Este protocolo nos permite examinar el ciclo celular a nivel de célula única utilizando el citómetro de masas, y esto permite realizar varias investigaciones y estudios clínicos novedosos. La principal ventaja de esta técnica es su simplicidad. IdU se agrega directamente a las células y no hay necesidad de tratamiento adicional o anticuerpos.
Hemos utilizado esta técnica para investigar el estado del ciclo celular en pacientes con leucemia mieloide aguda dentro de los compartimentos de células madre y progenitoras. Y esto demostró que las propiedades del ciclo celular de estos tipos específicos de células pueden correlacionarse con el resultado clínico de los pacientes con estas enfermedades. Esta técnica puede ser útil para comprender las propiedades de crecimiento de las células cancerosas raras y comprender la proliferación de subconjuntos de células inmunes.
Antes y después de agregar IdU a las muestras celulares, mantenga las células en las condiciones de crecimiento de interés. En este caso, una incubadora humidificada de 37 grados centígrados al 5% de CO2 para etiquetar las células con IdU, diluye la solución madre concentrada de IdU de uno a 50 en los medios de crecimiento de las células. Luego transfiera las muestras a una campana de bioseguridad y agregue 10 microlitros de un IdU milimolar a cada mililitro de células.
Devuelva las células a la incubadora durante 10 a 15 minutos antes de transferir las muestras a tubos cónicos individuales. Recoger las células por centrifugación en tubos cónicos de 15 mililitros y resuspender los pellets en 200 microlitros de PBS por tubo. Si es necesario, etiquete las células con una tinción viva / muerta apropiada para marcar las células muertas.
Después de la tinción viva / muerta, apagar las células con medios lavados con CSM antes de fijar las células con 25 microlitros de paraformaldehído al 16%. Después de una incubación de 10 minutos a temperatura ambiente, recoger las células por centrifugación. Agregue de cinco a 15 mililitros de CSM y centrifugar nuevamente.
Resuspender los pellets en 500 microlitros de medio de tinción celular suplementado con 10% de sulfóxido de dimetilo. Luego transfiera las células a tubos más pequeños para almacenarlas en 80 grados centígrados negativos. Para normalizar el análisis del ciclo celular, importe los archivos en un programa de software de análisis de citometría de flujo apropiado y cree una gráfica biaxial de la duración del evento frente al iridio 191.
Las células formarán una población distinta de iridio brillante alto. Cambie la escala de longitud de eventos para que las celdas aparezcan más prominentes. Luego cree una puerta singlete para excluir del 50 al 60% de los dobletes y escombros y establezca los parámetros gaussianos residuales y compensados para eliminar cualquier doblete y escombro restante.
Para establecer la puerta de fase S, cree una gráfica biaxial de IdU frente a un marcador de proliferación. Las células positivas para IdU en fase S formarán una población distinta. Para G0/G1 y G2/M, establezca las puertas en una gráfica IdU versus ciclina B1.
La fase G0/G1 será ciclina B1 baja, IdU negativa, y la fase G2/M será ciclina B1 alta, IdU negativa. Para establecer la puerta de entrada para tipos de células específicos, trace solo las celdas de fase S en el gráfico de ciclina B1 versus IdU para ayudar a establecer la separación entre las células de fase G0 / G1 y las células de fase G2 / M. Dibuje una puerta alrededor de la alta población de ciclina B1.
En algunos casos, esto puede ser difícil de discernir, pero el nivel de ciclina B1 de aproximadamente el 5% superior de la población de la fase S es típicamente el punto de ruptura entre las puertas de fase G0 / G1 y G2 / M. Las celdas que residen dentro de la puerta anterior serán la población de la fase G2/M, mientras que el resto será la población de la fase G0/G1. Para establecer la población de fase G0, cree una gráfica de proteína de retinoblastoma fosforilada versus IdU.
La fase G0 estará representada por una proteína de retinoblastoma fosforilada baja en población IdU negativa. Como la población ciclista activa demostrará una proteína de retinoblastoma fosforilada alta y la incorporación de IdU, la puerta de fase G0 se puede dibujar en este límite, ya que normalmente se expresa en dos poblaciones distintas. Si la puerta G0 es difícil de definir, convierta la población de fase S en la población activa y dibuje una puerta que incorpore el 90 a 100% superior de la proteína de retinoblastoma fosforilada de alta población.
La proteína de retinoblastoma fosforilada de baja población fuera de la puerta es típicamente la población G0, mientras que las células G0/G1 con niveles de pRb que caen en esta puerta son células G1. Para la activación en fase M, cree una IdU versus histona fosforilada H3 por gráfica axial. La fase M se observará como la fracción muy pequeña de células dentro de la población fosforilada de histonas H3.
Las células en la población G2/M con niveles más bajos de pHH3 son las células G2. Si la incorporación de IdU falló o no fue posible, defina las fracciones celulares cíclicas y no cíclicas utilizando Ki67 y la proteína retinoblastoma fosforilada. La población doble positiva representará la población ciclista activa correlacionada con las fases G1, S, G2 y M.
La población doble baja representará la población no ciclista correlativa a la fase G0. Una vez que se hayan establecido todas las puertas, exporte los valores numéricos de las puertas. Los porcentajes en cada ciclo se pueden lograr restando las poblaciones individuales de las poblaciones combinadas para generar valores numéricos para cada fase individual del ciclo celular para su posterior graficación y análisis estadístico.
El establecimiento de la puerta singlete es importante para separar los desechos celulares y dobletes para permitir el aislamiento de la población unicelular. A continuación, se puede realizar el análisis del ciclo celular de las células individuales. El etiquetado de IdU y, por lo tanto, el análisis del ciclo celular posterior pueden verse afectados significativamente por el tiempo y la temperatura.
Por ejemplo, las células que permanecen demasiado tiempo en recipientes cerrados o en transporte entre ubicaciones tendrán fracciones reducidas de fase S y eso no será preciso para el análisis del ciclo celular. Las muestras de células mantenidas durante períodos cortos de una hora o menos todavía demuestran una distribución normal del ciclo celular, lo que indica que un transporte rápido puede no afectar negativamente el análisis. Las células criopreservadas pueden requerir un largo período de equilibrio antes de que las células vuelvan al ciclo celular activo, lo que aún puede no reflejar el estado del ciclo celular previo a la criopreservación.
Los diferentes tipos de células también pueden verse afectados diferencialmente por las condiciones de mantenimiento. Por ejemplo, en esta muestra de médula ósea humana, las células T demostraron una reducción en el número de células en comparación con los monoblastos de la misma muestra. Otro beneficio de la citometría de masas es la capacidad de discriminar células en la detención del ciclo celular o que tienen una distribución anormal del ciclo celular.
Una ventaja importante de esta técnica es que es fácilmente compatible con otras mediciones de citometría de masas, como el fenotipado de superficie, la estructura de la cromatina, el estímulo de citoquinas intracelulares, que se puede correlacionar con el estado del ciclo celular. Hemos utilizado esta técnica para estudiar el agotamiento de las células inmunes, la senescencia y para demostrar que la respuesta a la quimioterapia en pacientes con leucemia aguda puede correlacionarse con las propiedades del ciclo celular de las células leucémicas.
