninvasive imaging. Accessing the subretinal space via a transcleral, posterior approach avoids these problems: the needle crosses the sclera approximately 0.5 mm from the optic nerve, without retinal penetration and avoids disrupting the vitreous. Collateral damage is limited to that associated with the focal sclerotomy and the effects of a transient, serous retinal detachment. The simplicity of the method minimizes ocular injury, ensures rapid retinal reattachment and recovery, and has a low failure rate. The minimal damage to the retina and RPE allows for clear assessment of the efficacy and direct effects of the therapeutic agents themselves. This manuscript describes a novel subretinal injection technique that can be used to target viral vectors, pharmacological agents, stem cells or induced pluripotent stem (iPS) cells to the subretinal space in mice with high efficacy, minimal damage, and fast recovery.

An Alternative and Validated Injection Method for Accessing the Subretinal Space via a Transcleral Posterior Approach

Subretinal injections are the most common technique for delivering large therapeutic agents such as proteins and viral vectors to photoreceptors and the retinal pigment epithelium. An alternative method in mice that successfully targets the subretinal space with minimal collateral damage and fast recovery times is described here.

Um método de injeção Alternativa e validado para acessar o espaço sub-retiniano<i&gt; via</i&gt; Uma abordagem transcleral Posterior

Subretinal injections have been successfully used in both humans and rodents to deliver therapeutic interventions of proteins, viral agents, and cells to ...

Ultrahigh Resolution Mouse Optical Coherence Tomography to Aid Intraocular Injection in Retinal Gene Therapy Research

HR-SD-OCT is utilized to monitor the progression of photoreceptor degeneration in live mouse models, assess the delivery of therapeutic agents into the subretinal space, and to evaluate toxicity and efficacy in vivo. HR-SD-OCT uses near infrared light (800-880 nm) and has optics specifically designed for the unique optics of the mouse eye with sub-2-micron axial resolution. Transgenic mouse models of outer retinal (photoreceptor) degeneration and controls were imaged to assess the disease progression. Pulled glass microneedles were used to deliver sub retinal injections of adeno-associated virus (AAV) or nanoparticles (NP) via a trans-scleral and trans-choroidal approach. Careful positioning of the needle into the subretinal space was required prior to a calibrated pressure injection, which delivers fluid into the sub retinal space. Real time subretinal surgery was conducted on our retinal imaging system (RIS). HR-SD-OCT demonstrated progressive uniform retinal degeneration due to expression of a toxic mutant human mutant rhodopsin (P347S) (RHOP347S) transgene in mice. HR-SD-OCT allows rigorous quantification of all the retinal layers. Outer nuclear layer (ONL) thickness and photoreceptor outer segment length (OSL) measurements correlate with photoreceptor vitality, degeneration, or rescue. The RIS delivery system allows real-time visualization of subretinal injections in neonatal (~P10-14) or adult mice, and HR-SD-OCT immediately determines success of delivery and maps areal extent. HR-SD-OCT is a powerful tool that can evaluate the success of subretinal surgery in mice, in addition to measuring vitality of photoreceptors in vivo. HR-SD-OCT can also be used to identify uniform animal cohorts to evaluate the extent of retinal degeneration, toxicity, and therapeutic rescue in preclinical gene therapy research studies.

Here we demonstrate a novel approach to using high resolution spectral-domain optical coherence tomography (HR-SD-OCT) to assist delivery of gene therapy agents into the subretinal space, assess its areal coverage, and characterize photoreceptor vitality.

Tomografia de coerência óptica Mouse ultra alta resolução para auxiliar a injeção intra-ocular em pesquisa de terapia de genes da retina

HR-SD-OCT is utilized to monitor the progression of photoreceptor degeneration in live mouse models, assess the delivery of therapeutic agents into the ...

Subretinal Transplantation of Human Embryonic Stem Cell-Derived Retinal Tissue in a Feline Large Animal Model

Retinal degenerative (RD) conditions associated with photoreceptor loss such as age-related macular degeneration (AMD), retinitis pigmentosa (RP) and Leber Congenital Amaurosis (LCA) cause progressive and debilitating vision loss. There is an unmet need for therapies that can restore vision once photoreceptors have been lost. Transplantation of human pluripotent stem cell (hPSC)-derived retinal tissue (organoids) into the subretinal space of an eye with advanced RD brings retinal tissue sheets with thousands of healthy mutation-free photoreceptors and has a potential to treat most/all blinding diseases associated with photoreceptor degeneration with one approved protocol. Transplantation of fetal retinal tissue into the subretinal space of animal models and people with advanced RD has been developed successfully but cannot be used as a routine therapy due to ethical concerns and limited tissue supply. Large eye inherited retinal degeneration (IRD) animal models are valuable for developing vision restoration therapies utilizing advanced surgical approaches to transplant retinal cells/tissue into the subretinal space. The similarities in globe size, and photoreceptor distribution (e.g., presence of macula-like region area centralis) and availability of IRD models closely recapitulating human IRD would facilitate rapid translation of a promising therapy to the clinic. Presented here is a surgical technique of transplanting hPSC-derived retinal tissue into the subretinal space of a large animal model allowing assessment of this promising approach in animal models.

Presented here is a surgical technique for transplanting human pluripotent stem cell (hPSC)-derived retinal tissue into the subretinal space of a large animal model.

Transplante Sub-Retiniano de Tecido Retiniano Derivado de Células-Tronco Embrionárias Humanas em Modelo Animal de Grande Porte Felino

Retinal degenerative (RD) conditions associated with photoreceptor loss such as age-related macular degeneration (AMD), retinitis pigmentosa (RP) and ...

Transpupillary-Guided Trans-Scleral Transplantation of Subretinal Grafts in a Retinal Degeneration Mouse Model

Transplantation of photoreceptor cells and retinal pigment&#160;epithelial (RPE) cells provide a potential therapy for retinal degeneration diseases. Subretinal transplantation of therapeutic donor cells into mouse recipients is challenging due to the limited surgical space allowed by the small volume of the mouse eye. We developed a trans-scleral surgical transplantation platform with direct transpupillary vision guidance to facilitate the subretinal delivery of exogenous cells in mouse recipients. The platform was tested using retinal cell suspensions and three-dimensional retinal sheets collected from rod-rich Rho::EGFP mice and cone-rich OPN1LW-EGFP;NRL-/- mice, respectively. Live/dead assay showed low cell mortality for both forms of donor cells. Retinal grafts were successfully delivered into the subretinal space of a mouse model of retinal degeneration, Rd1/NS, with minimum surgical complications as detected by multimodal confocal scanning laser ophthalmoscope (cSLO) imaging. Two months post-transplantation, histological staining demonstrated evidence of advanced maturation of the retinal grafts into &#39;adult&#39; rods and cones (by robust Rho::EGFP, S-opsin, and OPN1LW:EGFP expression, respectively) in the subretinal space. Here, we provide a surgical platform that can enable highly accurate subretinal delivery with a low rate of complications in mouse recipients. This technique offers precision and relative ease of skill acquisition. Furthermore, the technique could be used not only for studies of subretinal cell transplantation but also for other intraocular therapeutic studies including gene therapies.

This protocol presents a transpupillary vision-guided trans-scleral approach to safely and precisely deliver subretinal cellular grafts, with a low rate of surgical complications, in mouse recipients with or without retinal degeneration.

Transplante transpupilar-guiado trans-escleral de enxertos sub-retinianos em modelo de camundongo com degeneração retiniana

Transplantation of photoreceptor cells and retinal pigment&#160;epithelial (RPE) cells provide a potential therapy for retinal degeneration diseases. ...

Injeção de sub-retiniana de Vetores da terapia genética e células-tronco no olho do rato

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