Estes estudos foram financiados em parte pelo NIH Prêmio UO1HL107443-01 a GJM e GM.

1. Isolamento e expansão de células mononucleares do sangue periférico (PBMC) DIA 0 <ol><li> Aspire 4 ml de sangue periférico num Vacutainer CPT BD Tubo Preparação celular com citrato de sódio. Inverter o tubo de 8 a 10 vezes e centrifugar a 1800 xg durante 30 min à temperatura ambiente. Idealmente, esta etapa deve ser feito dentro de 2 horas da coleta. </li><li> Recolher as células mononucleares (MCs), pipetando buffy coat (camada de células entre barreira de gel e de plasma) para um tubo de 15 ml estéril de centrífuga cónico. Levar o volume total a 10 ml com fosfato estéril-salino tamponado (PBS), invertido várias vezes e centrifugar a 300 xg durante 15 min. </li><li> Ressuspender as células em 10 ml de PBS estéril e efectuar a contagem de células. Transferir 1 a 2x10 6 células para um tubo estéril de 15 ml de centrífuga cónico e centrifugar a 300 xg durante 10 min. </li><li> Ressuspender as células em 2 ml de meio de expansão (EM) (QBSF-60 Medium Stem Cell contendo 50 ug / ml AscoÁcido rbic, 50 ng / ml de SCF, 10 ng / ml de IL-3, de 2 U / mL de EPO, 40 ng / ml de IGF-1, 1 uM de dexametasona e 100 ug / ml ou 1 primocin% Pen / Strep) e transferir para um poço de uma placa de 12 poços. Incubar as células em uma de 37 ° C, 5% CO 2 incubadora. </li><li> Centrifugar células restantes a 300 x g durante 10 min e liof ~ 2x10 6 células / frasco em FBS contendo DMSO a 10%. </li><li> Para iniciar o protocolo utilizando PBMCs congelados, descongelar uma ampola de células para 10 ml de meio QBSF e centrifugar a 300 xg durante 10 min. Ressuspender as células em 2 ml de EM e transferir para um poço de uma placa de 12 poços. Incubar as células em uma de 37 ° C, 5% CO 2 incubadora. </li></ol> Dia 3 eo dia 6 <ol start="17"><li> Transferir as células para um tubo estéril de 15 ml e lava-cónica do poço uma vez com 1 ml de QBSF-60 Medium Stem Cell para recolher as células aderentes. </li><li> Centrifugar as células a 300 xg durante 10 min. </li><li> Ressuspender as células em 2 ml de EM e transferir para um poço de um 12Bem-placa. Incubar as células em uma de 37 ° C, 5% CO 2 incubadora. </li></ol> 2. Transdução de PBMCs com STEMCCA Lentivirus DIA 9 <ol><li> Transferir as células para um tubo estéril de 15 ml e lava-cónica do poço uma vez com 1 ml de QBSF-60 Medium Stem Cell para recolher as células aderentes. </li><li> Centrifugar as células a 300 xg durante 10 min. </li><li> Ressuspender as células em 1 ml de EM fresco contendo 5 ug / ml de polibreno e lentivírus STEMCCA (MOI = 1 a 10) e transferência para uma cavidade de uma placa de 12 poços. (O protocolo descreve a produção de partículas de lentivirais podem ser encontradas em <a href="http://www.bumc.bu.edu/stemcells/protocols/" target="_blank">http://www.bumc.bu.edu/stemcells/protocols/</a> ) </li><li> Girar a placa a 2250 rpm a 25 ° C durante 90 min. </li><li> Depois de girar, adicionar um adicional de 1 ml EM frescos contendo 5 ug / ml de polibreno durante um total de 2 ml de meio e incubar a placa a 37 ° C,5% de CO 2 incubadora. </li></ol> DIA 10 <ol start="16"><li> Transferir as células para um tubo estéril de 15 ml e lava-cónica do poço uma vez com 1 ml de QBSF-60 Medium Stem Cell para recolher as células aderentes. </li><li> Centrifugar as células a 300 xg durante 10 min. </li><li> Ressuspender as células em 2 ml de EM e transferir para um poço de uma placa de 12 poços. Incubar as células em uma de 37 ° C, 5% CO 2 incubadora. </li></ol> 3. Plating células transduzidas para MEFs DIA 11 <ol><li> Revestir os poços de uma placa de 6 poços com 0,1% de gelatina e de fibroblastos de ratinho inactivado placa embrionárias (MEFs) a 2x10 5 células / poço em meio de MEF (IMDM contendo 10% de FBS, 1% de não-aminoácidos essenciais, 100 uM β- -mercaptoetanol, 2 mM de L-glutamina, 100 ug / ml ou 1 primocin% Pen / Strep). Prepare três poços por infecção. </li></ol> DIA 12 <ol start="2"><li> Transferir as células para um tubo estéril de 15 mL cónico<html> e lavar o bem uma vez com 1 ml de QBSF-60 Medium Stem Cell para recolher as células aderentes. </li><li> Ressuspender as células em 3 ml de MEF meio contendo 10 ng / ml de bFGF, e Ácido Ascórbico e factores de crescimento, nas mesmas concentrações utilizadas como meio de EM (50 Ácido Ascórbico ug / ml, 50 ng / ml de SCF, 10 ng / ml IL -3, 2 U / mL de EPO, 40 ng / ml de IGF-1, 1 uM de dexametasona). </li><li> Placa 1 ml de células por cavidade de uma placa de 6 poços contendo MEFs. Adicionar 1,5 ml de meio MEF com bFGF, ácido ascórbico, e factores de crescimento para um total de 2,5 ml de meio / poço. </li><li> Girar a placa a 500 rpm a 25 ° C durante 30 min. Incubar a placa num 37 ° C, 5% CO 2 incubadora. </li></ol> DIA 14 <ol start="6"><li> Células de alimentação a cada dois dias com 2,5 ml de meio de MEF contendo 10 ng / ml de bFGF e 50 Ácido Ascórbico ug / ml (sem factores de crescimento). Aspirar e descartar células flutuantes com cada refeição. </li><li> Adicionar MEFs adicional conforme necessário (normalmente uma vez por semana). </li></ol>p &quot;&gt; DIA ~ 20 <ol start="8"><li> Uma vez que as colónias aparecem pequenas, as células de alimentação diária com 2 ml de células estaminais embrionárias humanas (CTEh) meio (DMEM/F12 substituição Knockout contendo 20% de soro, 1% de não-aminoácidos essenciais, 100 uM β-mercaptoetanol, 2 mM de L-Glutamina , 100 ug / ml ou 1 primocin% Pen / Strep e 10 ng / ml de bFGF). </li></ol> 4. Picking e Expansão da iPSC Clones ~ DIA 30-40 <ol><li> Escolha cada colónia em poços individuais de uma placa de 12 poços pré-semeadas com MEFs inactivada contendo 1 ml / poço de meio hESC mais 10 uM de Stemolecule Y27632 (ROCK inibidor). </li><li> Alimentar as células depois diariamente com 1 ml de meio hESC apenas (sem inibidor ROCK). </li></ol> 5. Imunofluorescência para Marcadores pluripotência <ol><li> A coloração foi realizada utilizando o kit &quot;ES celular Kit Amostra Marker&quot; da Millipore e seguindo o protocolo do fabricante. </li></ol> 6. Excisão de IntegPopulares STEMCCA Vector <ol><li> Excisão de reprogramação cassete é conseguido utilizando uma Cre-IRES-Puro transfecção vetor expressando seguindo e seleção Puromicina breve como descrito 6. </li></ol>

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	<li>Lowry, W. E., Richter, L., Yachechko, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+from+dermal+fibroblasts.">Generation of human induced pluripotent stem cells from dermal fibroblasts.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 2883-2888 (2008).</li><li>Park, I. H., Zhao, R., West, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+of+human+somatic+cells+to+pluripotency+with+defined+factors.">Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with defined factors.</a> Nature. 451, 141-146 (2008).</li><li>Takahashi, K., Tanabe, K., Ohnuki, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors.">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131, 861-872 (2007).</li><li>Yu, J., Vodyanik, M. A., Smuga-Otto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cell+lines+derived+from+human+somatic+cells.">Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells.</a> Science. 318, 1917-1920 (2007).</li><li>Stadtfeld, M., Hochedlinger, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotency:+history,+mechanisms,+and+applications.">Induced pluripotency: history, mechanisms, and applications.</a> Genes Dev. 24, 2239-2263 (2010).</li><li>Somers, A., Jean, J. C., Sommer, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+transgene-free+lung+disease-specific+human+induced+pluripotent+stem+cells+using+a+single+excisable+lentiviral+stem+cell+cassette.">Generation of transgene-free lung disease-specific human induced pluripotent stem cells using a single excisable lentiviral stem cell cassette.</a> Stem Cells. 28, 1728-1740 (2010).</li><li>Loh, Y. H., Hartung, O., Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+of+T+cells+from+human+peripheral+blood.">Reprogramming of T cells from human peripheral blood.</a> Cell Stem Cell. 7, 15-19 (2010).</li><li>Seki, T., Yuasa, S., Oda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+induced+pluripotent+stem+cells+from+human+terminally+differentiated+circulating+T+cells.">Generation of induced pluripotent stem cells from human terminally differentiated circulating T cells.</a> Cell Stem Cell. 7, 11-14 (2010).</li><li>Staerk, J., Dawlaty, M. M., Gao, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+of+human+peripheral+blood+cells+to+induced+pluripotent+stem+cells.">Reprogramming of human peripheral blood cells to induced pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 7, 20-24 (2010).</li><li>Chou, B. K., Mali, P., Huang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+human+iPS+cell+derivation+by+a+non-integrating+plasmid+from+blood+cells+with+unique+epigenetic+and+gene+expression+signatures.">Efficient human iPS cell derivation by a non-integrating plasmid from blood cells with unique epigenetic and gene expression signatures.</a> Cell Res. 21, 518-529 (2011).</li><li>vanden Akker, E., Satchwell, T. J., Pellegrin, S., Daniels, G., Toye, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+majority+of+the+in+vitro+erythroid+expansion+potential+resides+in+CD34(-)+cells,+outweighing+the+contribution+of+CD34(+)+cells+and+significantly+increasing+the+erythroblast+yield+from+peripheral+blood+samples.">The majority of the in vitro erythroid expansion potential resides in CD34(-) cells, outweighing the contribution of CD34(+) cells and significantly increasing the erythroblast yield from peripheral blood samples.</a> Haematologica. 95, 1594-1598 (2010).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Descrevemos aqui a utilização do vector lentiviral STEMCCA para gerar iPSCs humanos a partir de células mononucleares isoladas de alguns mililitros de solução recentemente colhido sangue periférico. O protocolo pode também ser usado para reprogramar PBMCs congelados (obtido directamente a partir de buffy coat), um detalhe de implicações práticas quando se utilizam células de dador adquiridas a partir de um local distante. Antes da indução de reprogramação, PBMCs isoladas deve ser submetida a um passo de e...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários (opcional) </td></tr><tr><td> BD Vacutainer CPT Tubo preparação celular com citrato de sódio </td><td> BD Biosciences </td><td> 362760 </td><td></td></tr><tr><td> QBSF-60 Médio Stem Cell </td><td> Qualidade Biológica </td><td> 160-204-101 </td><td></td></tr><tr><td> IMDM </td><td> Invitrogen </td><td> 12440 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM/F12 </td><td> Invitrogen </td><td> 11330 </td><td></td></tr><tr><td> FBS </td><td> Atlanta Biologicals </td><td> S10250 </td><td></td></tr><tr><td> Substituição Knockout Serum </td><td> Invitrogen </td><td> 10828 </td><td></td></tr><tr><td> Primocin </td><td> Invivogen </td><td> ant-pm-2 </td><td></td></tr><tr><td> Pen / Strep </td><td> Invitrogen </td><td> 15140 </td><td></td></tr><tr><td> L-Glutamina </td><td> Invitrogen </td><td> 25030 </td><td></td></tr><tr><td> Não-essenciais Aminoácidos </td><td> Invitrogen </td><td> 11140 </td><td></td></tr><tr><td> β-mercaptoetanol </td><td> Biomedicals MP </td><td> 190242 </td><td></td></tr><tr><td> Ácido ascórbico </td><td> Sigma </td><td> A4544 </td><td></td></tr><tr><td> IGF-1 </td><td> R &amp; D Systems </td><td> 291-G1 </td><td></td></tr><tr><td> IL-3 </td><td> R &amp; D Systems </td><td> 203-IL </td><td></td></tr><tr><td> SCF </td><td> R &amp; D Systems </td><td> 255-SC </td><td></td></tr><tr><td> EPO </td><td> R &amp; D Systems </td><td> 286-PE </td><td></td></tr><tr><td> Dexametasona </td><td> Sigma </td><td> D4902 </td><td></td></tr><tr><td> Polybrene </td><td> Sigma </td><td> H-9268 </td><td></td></tr><tr><td> bFGF </td><td> R &amp; D Systems </td><td> 233-FB </td><td></td></tr><tr><td> Stemolecule Y27632 </td><td> Stemgent </td><td> 04-0012 </td><td></td></tr><tr><td> ES celular Kit Amostra Marcador </td><td> Millipore </td><td> SCR002 </td><td></td></tr></tbody></table>

generation of human induced pluripotent stem cells from peripheral blood using the stemcca lentiviral vector

Através da expressão ectópica de quatro factores de transcrição, Oct4, Klf4, Sox2 e cMyc, as células somáticas humanas pode ser convertido para um estado pluripotente, gerando assim chamadas células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) 1-4. Específicas do paciente iPSCs faltam as preocupações éticas que envolvem as células-tronco embrionárias (CTEs) e seria ignorar rejeição imunológica possível. Assim, iPSCs têm atraído considerável atenção para estudos de doenças de modelagem, a triagem de compostos farmacológicos e terapias regenerativas 5. Nós mostramos a geração de transgene livres iPSCs humanos a partir de pacientes com doenças pulmonares diferentes, utilizando um único coletável policistrónica lentiviral Cassete Stem Cell (STEMCCA) codificando os factores Yamanaka 6. Estas linhas iPSC foram gerados a partir de fibroblastos da pele, o tipo celular mais comum utilizado para a reprogramação. Normalmente, a obtenção de fibroblastos requer uma biópsia por punção da pele seguido de expansão das célulass na cultura de algumas passagens. É importante notar que um certo número de grupos têm relatado a reprogramação de células humanas de sangue periférico em iPSCs 7-9. Num estudo, uma versão induzível Tet do vector STEMCCA foi empregue 9, o que exigia que as células do sangue a ser simultaneamente infectadas com um lentivírus constitutivamente activo que codifica a tetraciclina reversa transactivador. Em contraste com os fibroblastos, células do sangue periférico podem ser recolhidas através de procedimentos minimamente invasivos, reduzindo o desconforto e sofrimento do paciente. Um protocolo simples e eficaz para a reprogramação de células de sangue utilizando um único vetor constitutivo coletável pode acelerar a aplicação da tecnologia iPSC tornando-o acessível a uma comunidade mais ampla de pesquisa. Além disso, a reprogramação de células de sangue periférico permite a geração de iPSCs de indivíduos em que as biópsias da pele devem ser evitados (ie. Aberrante cicatriz) ou devido a condições de doença pré-existente prevenng acesso a punch. Aqui demonstramos um protocolo para a geração de iPSCs humanos a partir de células mononucleares de sangue periférico (PBMC), utilizando um vector floxed-coletável único lentiviral que expressam constitutivamente as quatro factores. PBMCs recolhidos de fresco ou descongelado são expandidos durante 9 dias, tal como descrito em 10,11 de ácido ascórbico, meio contendo SCF, IGF-1, IL-3 e EPO antes de serem transduzidas com o lentivirus STEMCCA. As células são então plaqueadas em MEFs e ESC-como colónias podem ser visualizadas de duas semanas após a infecção. Finalmente, os clones seleccionados são expandidos e testados quanto a expressão dos marcadores de pluripotência SSEA-4, Tra-1-60 e Tra-1-81. Este protocolo é simples, robusto e altamente consistente, fornecendo uma metodologia fiável para a geração de iPSCs humanos prontamente acessível a partir de 4 ml de sangue.

Nós demonstramos um protocolo simples e eficaz para a geração de iPSCs humanos a partir de PBMCs, utilizando um vector lentiviral única. Figura 1A mostra uma representação esquemática do protocolo. O sangue é recolhido para um tubo CPT Vacutainer BD Preparação celular com citrato de sódio, e após a centrifugação, as células mononucleares pode ser recolhida a partir da interface entre o gel de poliéster e o plasma (buffy coat) (Figura 1B). As PBMCs isoladas são então ex...

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Generation of Human Induced Pluripotent Stem Cells from Peripheral Blood Using the STEMCCA Lentiviral Vector

Aqui, mostramos um protocolo simples e eficaz para a geração de iPSCs humanos a partir de 3-4 ml de sangue periférico utilizando um vector lentiviral única reprogramação. Reprogramação de células do sangue prontamente disponíveis promete acelerar a utilização da tecnologia iPSC tornando-o acessível a uma comunidade mais ampla de pesquisa.

Geração de Células-tronco pluripotentes induzidas a partir de sangue periférico usando o STEMCCA Lentivirus Vector

Through the ectopic expression of four transcription factors, Oct4, Klf4, Sox2 and cMyc, human somatic cells can be converted to a pluripotent state, ...

generation-human-induced-pluripotent-stem-cells-from-peripheral-blood

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Biology

26.4K visualizações.  Boston University School of Medicine. Aqui, mostramos um protocolo simples e eficaz para a geração de iPSCs humanos a partir de 3-4 ml de sangue periférico utilizando um vector lentiviral única reprogramação. Reprogramação de células do sangue prontamente disponíveis promete acelerar a utilização da tecnologia iPSC tornando-o acessível a uma comunidade mais ampla de pesquisa.