Nuestro protocolo de citometría de flujo multiparamétrica permite una detección rápida y mejorada de la senescencia inducida por la terapia en las células tumorales, que es una condición de estudio en curso en la biología y la terapia del cáncer. Nuestro ensayo de senescencia por citometría de flujo es más rápido que los ensayos basados en microscopía existentes. Utilizamos dos marcadores, en lugar de solo uno, para identificar las células senescentes, mejorando la fiabilidad del ensayo.
Las células pueden ser co-teñidas con anticuerpos fluorescentes para detectar objetivos adicionales de interés. La clasificación por citometría de flujo se puede utilizar para enriquecer poblaciones de células senescentes para el análisis posterior. El ensayo puede detectar células senescentes en líneas celulares de cáncer cultivadas o en muestras tumorales completas después de una disociación suave.
Antes de intentar esta técnica, es importante estar familiarizado con los procedimientos operativos generales del citómetro de flujo que se utiliza. Consulte el texto para conocer las especificaciones recomendadas del citómetro de flujo. Un día antes de la inducción de la senescencia por medicamentos, recolectar el cultivo de línea celular de cáncer con 0,25% de tripsina EDTA.
Coloque las células a 37 grados centígrados durante cinco minutos para activar la tripsina y desprenda la monocapa celular. Cuando la monocapa se haya desprendido visiblemente, neutralice la tripsina añadiendo un volumen igual de medio de cultivo completo. Transfiera la suspensión celular a un tubo cónico estéril.
Cuente las células utilizando el método estándar del hemocitómetro y registre las células por mililitro. Celdas en placa de una vez de 10 a tercio a 10 veces 10 a tercera celda por centímetro cuadrado en una placa de cultivo de plástico estándar de seis pocillos. Incubar la placa durante la noche a 37 grados centígrados con 5% de dióxido de carbono y humedad.
Al día siguiente, trate las células con el agente inductor de senescencia de interés, como el etopósido. Luego incubar durante cuatro días para permitir el inicio de la senescencia. Examine las células diariamente bajo un microscopio óptico para detectar los cambios morfológicos esperados.
Después del inicio de la senescencia, cosechar las células mediante la adición de tripsina EDTA durante cinco minutos a 37 grados centígrados. Cuando las células se disocian en suspensión, neutralizar la tripsina con un volumen igual de medio completo. Transfiera cada pocillo de suspensión celular a un tubo de microcentrífuga de 1,7 mililitros.
Contar las células de nuevo y alícuota un número igual de células por muestra en un nuevo conjunto de tubos. Centrifugar los tubos durante cinco minutos a 1.000 g a cuatro grados centígrados y retirar el sobrenadante. Primero, ajustar el pH lisosomal de las muestras de células cultivadas agregando una solución de una bafilomicina A micromolar en DMEM al pellet celular a una concentración de una vez 10 a la sexta células por mililitro, y pipeta para mezclar.
Incubar durante 30 minutos a 37 grados centígrados en un rotador a una velocidad lenta. Luego, para teñir la beta-galactosidasa asociada a la senescencia, agregue una solución madre de DDAOG a 10 microgramos por mililitro a las muestras sin lavar. Colocar sobre un rotador durante 60 minutos protegido de la luz directa.
Como antes, centrifugar los tubos, quitar el sobrenadante y lavar el pellet con un mililitro de BSA al 0,5% helado en PBS. Luego agregue 300 microlitros de solución diluida Calcein Violet 450 AM a los gránulos de células lavadas. Incubar durante 15 minutos sobre hielo en la oscuridad.
Transfiera las muestras celulares a tubos compatibles con instrumentos de citometría de flujo. En el software de adquisición de datos, abra un histograma de canal violeta y un diagrama de puntos de canal rojo lejano frente a canal verde. Inicie la adquisición de datos del citómetro a una velocidad de admisión baja y coloque las muestras de control positivo teñidas con DDAOG en el puerto de admisión.
Comience a adquirir datos de muestra. Ajuste los voltajes del canal de tal manera que más del 90% de los eventos estén contenidos dentro de cada gráfico. Cuando todos los ajustes sean óptimos, registre 10.000 eventos por muestra.
Coloque las muestras de control solo para vehículos teñidas con DDAOG en el puerto de admisión. Inicie la adquisición de datos y registre 10.000 eventos por muestra. Busque un aumento en la señal de autofluorescencia, o FA, y DDAO-galactósido versus control positivo.
Guarde los datos de muestra en formato de archivo fcs y exporte los archivos a una computadora de estación de trabajo equipada con software de análisis de citometría de flujo. Utilizando el software de análisis de datos de citometría cargue los archivos de datos fcs para todas las muestras adquiridas. Primero, para bloquear celdas viables, haga doble clic en los datos de muestra para que el control solo del vehículo abra su ventana de datos.
Visualice los datos como un histograma de canal violeta. Las células viables teñidas, teñidas por CV 450, se basan en su fluorescencia más brillante que las células muertas. Dibuje una puerta con la herramienta Histograma de puerta única para incluir sólo celdas viables.
Asigne a la puerta el nombre Viable. A continuación, arrastre la puerta viable a las otras muestras de celda desde la ventana de diseño de muestra para aplicar la puerta de forma uniforme. Abra la ventana Diseño.
En la ventana Diseño, visualice todas las muestras como histogramas de canal violeta. Verifique que la activación celular viable sea apropiada en todas las muestras. Si no es así, ajuste según sea necesario.
A continuación, para bloquear las celdas senescentes, haga doble clic en los datos de celdas viables cerradas para que el control solo del vehículo abra su ventana de datos. A continuación, visualice los datos como un diagrama de puntos para el canal rojo lejano frente al canal verde. Dibuje una puerta con la herramienta Rectangle Gating para incluir menos del 5% de celdas DDAO-positivas y AF-positivas del cuadrante superior derecho.
Nombra la puerta como Senescente. A continuación, arrastre la puerta Senescente al subconjunto viable de todas las muestras desde la ventana Diseño de muestra para aplicar la puerta de forma uniforme. En la ventana Diseño, arrastre y suelte todos los subconjuntos viables dependientes de celdas.
Visualice todas las muestras viables como diagramas de puntos de canal rojo lejano versus verde, y observe los resultados. Asegúrese de que la puerta senescente sea visible en todas las parcelas y que la puerta para los controles solo del vehículo exhiba menos del 5% de celdas senescentes. El análisis ya está completo.
Los datos ahora se pueden exportar como se desee en formato gráfico y de tabla. En comparación con las células no tratadas, las células de melanoma senescente B16-F10 inducidas por etopósido exhibieron una morfología agrandada y tinción azul debido a la escisión de X-gal por beta-galactosidasa asociada a senescencia elevada. La tinción de células tratadas con etopósido con C12FDG fluorescente o DDAOG demostró patrones de tinción y variaciones de intensidad comparables a X-gal.
Sin embargo, se demostró que la autofluorescencia celular que se superpone con la emisión verde de C12FDG se acumula en las células senescentes no teñidas. En contraste, la autofluorescencia fue típicamente insignificante en el rango de emisión de color rojo lejano de DDAOG. Aquí se muestra la configuración de adquisición de datos del citómetro de flujo para diagramas de dispersión, microesferas de calibración fluorescente arco iris comerciales de cinco picos y datos de fluorescencia de un solo canal de células teñidas.
Los datos del ensayo de senescencia del citómetro de flujo DDAOG para células de melanoma B16-F10 mostraron que la senescencia inducida por terapia, o TIS, inducida por etopósido ocurrió en el 35% de las células viables, y el agente senolítico ABT-263 casi eliminó las células TIS. En las células de cáncer de pulmón A549, el TIS inducido por bleomicina en el 66% de las células viables y ABT-263 redujo el porcentaje a 15. ABT-263 solo no fue tóxico para las células proliferantes no tratadas.
En un ensayo de co-tinción de anticuerpos, un histograma de datos del canal PE mostró que el 42% de las células tratadas con etopósidos fueron positivas para el marcador de senescencia DPPP4-positivo. Además, la visualización con diagramas de puntos bidimensionales indicó que el 44% de las células tratadas con etopósido fueron doblemente positivas para DDAOG y DPP4 frente al 4% de las células solo de vehículos. A continuación se evaluó la fijación de las células teñidas con DDAOG.
En comparación con las muestras de control no fijadas, las muestras fijas mostraron un fondo ligeramente mayor en las células no tratadas con un mayor porcentaje de células que se calificaron como senescentes en las células tratadas con BLM. Este efecto también se observó en muestras fijas almacenadas durante la noche y durante una semana a cuatro grados centígrados. Se muestra la clasificación por citometría de flujo y la validación de poblaciones de células senescentes enriquecidas por morfología y marcadores de proliferación.
Las células senescentes ordenadas mostraron una morfología agrandada, como se esperaba, visualizada mediante la tinción de actina con faloidina fluorescente. También se observó una reducción en la señal para el marcador de proliferación Ki67 mediante tinción inmunofluorescente. Finalmente, se evaluó la cuantificación de la senescencia en tumores tratados con fármacos quimioterapéuticos.
La tinción X-gal en los tejidos fue relativamente débil, pero la tinción azul fue evidente en los tumores tratados con doxorrubicina, o doxorrubicina liposomal pegilada, particularmente en tumores que también obtuvieron resultados positivos para senescencia mediante el ensayo de flujo DDAO-galactósido. Como era de esperar, los tumores de solución salina solo exhibieron una senescencia insignificante. Aquí, como con cualquier ensayo de celda viva, los pasos del protocolo deben realizarse de manera eficiente, pero suave.
Se deben evitar los procedimientos de tinción prolongados o las incubaciones más allá de los tiempos mencionados. Si las células senescentes se clasifican citométricamente por flujo, pueden volver a colocarse en cultivo para inmunoensayos, o lisarse, y procesarse para análisis ómicos, incluida la transcriptómica o la proteómica. Esta técnica ha permitido a nuestro laboratorio y a otros identificar nuevas características de las células tumorales senescentes, incluida la cuantificación del daño del ADN, la expresión de proteínas y los cambios en el metabolismo.
