Estos estudios fueron financiados en parte por el NIH UO1HL107443-01 Premio a GJM y GM.

1. El aislamiento y la expansión de las células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) DÍA 0 <ol><li> Dibujar 4 ml de sangre periférica en un tubo BD Vacutainer CPT Preparación célula con citrato de sodio. Invertir el tubo de 8 a 10 veces y centrifugar a 1.800 xg durante 30 min a temperatura ambiente. Idealmente, este paso se debe hacer dentro de 2 horas de recogida. </li><li> Recoger las células mononucleares (MC) pipeteando la capa leucocitaria (capa de células de barrera entre el gel y plasma) en un tubo estéril de 15 ml de centrífuga cónico. Llevar a un volumen total de 10 ml estéril con salina tamponada con fosfato (PBS), invertir varias veces y centrifugar a 300 xg durante 15 min. </li><li> Resuspender las células en 10 ml de PBS estéril y realizar el recuento de células. Transferir 1 a 2x10 6 células en un tubo de centrífuga estéril de 15 ml cónico y se centrifuga a 300 xg durante 10 min. </li><li> Resuspender las células en 2 ml de medio de expansión (EM) (QBSF-60 Stem medio celular que contenía 50 mg / ml AscoÁcido RBIC, 50 ng / ml de SCF, 10 ng / ml de IL-3, 2 U / ml de EPO, 40 ng / ml de IGF-1, dexametasona 1 mM y 100 mg / ml o primocin 1% Pen / Strep) y transferir a un pocillo de una placa de 12 pocillos. Se incuban las células en un 37 ° C, 5% de CO 2 incubadora. </li><li> Centrifugar las células restantes a 300 x g durante 10 min y congelación ~ 2x10 6 células / vial en FBS que contenía 10% de DMSO. </li><li> Para iniciar el protocolo utilizando PBMCs congeladas, descongelar 1 vial de células en 10 ml de medio de QBSF y centrifugar a 300 xg durante 10 min. Resuspender las células en 2 ml de EM y transferir a un pocillo de una placa de 12 pocillos. Se incuban las células en un 37 ° C, 5% de CO 2 incubadora. </li></ol> Los días 3 y 6 <ol start="17"><li> Transferir las células a un tubo estéril de 15 ml cónico y lavar el bien una vez con 1 ml de QBSF-60 Media de células madre para recoger las células adherentes. </li><li> Centrifugar las células a 300 xg durante 10 min. </li><li> Resuspender las células en 2 ml de EM y transferir a un pocillo de un 12Y placa. Se incuban las células en un 37 ° C, 5% de CO 2 incubadora. </li></ol> 2. La transducción de las PBMCs con STEMCCA Lentivirus DÍA 9 <ol><li> Transferir las células a un tubo estéril de 15 ml cónico y lavar el bien una vez con 1 ml de QBSF-60 Media de células madre para recoger las células adherentes. </li><li> Centrifugar las células a 300 xg durante 10 min. </li><li> Resuspender las células en 1 ml de EM fresco que contenía 5 mg / ml de polibreno y lentivirus STEMCCA (MOI = 1 a 10) y la transferencia a un pocillo de una placa de 12 pocillos. (El protocolo que describe la producción de partículas lentivirales se puede encontrar en <a href="http://www.bumc.bu.edu/stemcells/protocols/" target="_blank">http://www.bumc.bu.edu/stemcells/protocols/</a> ) </li><li> Se centrifuga la placa a 2.250 rpm a 25 ° C durante 90 min. </li><li> Después de girar, agregar un adicional de 1 ml de EM frescas que contiene 5 g / ml de polibreno durante un total de 2 ml de medio y se incuba la placa en un 37 ° C,5% de CO 2 incubadora. </li></ol> DÍA 10 <ol start="16"><li> Transferir las células a un tubo estéril de 15 ml cónico y lavar el bien una vez con 1 ml de QBSF-60 Media de células madre para recoger las células adherentes. </li><li> Centrifugar las células a 300 xg durante 10 min. </li><li> Resuspender las células en 2 ml de EM y transferir a 1 pocillo de una placa de 12 pocillos. Se incuban las células en un 37 ° C, 5% de CO 2 incubadora. </li></ol> 3. Revestimiento células transducidas en MEFs DÍA 11 <ol><li> Recubrir los pocillos de una placa de 6 pocillos con 0,1% de gelatina y fibroblastos placa inactivadas embriones de ratón (MEFs) a 2x10 5 células / pocillo en medio de MEF (IMDM que contenía 10% de FBS, 1% no aminoácidos esenciales, 100 mM β- mercaptoetanol, 2 mM L-glutamina, 100 mg / ml o primocin 1% Pen / Strep). Prepare 3 pozos por infección. </li></ol> DÍA 12 <ol start="2"><li> Transferir las células a un tubo estéril de 15 ml cónico<html> y lavar el pozo una vez con 1 ml de QBSF-60 Media de células madre para recoger las células adherentes. </li><li> Resuspender las células en 3 ml de medio de MEF que contiene 10 ng / ml de bFGF, y ácido ascórbico y los factores de crecimiento en las mismas concentraciones que se utilizan en EM media (50 mg / ml de ácido ascórbico, 50 ng / ml de SCF, 10 ng / ml IL -3, 2 U / ml de EPO, 40 ng / ml de IGF-1, 1 mM de dexametasona). </li><li> Placa de 1 ml de células por pocillo de una placa de 6 pocillos que contenía MEFs. Añadir 1,5 ml de MEF medios de comunicación con el bFGF, ácido ascórbico, y factores de crecimiento para un total de 2,5 ml de medio / pocillo. </li><li> Se centrifuga la placa a 500 rpm a 25 ° C durante 30 min. Se incuba la placa en un 37 ° C, 5% de CO 2 incubadora. </li></ol> DÍA 14 <ol start="6"><li> Células de alimentación cada dos días con 2,5 ml de medio de MEF que contienen 10 ng / ml de bFGF y 50 ug / ml de ácido ascórbico (sin factores de crecimiento). Aspirar y desechar las células flotantes con cada toma. </li><li> Añadir MEFs adicional cuando sea necesario (generalmente una vez a la semana). </li></ol>p &quot;&gt; ~ DÍA 20 <ol start="8"><li> Una vez que aparecen pequeñas colonias, las células de alimentación diaria con 2 ml de células madre embrionarias humanas (hESC) medio (DMEM/F12 que contiene reemplazo del 20% Knockout Serum, 1% no aminoácidos esenciales, 100 mM β-mercaptoetanol, 2 mM L-glutamina , 100 mg / ml o primocin 1% Pen / Strep y 10 ng / ml de bFGF). </li></ol> 4. Picking y expansión de clones de IPSC ~ DÍA 30 a 40 <ol><li> Recoger cada colonia en pocillos individuales de una placa de 12-así pre-siembra con MEFs inactivada que contiene 1 ml / pocillo de medio de hESC más 10 mM de Stemolecule Y27632 (ROCK inhibidor). </li><li> Alimentar a las células al día posteriormente con 1 ml de medio de hESC sólo (sin inhibidor ROCK). </li></ol> 5. La tinción de inmunofluorescencia para marcadores de pluripotencia <ol><li> La tinción se realizó utilizando el kit &quot;célula ES Marker Kit de muestra&quot; de Millipore y siguiendo el protocolo del fabricante. </li></ol> 6. Escisión de Integnominal STEMCCA Vector <ol><li> Escisión de reprogramación casete se logra utilizando un Cre-IRES-Puro expresando vector de transfección y tras breve selección puromicina como se describe 6. </li></ol>

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	<li>Lowry, W. E., Richter, L., Yachechko, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+from+dermal+fibroblasts.">Generation of human induced pluripotent stem cells from dermal fibroblasts.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 2883-2888 (2008).</li><li>Park, I. H., Zhao, R., West, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+of+human+somatic+cells+to+pluripotency+with+defined+factors.">Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with defined factors.</a> Nature. 451, 141-146 (2008).</li><li>Takahashi, K., Tanabe, K., Ohnuki, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors.">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131, 861-872 (2007).</li><li>Yu, J., Vodyanik, M. A., Smuga-Otto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cell+lines+derived+from+human+somatic+cells.">Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells.</a> Science. 318, 1917-1920 (2007).</li><li>Stadtfeld, M., Hochedlinger, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotency:+history,+mechanisms,+and+applications.">Induced pluripotency: history, mechanisms, and applications.</a> Genes Dev. 24, 2239-2263 (2010).</li><li>Somers, A., Jean, J. C., Sommer, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+transgene-free+lung+disease-specific+human+induced+pluripotent+stem+cells+using+a+single+excisable+lentiviral+stem+cell+cassette.">Generation of transgene-free lung disease-specific human induced pluripotent stem cells using a single excisable lentiviral stem cell cassette.</a> Stem Cells. 28, 1728-1740 (2010).</li><li>Loh, Y. H., Hartung, O., Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+of+T+cells+from+human+peripheral+blood.">Reprogramming of T cells from human peripheral blood.</a> Cell Stem Cell. 7, 15-19 (2010).</li><li>Seki, T., Yuasa, S., Oda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+induced+pluripotent+stem+cells+from+human+terminally+differentiated+circulating+T+cells.">Generation of induced pluripotent stem cells from human terminally differentiated circulating T cells.</a> Cell Stem Cell. 7, 11-14 (2010).</li><li>Staerk, J., Dawlaty, M. M., Gao, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+of+human+peripheral+blood+cells+to+induced+pluripotent+stem+cells.">Reprogramming of human peripheral blood cells to induced pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 7, 20-24 (2010).</li><li>Chou, B. K., Mali, P., Huang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+human+iPS+cell+derivation+by+a+non-integrating+plasmid+from+blood+cells+with+unique+epigenetic+and+gene+expression+signatures.">Efficient human iPS cell derivation by a non-integrating plasmid from blood cells with unique epigenetic and gene expression signatures.</a> Cell Res. 21, 518-529 (2011).</li><li>vanden Akker, E., Satchwell, T. J., Pellegrin, S., Daniels, G., Toye, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+majority+of+the+in+vitro+erythroid+expansion+potential+resides+in+CD34(-)+cells,+outweighing+the+contribution+of+CD34(+)+cells+and+significantly+increasing+the+erythroblast+yield+from+peripheral+blood+samples.">The majority of the in vitro erythroid expansion potential resides in CD34(-) cells, outweighing the contribution of CD34(+) cells and significantly increasing the erythroblast yield from peripheral blood samples.</a> Haematologica. 95, 1594-1598 (2010).</li></ol>

No hay conflictos de interés declarado.

Nos en la presente memoria se describe el uso del vector lentiviral STEMCCA para generar iPSCs humanos a partir de células mononucleares aisladas de unos pocos mililitros de sangre periférica recién recogida. El protocolo también se puede utilizar para reprogramar PBMCs congeladas (obtenidos directamente a partir de la capa leucocitaria), un detalle de importantes implicaciones prácticas cuando se utilizan células de donantes adquiridos desde una ubicación distante. Antes de la inducción de la reprogramación, P...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios (opcional) </td></tr><tr><td> BD Vacutainer CPT Celular Preparación del tubo con citrato de sodio </td><td> BD Biosciences </td><td> 362760 </td><td></td></tr><tr><td> QBSF-60 Stem medio celular </td><td> De calidad biológica </td><td> 160-204-101 </td><td></td></tr><tr><td> IMDM </td><td> Invitrogen </td><td> 12440 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM/F12 </td><td> Invitrogen </td><td> 11330 </td><td></td></tr><tr><td> FBS </td><td> Atlanta Biológicos </td><td> S10250 </td><td></td></tr><tr><td> Knockout Serum reemplazo </td><td> Invitrogen </td><td> 10828 </td><td></td></tr><tr><td> Primocin </td><td> Invivogen </td><td> ant-pm-2 </td><td></td></tr><tr><td> Pen / Strep </td><td> Invitrogen </td><td> 15140 </td><td></td></tr><tr><td> L-Glutamina </td><td> Invitrogen </td><td> 25030 </td><td></td></tr><tr><td> No esenciales Aminoácidos </td><td> Invitrogen </td><td> 11140 </td><td></td></tr><tr><td> β-mercaptoetanol </td><td> MP Biomedicals </td><td> 190242 </td><td></td></tr><tr><td> Ácido ascórbico </td><td> Sigma </td><td> A4544 </td><td></td></tr><tr><td> IGF-1 </td><td> R &amp; D Systems </td><td> 291-G1 </td><td></td></tr><tr><td> IL-3 </td><td> R &amp; D Systems </td><td> 203-IL </td><td></td></tr><tr><td> SCF </td><td> R &amp; D Systems </td><td> 255-SC </td><td></td></tr><tr><td> EPO </td><td> R &amp; D Systems </td><td> 286-EP </td><td></td></tr><tr><td> Dexametasona </td><td> Sigma </td><td> D4902 </td><td></td></tr><tr><td> Polybrene </td><td> Sigma </td><td> H-9268 </td><td></td></tr><tr><td> bFGF </td><td> R &amp; D Systems </td><td> 233-FB </td><td></td></tr><tr><td> Stemolecule Y27632 </td><td> Stemgent </td><td> 04-0012 </td><td></td></tr><tr><td> ES Cell Marker Kit de muestra </td><td> Millipore </td><td> SCR002 </td><td></td></tr></tbody></table>

generation of human induced pluripotent stem cells from peripheral blood using the stemcca lentiviral vector

A través de la expresión ectópica de cuatro factores de transcripción, Oct4, Klf4, Sox2 y cMyc, las células somáticas humanas se puede convertir en un estado pluripotente, generando así llamadas células madre pluripotentes inducidas (iPS) 1-4. Específicos del paciente iPSCs carecen de las preocupaciones éticas que rodean a las células madre embrionarias (CME) y pasaría por alto el rechazo inmunológico posible. Por lo tanto, iPSCs han atraído una considerable atención por los estudios de modelos de enfermedades, la detección de compuestos farmacológicos y terapias regenerativas 5. Hemos demostrado la generación de transgén libres de iPSCs humanos de pacientes con enfermedades pulmonares diferentes usando una sola extirpable policistrónico Stem lentiviral casete celular (STEMCCA) que codifica los factores de Yamanaka 6. Estas líneas IPSC se generaron a partir de fibroblastos de la piel, el tipo de célula más común utilizado para la reprogramación. Normalmente, la obtención de fibroblastos de piel requiere un punzón de biopsia seguida por la expansión de la células en la cultura de algunos pasajes. Es importante destacar que, un número de grupos han informado de la reprogramación de células humanas de sangre periférica en iPSCs 7-9. En un estudio, una versión inducible Tet del vector STEMCCA se empleó 9, que requiere las células de la sangre que se infectan simultáneamente con un lentivirus constitutivamente activa que codifica el transactivador inverso tetraciclina. En contraste con los fibroblastos, las células de sangre periférica pueden recogerse a través de procedimientos mínimamente invasivos, reduciendo considerablemente el malestar e incomodidad del paciente. Un protocolo sencillo y eficaz para la reprogramación de células de la sangre utilizando un vector constitutiva sujetos a impuestos especiales solo pueden acelerar la aplicación de la tecnología IPSC para hacerla accesible a una comunidad de investigación más amplia. Además, la reprogramación de células de sangre periférica permite la generación de iPSCs de individuos en los que las biopsias de piel debe ser evitado (es decir. Aberrante cicatrización) o debido a condiciones de enfermedad pre-existentes Preventing acceso a biopsias. Aquí se demuestra un protocolo para la generación de iPSCs humanos a partir de células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) utilizando una única floxed-extirpable vector lentiviral que expresa constitutivamente los 4 factores. PBMC recién arrancadas o descongelados se expanden durante 9 días descrita 10,11 en ácido ascórbico que contiene medio, SCF, IGF-1, IL-3 y EPO antes de ser transducidas con el lentivirus STEMCCA. Después las células se sembraron en MEFs y ESC-como colonias se puede visualizar dos semanas después de la infección. Finalmente, los clones seleccionados se expanden y se ensayaron para la expresión de los marcadores de pluripotencia SSEA-4, Tra-1-60 y Tra-1-81. Este protocolo es simple, robusto y muy consistente, proporcionando una metodología fiable para la generación de iPSCs humanos fácilmente accesible desde 4 ml de sangre.

Se demuestra un protocolo simple y eficaz para la generación de iPSCs humanos a partir de PBMCs utilizando un vector lentiviral único. Figura 1A muestra una representación esquemática del protocolo. La sangre se recogió en un tubo BD Vacutainer CPT Preparación célula con citrato de sodio, y después de la centrifugación, las células mononucleares se pueden recoger de la interfaz entre el gel de poliéster y el plasma (buffy coat) (Figura 1B). Las PBMC aisladas se expanden en cu...

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Generation of Human Induced Pluripotent Stem Cells from Peripheral Blood Using the STEMCCA Lentiviral Vector

Aquí se muestra un protocolo simple y eficaz para la generación de iPSCs humanos de 3-4 ml de sangre periférica utilizando un único vector lentiviral reprogramación. La reprogramación de células de la sangre fácilmente disponibles promete acelerar la utilización de la tecnología de IPSC para hacerla accesible a una comunidad de investigación más amplia.

Generación de las células madre pluripotentes inducidas a partir de sangre periférica mediante el STEMCCA vector lentiviral

Through the ectopic expression of four transcription factors, Oct4, Klf4, Sox2 and cMyc, human somatic cells can be converted to a pluripotent state, ...

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26.4K vistas.  Boston University School of Medicine. Aquí se muestra un protocolo simple y eficaz para la generación de iPSCs humanos de 3-4 ml de sangre periférica utilizando un único vector lentiviral reprogramación. La reprogramación de células de la sangre fácilmente disponibles promete acelerar la utilización de la tecnología de IPSC para hacerla accesible a una comunidad de investigación más amplia.