Damos las gracias a Fiona Foley para el apoyo y la atención excelente laboratorio de pez cebra. Este trabajo recibió el apoyo de una beca predoctoral para AHA GW (11PRE5730027) y las subvenciones a HJY NHLBI (R01HL66292) y JDA (R01HL095690).

Visión general de la etapa específica de embriones de pez cebra inyecciones Oligonucleótidos antisentido de morfolino (MO), que se unen a un ARNm objetivo e interrumpir la expresión de proteínas de transcripción que, son ampliamente utilizados en gen desmontables (pérdida de función) en el pez cebra estudios 13,14. Gene Herramientas, LLC ofrece OMs que están etiquetados con cualquiera de carboxifluoresceína (emite fluorescencia verde) o lisamina (emite fluorescencia roja) para detectar MO en embriones inyectados usando microscopía fluorescente. Mediante la inyección de MO en la célula de yema en diferentes etapas de desarrollo del pez cebra, es posible entregar el MO a compartimientos específicos del embrión (Figuras 1A-F). MO inyectado en la yema entre las etapas 1-4 de células (0-1 hpf) entra en todas las células embrionarias (Figuras 1A, D, D &#39;) a través de conexiones con la yema de que persisten hasta la etapa de 32 células 15 para facilitar la caída global. MO inyectado en la yema durante midblastetapas ULA (2,5-3 hpf) puede entrar en los progenitores de los CFD (Figuras 1B, E, E &#39;) probablemente a través de puentes citoplásmicos 8 y función de los genes desmontables específicamente en el linaje de células DFC / KV 12, sin entrar en linajes embrionarios mayoría de las otras células . Como un importante control para comprobar si la función del gen se requiere en DFC / KV o también en la yema de 12,16, también es posible restringir MO a la célula mediante la inyección de yema entre las etapas epibolia cúpula-30% (~ 4,5 hpf) tras todos los puentes citoplasmáticos han cerrado (Figuras 1C, F, F &#39;). Estas inyecciones se han utilizado en combinación para analizar la función de genes en DFC / KV células 17-24. Para evaluar el flujo de fluido en KV, microperlas fluorescentes se inyecta en el lumen KV entre las etapas 6-10 somite (12-14 HPF) y luego inmediatamente imágenes utilizando videomicroscopía (Figuras 1G-J). Microperlas están disponibles que emiten fluorescencia roja o verde (o ambos), por lo que es posible utilizar diferentescanales a imagen fluorescente microperlas y MO. 1. Fase específica de Inyección de Morpholinos (MO) La inyección de MO en embriones de pez cebra se ha demostrado previamente 25,26. A continuación, describimos brevemente etapa específica de inyecciones MO. Después de todas las inyecciones, los embriones se transfieren a una placa de Petri y se incubaron a 28,5 ° C. <ol><li> Global inyección MO: Recoger embriones inmediatamente después de la fertilización y cargarlos en una placa de inyección. Carga fluorescente MO en una aguja capilar y montar la aguja en un microinyector (por ejemplo, Harvard Apparatus PLI-90 Pico-inyector). Romper la punta de la aguja y ajustar los parámetros de inyección (presión y / o el tiempo) para crear una caída de inyección que tiene un volumen de 1 nl como se describe 25,26. Usando un estereomicroscopio de disección, inyectar 1 nl de MO en la yema (Figura 1A) de ≥ 50 embriones por experimentar. Trabaje con rapidez para completar las inyecciones por el ciervo de 4 celdase. </li><li> DFC-dirigido inyección MO: Recoger embriones inmediatamente después de la fecundación y se incuba a 28,5 ° C. Cuando los embriones se han llegado a la etapa 256-celular (~ 2,5 hpf), rápidamente a cargar en una placa de inyección y luego inyectar 1 nl de MO fluorescente en la yema de ≥ 100 embriones entre las etapas 256-celulares y 1.000 células-(figura 1B). </li><li> Yema orientados MO inyección: Recoger inmediatamente después de la fecundación de embriones e incubar a 28,5 º C. En la etapa de cúpula (~ 4 hpf), cargar los embriones en una placa de inyección y luego inyectar 1 nl de MO fluorescente en la yema de ≥ 100 embriones entre la cúpula y el 30% epibolia etapas (Figura 1C). </li></ol> 2. Selección de embriones inyectados para el Análisis de <ol><li> Cuando MO inyectado embriones llegar a la fase 75%-epibolia (8 hpf), retirar los embriones fertilizados y embriones muertos y luego de pantalla que viven bajo un microscopio de disección fluorescente para la distribución de la MO fluorescente. Entonces allow seleccionado para desarrollar embriones a 28,5 ° C. <ol><li> Para mundial inyecciones MO, seleccionar embriones que han fluorescencia uniformemente distribuidos a lo largo de todas las células en embriones (Figura 1D; Figura 2A). </li><li> Para DFC-dirigida inyecciones MO, seleccionar embriones en los que fluorescente MO ha difundido a través de la yema y parece concentrarse en el margen blastodermo dorsal (CFD) (Figura 1E; Figura 2B). En esta etapa, puede ser difícil de visualizar las CFD fluorescentes debido a la fluorescencia brillante en la yema subyacente. Tenga cuidado de excluir embriones en los que el fluorescente MO ha incorporado en las células embrionarias que no sean las CFD o permanece agregados en el sitio de inyección (Figura 2D). </li><li> Para yema dirigida inyecciones MO, seleccionar embriones en los que MO fluorescencia se distribuye uniformemente a lo largo de la yema y no se observó en las células embrionarias (Figura 1F; Figura 2C). Una vez más, eliminar embriones en los que la fluorescencia se mantiene MOagregados en el sitio de inyección. </li></ol></li><li> Entre las etapas 2-4-somite (~ 11 hpf), embriones pantalla una segunda vez bajo un microscopio de fluorescencia utilizando un mayor aumento. Luego permita embriones seleccionados para desarrollar a 28,5 ° C. <ol><li> Para globales inyecciones MO, asegurar embriones seleccionados tienen MO fluorescencia distribuida uniformemente en KV y todas las células embrionarias (Figura 1D &#39;; Figura 2E). </li><li> Por DFC-dirigido inyecciones MO, seleccione cuidadosamente los embriones que tienen fluorescencia MO sólo en las células KV y la yema (Figura 1E &#39;). Embriones transgénicos que expresan GFP en células KV, tales como Tg (Dusp6: d2EGFP) 27, puede ayudar en la identificación de los embriones en el que MO ha sido entregado correctamente a las células kV (Figura 2F). Deseche los embriones con MO fluorescencia en las células embrionarias otras que las células KV. </li><li> Para yema dirigida inyecciones MO, seleccionar los embriones que tienen fluorescencia MO exclusivamente en la yema (&#39;Figura 1F: Figura2G). </li></ol></li></ol> 3. Los embriones de montaje para analizar el flujo de líquido en KV <ol><li> Para el análisis de flujo de fluidos asimétrica en KV mundial de MO, MO DFC-dirigido o yema orientada embriones inyectados MO, cuidadosamente dechorionate ~ 20 embriones de 4-6 somite etapas (~ 11-12 HPF) con pinzas cortantes. </li><li> Preparar 50 ml de 1% de bajo punto de fusión de agarosa y alícuota en tubos de 5 ml a ser mantenidos como un líquido en un baño seco a 42 ° C. </li><li> Transferir un embrión a una diapositiva de la depresión de vidrio (Reino Suministros Científicos, Inc.) y retirar la mayor cantidad de agua posible. Inmovilizar el embrión mediante la adición de suficiente caliente 1% de bajo punto de fusión de agarosa para cubrir sólo el embrión (demasiado agarosa puede interferir con la formación de imágenes posterior). A medida que la agarosa se ​​solidifica, utilice unas pinzas para colocar el embrión de tal manera que se KV hacia arriba (vista dorsal) (Figura 1H). Montar 10 embriones con un embrión por diapositiva. Trabaje con rapidez para asegurar que todas las inyecciones en el siguiente paso es complpuestó por el somite etapa 10 (14 HPF). </li></ol> 4. La inyección de microperlas fluorescentes en KV <ol><li> Diluir Fluoresbrite Multifuorescent 0,5 micras de diámetro microesferas (Polysciences, Inc.) a 1:50 en agua estéril en un tubo Eppendorf de 1,5 ml. </li><li> Mezcle la dilución 1:50 de microesferas a fondo tocando el tubo de carga y 3 l en una aguja capilar. Utilizando el mismo microinyector utilizado para MO inyecciones (por ejemplo Harvard Apparatus PLI-90 Pico-inyector), romper la punta de la aguja con un fórceps y ajustar la configuración de inyección para generar el menor posible (&lt;0,5 nl) gota inyección. </li><li> Bajo un microscopio de disección, alinear la aguja con la luz KV del primer embrión montado. Insertar la aguja en el lumen y se inyecta un volumen pequeño (&lt;0,5 nl) de las perlas (Figura 1G). Una punta de la aguja pequeña y pequeño volumen de inyección son críticos para evitar KV perjudicial. </li><li> Inyectar todos los embriones montados. Una vez que un embrión ha sido injected, una gota de agua estéril se puede añadir en la parte superior de la agarosa para evitar que se seque. Durante el curso de las inyecciones, las perlas a menudo obstruya la abertura de la aguja. Esto requiere volver a romper la punta de la aguja y ajustando el volumen de inyección por la modulación de la presión o de ajuste de tiempo del aparato de microinyección. Vuelva a colocar la aguja si pierde filo suficiente para causar un daño significativo durante la inyección. </li><li> Pantalla de los embriones inyectados para la entrega exitosa de perlas con un microscopio compuesto fluorescente vertical (por ejemplo, Zeiss AxioImager M1) usando un objetivo 20X. En primer lugar, determinar si la estructura está intacta KV usando iluminación de campo claro (Figura 1J), y luego usar de fluorescencia para observar las perlas. Seleccionar embriones en los que las cuentas están presentes y se mueve dentro del lumen KV. Deseche los embriones con daño KV o no cuentas flotantes en KV. Es fácil pasar por alto KV y entregar cuentas a los tejidos cercanos o la yema subyacente. Si no tiene éxito, montaje another 10 embriones y repita el procedimiento de inyección. </li></ol> 5. Visualización y Análisis de Flujo de Fluidos KV <ol><li> Para cada embrión seleccionado con los granos dentro KV, añadir una gota de agua estéril para cubrir la agarosa y luego observar KV bajo el microscopio compuesto fluorescente vertical utilizando un objetivo de inmersión de agua 63X (Figura 1I). Alternativamente, un cubreobjetos se puede aplicar para su uso con objetivos de no inmersión de agua y / o microscopios invertidos. </li><li> Utilice una cámara de alta velocidad montado en el microscopio (Zeiss AxioCamHSm por ejemplo) para grabar una película de 10 segundos. Registrar tanto las perlas usando el canal de fluorescencia (aproximadamente 70 cuadros / seg) y el lumen KV utilizando un campo claro o de contraste de interferencia diferencial (DIC) de canal. </li><li> Para visualizar todos los movimientos de cuentas con el tiempo, importar la película de perlas fluorescentes en ImageJ software (descarga gratuita en <a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/" target="_blank">http://rsb.info.nih.gov/ij/</a> ) unand crear una proyección máxima de todas las señales fluorescentes en la película. Para realizar la proyección máxima en ImageJ, haga clic en &quot;Imagen → → Pilas proyecto Z&quot;. En el &quot;Proyecto Z&quot; de la ventana, proyectar todos los cortes con el tipo de proyección de &quot;intensidad máxima&quot;. Esta imagen puede ser superpuesta sobre una imagen DIC de la KV en la que las perlas fueron imágenes (Figuras 3A-B). </li><li> Los movimientos de las perlas individuales pueden ser rastreados usando ImageJ. Un plugin (&quot;Tracking Manual&quot;) se puede descargar en <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/track/track.html" target="_blank">http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/track/track.html</a> . Abra la película perlas fluorescentes en ImageJ y ejecutar la función de seguimiento manual. En la ventana de seguimiento manual, revise los &quot;parámetros&quot; y muestran los parámetros de entrada para los &quot;intervalos de tiempo&quot; y &quot;x / y calibración&quot;. Seleccione manualmente los granos que quedan en el plano focal de la película durante ≥ 50 cuadros y luego un seguimiento de ≥ 5 cuentas por embrión. La trayectoria y la velocidad de cada perla se genera por the software (Figuras 3 CD). </li></ol>

<ol>
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No hay conflictos de interés declarado.

Usando etapa específica de inyecciones para apuntar MO con el linaje celular DFC / KV es un enfoque útil para el estudio de células autonomía de la función de genes y fenotipos pleiotrópicos evitar causados ​​por caída génica global. Sin embargo, estas inyecciones pueden ser técnicamente difícil. La inyección de MO entre las etapas de 256 y 1.000 células por células puede dar lugar a tres resultados posibles: 1) el MO sigue siendo agregadas en el sitio de inyección, 2) se difunde en toda la yema de MO ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo / material </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> Estándar de Control oligo-lisamina etiquetado </td><td> Gene Tools, LLC </td><td></td></tr><tr><td> Custom Rock2b morfolino oligo </td><td> Gene Tools, LLC </td><td></td></tr><tr><td> Fluoresbrite Multifluorescent 0,5 micras Microesferas </td><td> Polysciences, Inc. </td><td> 24054 </td></tr></tbody></table>

analysis of gene function and visualization of cilia-generated fluid flow in kupffer's vesicle

Los órganos internos como el corazón, el cerebro y el intestino desarrollar izquierda-derecha (LR) las asimetrías que son críticos para sus funciones normales 1. Cilios Motile están involucrados en el establecimiento de LR asimetría en embriones de vertebrados, incluyendo ratón, rana, pez cebra y 2-6. Estos &#39;cilios LR, generar un flujo de fluido asimétrico, que es necesario para desencadenar una conservadas nodal asimétrica (TGF-β superfamilia) cascada de señalización en el mesodermo de la placa lateral izquierda, que se cree que proporcionan información LR patrones para el desarrollo de órganos 7. Por lo tanto, para entender los mecanismos subyacentes a los patrones LR, es esencial para identificar los genes que regulan la organización de las células ciliadas LR, la motilidad y la longitud de los cilios LR y su capacidad para generar el flujo asimétrico robusto. En el embrión de pez cebra, LR cilios se encuentran en la vesícula Kupffer (KV) 2,4,5. KV se compone de una sola capa de células epiteliales monociliatedque encierran un lumen lleno de líquido. Mapeo de destino ha demostrado que KV se deriva de un grupo de ~ 20-30 células conocidas como células precursoras dorsales (CFD) que migran en el margen blastodermo dorsal durante las etapas epibolia 8,9. Durante las etapas tempranas somite, cluster CFD y se diferencian en células epiteliales ciliadas para formar KV en la tailbud del embrión 10,11. La capacidad de identificar y rastrear las CFD-en combinación con la transparencia óptica y el rápido desarrollo del pez cebra embriones de pez cebra KV hacer un excelente sistema modelo para estudiar las células ciliadas LR. Curiosamente, los progenitores del linaje de células DFC / KV retener puentes citoplasmáticos entre la célula de yema de hasta 4 horas después de la fertilización (hpf), mientras que los puentes citoplásmicos entre la célula de yema y otras células embrionarias después de cerrar 2 hpf 8. Aprovechando estos puentes citoplasmáticos, hemos desarrollado una estrategia de inyección etapa específica para entregar morfolino oligonucleotides (MO) exclusivamente a las CFD y desmontables la función de un gen diana en estas 12 células. Esta técnica crea embriones quiméricos en los que se tocaron la función de genes en el linaje DFC / KV desarrollo en el contexto de un embrión de tipo salvaje. Para el análisis de flujo de fluidos asimétrica en KV, inyectamos microesferas fluorescentes en la luz y el movimiento KV registro perla usando videomicroscopy 2. El flujo de fluido se visualiza fácilmente y se puede cuantificar mediante el seguimiento de desplazamiento talón con el tiempo. Aquí, utilizando la etapa específica de DFC orientada técnica gen desmontables y la inyección de microesferas fluorescentes en KV para visualizar el flujo, se presenta un protocolo que proporciona un enfoque eficaz para caracterizar el papel de un gen en particular durante el desarrollo y la función KV.

Específicos Stage-inyecciones MO proporcionar un enfoque útil para analizar la función de genes en compartimentos específicos del embrión. Figura 1 presenta un diagrama de flujo de las estrategias de inyección usados ​​para probar la función de genes en DFC / KV células y cómo introducir perlas fluorescentes para visualizar el flujo de fluido en KV. La distribución de MO fluorescente en exitosos específicos etapa-embriones inyectados se muestra esquemáticamente en las figuras 1D-...

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Analysis of Gene Function and Visualization of Cilia-Generated Fluid Flow in Kupffer&#039;s Vesicle

Los cilios generada por el flujo de líquido en la vesícula Kupffer (KV) controla de izquierda a derecha del patrón del embrión de pez cebra. Aquí se describe una técnica para modular la función de genes específicamente en células KV. Además, se muestra cómo entregar perlas fluorescentes en KV para visualizar el flujo de fluido.

El análisis de la función génica y visualización de los cilios-generó un flujo de líquido en la vesícula Kupffer

Internal organs such as the  heart, brain, and gut develop left-right (LR) asymmetries that are critical for  their normal functions1. Motile cilia are ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Analysis of Gene Function and Visualization of Cilia-Generated Fluid Flow in Kupffer's Vesicle

14.7K vistas.  Upstate Medical University. Los cilios generada por el flujo de líquido en la vesícula Kupffer (KV) controla de izquierda a derecha del patrón del embrión de pez cebra. Aquí se describe una técnica para modular la función de genes específicamente en células KV. Además, se muestra cómo entregar perlas fluorescentes en KV para visualizar el flujo de fluido.

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Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic oligonucleotides with antisense complementarity to target RNAs, can be added to the embryo to reduce the expression of a particular gene product.  Conversely, processed mRNA can be added to the embryo to increase levels of a gene product.  The vehicle for adding either mRNA or morpholino to an embryo is microinjection.  Microinjection is efficient and rapid, allowing for the injection of hundreds of embryos per hour.  This video shows all the steps involved in microinjection.  Briefly, eggs are collected immediately after being laid and lined up against a microscope slide in a Petri dish.  Next, a fine-tipped needle loaded with injection material is connected to a microinjector and an air source, and the microinjector controls are adjusted to produce a desirable injection volume.  Finally, the needle is plunged into the embryo's yolk and the morpholino or mRNA is expelled.

This video shows how morpholino or mRNA can be injected into zebrafish embryos at the one-cell stage to decrease or increase the level of specific gene products during subsequent development.

Microinyección de embriones de pez cebra para analizar la función génica

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic ...

Investigación

Biología

Induction and Testing of Hypoxia in Cell Culture

Hypoxia is defined as the reduction or lack of oxygen in organs, tissues, or cells. This decrease of oxygen tension can be due to a reduced supply in oxygen (causes include insufficient blood vessel network, defective blood vessel, and anemia) or to an increased consumption of oxygen relative to the supply (caused by a sudden higher cell proliferation rate). Hypoxia can be physiologic or pathologic such as in solid cancers 1-3, rheumatoid arthritis, atherosclerosis etc&#x2026; Each tissues and cells have a different ability to adapt to this new condition. During hypoxia, hypoxia inducible factor alpha (HIF) is stabilized and regulates various genes such as those involved in angiogenesis or transport of oxygen 4. The stabilization of this protein is a hallmark of hypoxia, therefore detecting HIF is routinely used to screen for hypoxia 5-7. 
In this article, we propose two simple methods to induce hypoxia in mammalian cell cultures and simple tests to evaluate the hypoxic status of these cells.

Here we propose simple methods to induce hypoxia in cell cultures and simple tests to evaluate the hypoxic status of the cultures.

Inducción y prueba de hipoxia en el cultivo celular

Hypoxia is defined as the reduction or lack of oxygen in organs, tissues, or cells.  This decrease of oxygen tension can be due to a reduced supply in ...

Annotation of Plant Gene Function via Combined Genomics, Metabolomics and Informatics

Given the ever expanding number of model plant species for which complete genome sequences are available and the abundance of bio-resources such as knockout mutants, wild accessions and advanced breeding populations, there is a rising burden for gene functional annotation. In this protocol, annotation of plant gene function using combined co-expression gene analysis, metabolomics and informatics is provided (Figure 1). This approach is based on the theory of using target genes of known function to allow the identification of non-annotated genes likely to be involved in a certain metabolic process, with the identification of target compounds via metabolomics. Strategies are put forward for applying this information on populations generated by both forward and reverse genetics approaches in spite of none of these are effortless. By corollary this approach can also be used as an approach to characterise unknown peaks representing new or specific secondary metabolites in the limited tissues, plant species or stress treatment, which is currently the important trial to understanding plant metabolism.

Combination of genomics, co-expression gene analysis and the identification of target compounds via metabolism give gene functional annotation.

Anotación de la función de genes de plantas a través de la genómica, la metabolómica combinados e Informática

Given the ever expanding number of model plant species for which complete genome sequences are available and the abundance of bio-resources such as ...

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the messagefor review see 1. However, it's now widely accepted that synonymous codon usage is the primary cause of non-uniform translational elongation rates1. Synonymous codons are not used with identical frequency. A bias exists in the use of synonymous codons with some codons used more frequently than others2. Codon bias is organism as well as tissue specific2,3. Moreover, frequency of codon usage is directly proportional to the concentrations of cognate tRNAs4. Thus, a frequently used codon will have higher multitude of corresponding tRNAs, which further implies that a frequent codon will be translated faster than an infrequent one. Thus, regions on mRNA enriched in rare codons (potential pause sites) will as a rule slow down ribosome movement on the message and cause accumulation of nascent peptides of the respective sizes5-8. These pause sites can have functional impact on the protein expression, mRNA stability and protein foldingfor review see 9. Indeed, it was shown that alleviation of such pause sites can alter ribosome movement on mRNA and subsequently may affect the efficiency of co-translational (in vivo) protein folding1,7,10,11. To understand the process of protein folding in vivo, in the cell, that is ultimately coupled to the process of protein synthesis it is essential to gain comprehensive insights into the impact of codon usage/tRNA content on the movement of ribosomes along mRNA during translational elongation.
Here we describe a simple technique that can be used to locate major translation pause sites for a given mRNA translated in various cell-free systems6-8. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA. The rationale is that at low-frequency codons, the increase in the residence time of the ribosomes results in increased amounts of nascent peptides of the corresponding sizes. In vitro transcribed mRNA is used for in vitro translational reactions in the presence of radioactively labeled amino acids to allow the detection of the nascent chains. In order to isolate ribosome bound nascent polypeptide complexes the translation reaction is layered on top of 30% glycerol solution followed by centrifugation. Nascent polypeptides in polysomal pellet are further treated with ribonuclease A and resolved by SDS PAGE. This technique can be potentially used for any protein and allows analysis of ribosome movement along mRNA and the detection of the major pause sites. Additionally, this protocol can be adapted to study factors and conditions that can alter ribosome movement and thus potentially can also alter the function/conformation of the protein.

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

A technique to identify translational pause sites on mRNA is described. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA, followed by the size analysis of the nascent chains using a denaturing gel electrophoresis.

El aislamiento de los ribosomas polipéptidos nacientes Bound<em&gt; In vitro</em&gt; Para la identificación de sitios de traslación pausa a lo largo del ARNm

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualización y Análisis de las moléculas de ARNm mediante fluorescencia<em&gt; In Situ</em&gt; La hibridación en<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Functional Reconstitution and Channel Activity Measurements of Purified Wildtype and Mutant CFTR Protein

The Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) is a unique channel-forming member of the ATP Binding Cassette (ABC) superfamily of transporters. The phosphorylation and nucleotide dependent chloride channel activity of CFTR has been frequently studied in whole cell systems and as single channels in excised membrane patches. Many Cystic Fibrosis-causing mutations have been shown to alter this activity. While a small number of purification protocols have been published, a fast reconstitution method that retains channel activity and a suitable method for studying population channel activity in a purified system have been lacking. Here rapid methods are described for purification and functional reconstitution of the full-length CFTR protein into proteoliposomes of defined lipid composition that retains activity as a regulated halide channel. This reconstitution method together with a novel flux-based assay of channel activity is a suitable system for studying the population channel properties of wild type CFTR and the disease-causing mutants F508del- and G551D-CFTR. Specifically, the method has utility in studying the direct effects of phosphorylation, nucleotides and small molecules such as potentiators and inhibitors on CFTR channel activity. The methods are also amenable to the study of other membrane channels/transporters for anionic substrates.

Described here is a rapid and effective procedure for functional reconstitution of purified wild-type and mutant CFTR protein that preserves activity for this chloride channel, which is defective in Cystic Fibrosis. Iodide efflux from reconstituted proteoliposomes mediated by CFTR allows studies of channel activity and the effects of small molecules.

Reconstitución funcional y la actividad del canal Las mediciones de Purificada Wildtype y mutante CFTR Proteína

The Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) is a unique channel-forming member of the ATP Binding Cassette (ABC) superfamily of ...

The Assembly and Application of 'Shear Rings': A Novel Endothelial Model for Orbital, Unidirectional and Periodic Fluid Flow and Shear Stress

Deviations from normal levels and patterns of vascular fluid shear play important roles in vascular physiology and pathophysiology by inducing adaptive as well as pathological changes in endothelial phenotype and gene expression. In particular, maladaptive effects of periodic, unidirectional flow induced shear stress can trigger a variety of effects on several vascular cell types, particularly endothelial cells. While by now endothelial cells from diverse anatomic origins have been cultured, in-depth analyses of their responses to fluid shear have been hampered by the relative complexity of shear models (e.g., parallel plate flow chamber, cone and plate flow model). While these all represent excellent approaches, such models are technically complicated and suffer from drawbacks including relatively lengthy and complex setup time, low surface areas, requirements for pumps and pressurization often requiring sealants and gaskets, creating challenges to both maintenance of sterility and an inability to run multiple experiments. However, if higher throughput models of flow and shear were available, greater progress on vascular endothelial shear responses, particularly periodic shear research at the molecular level, might be more rapidly advanced. Here, we describe the construction and use of shear rings: a novel, simple-to-assemble, and inexpensive tissue culture model with a relatively large surface area that easily allows for a high number of experimental replicates in unidirectional, periodic shear stress studies on endothelial cells.

The Assembly and Application of &#039;Shear Rings&#039;: A Novel Endothelial Model for Orbital, Unidirectional and Periodic Fluid Flow and Shear Stress

Different levels and patterns of fluid shear are known to modulate endothelial gene expression, phenotype and susceptibility to disease. We discuss the assembly and use of 'shear rings': a model that produces unidirectional, periodic shear stress patterns. Shear rings are simple to assemble, economical and can produce high cell yields.

La Asamblea y la Aplicación de &#39;Shear Anillos&#39;: A Novel endotelial Modelo de Orbital, unidireccional y periódica flujo de fluido y la tensión de cizallamiento

Deviations from normal levels and patterns of vascular fluid shear play important roles in vascular physiology and pathophysiology by inducing adaptive as ...

Microbiota Analysis Using Two-step PCR and Next-generation 16S rRNA Gene Sequencing

The human gut is colonized by trillions of bacteria that support physiologic functions such as food metabolism, energy harvesting, and regulation of the immune system. Perturbation of the healthy gut microbiome has been suggested to play a role in the development of inflammatory diseases, including multiple sclerosis (MS). Environmental and genetic factors can influence the composition of the microbiome; therefore, identification of microbial communities linked with a disease phenotype has become the first step towards defining the microbiome&#8217;s role in health and disease. Use of 16S rRNA metagenomic sequencing for profiling bacterial community has helped in advancing microbiome research. Despite its wide use, there is no uniform protocol for 16S rRNA-based taxonomic profiling analysis. Another limitation is the low resolution of taxonomic assignment due to technical difficulties such as smaller sequencing reads, as well as use of only forward (R1) reads in the final analysis due to low quality of reverse (R2) reads. There is need for a simplified method with high resolution to characterize bacterial diversity in a given biospecimen. Advancements in sequencing technology with the ability to sequence longer reads at high resolution have helped to overcome some of these challenges. Present sequencing technology combined with a publicly available metagenomic analysis pipeline such as R-based Divisive Amplicon Denoising Algorithm-2 (DADA2) has helped advance microbial profiling at high resolution, as DADA2 can assign sequence at the genus and species levels. Described here is a guide for performing bacterial profiling using two-step amplification of the V3-V4 region of the 16S rRNA gene, followed by analysis using freely available analysis tools (i.e., DADA2, Phyloseq, and METAGENassist). It is believed that this simple and complete workflow will serve as an excellent tool for researchers interested in performing microbiome profiling studies.

Described here is a simplified standard operating procedure for microbiome profiling using 16S rRNA metagenomic sequencing and analysis using freely available tools. This protocol will help researchers who are new to the microbiome field as well as those requiring updates on methods to achieve bacterial profiling at a higher resolution.

Análisis de microbiota utilizando PCR de dos pasos y secuenciación genética de rRNA 16S de próxima generación

The human gut is colonized by trillions of bacteria that support physiologic functions such as food metabolism, energy harvesting, and regulation of the ...

In situ Hybridization for Sipunculus nudus Coelomic Fluid

In situ hybridization (ISH) is a very informative technique to present cellular distribution patterns of specific genes (e.g., mRNA and ncRNA) in tissues. The sipunculid worm Sipunculus nudus is a crucial fishery resource as it has high nutritional and medicinal values. Currently, the research on the molecular biology of Sipunculus nudus is still in its infancy. The purpose of this article is to develop a sensitive method for localizing specific mRNA in Sipunculus nudus coelomic fluid. The protocol includes detailed steps of ISH, including digoxigenin-labeled antisense and sense riboprobe preparation, coelomic fluid collection and section preparation, specific riboprobe hybridization, antibody incubation, coloration and post-coloration treatments. The representative results obtained from a successful experiment using this method are demonstrated. The protocol should be applicable to other Sipuncula species as well.

In situ Hybridization for Sipunculus nudus Coelomic Fluid

This protocol describes an effective in situ hybridization approach to detect the mRNA expression levels and spatial patterns of target genes in Sipunculus nudus coelomic fluid.

Hibridación in situ para Sipunculus nudus Coelomic Fluid

In situ hybridization (ISH) is a very informative technique to present cellular distribution patterns of specific genes (e.g., mRNA and ncRNA) in tissues. ...

In Vitro Analysis of E3 Ubiquitin Ligase Function

The covalent attachment of ubiquitin (Ub) to internal lysine residue(s) of a substrate protein, a process termed ubiquitylation, represents one of the most important post-translational modifications in eukaryotic organisms. Ubiquitylation is mediated by a sequential cascade of three enzyme classes including ubiquitin-activating enzymes (E1 enzymes), ubiquitin-conjugating enzymes (E2 enzymes), and ubiquitin ligases (E3 enzymes), and sometimes, ubiquitin-chain elongation factors (E4 enzymes). Here, in vitro protocols for ubiquitylation assays are provided, which allow the assessment of E3 ubiquitin ligase activity, the cooperation between E2-E3 pairs, and substrate selection. Cooperating E2-E3 pairs can be screened by monitoring the generation of free poly-ubiquitin chains and/or auto-ubiquitylation of the E3 ligase. Substrate ubiquitylation is defined by selective binding of the E3 ligase and can be detected by western blotting of the in vitro reaction. Furthermore, an E2~Ub discharge assay is described, which is a useful tool for the direct assessment of functional E2-E3 cooperation. Here, the E3-dependent transfer of ubiquitin is followed from the corresponding E2 enzyme onto free lysine amino acids (mimicking substrate ubiquitylation) or internal lysines of the E3 ligase itself (auto-ubiquitylation). In conclusion, three different in vitro protocols are provided that are fast and easy to perform to address E3 ligase catalytic functionality.

In Vitro Analysis of E3 Ubiquitin Ligase Function

The present study provides detailed in vitro ubiquitylation assay protocols for the analysis of E3 ubiquitin ligase catalytic activity. Recombinant proteins were expressed using prokaryotic systems such as Escherichia coli culture.

In vitro Análisis de la función E3 Ubiquitina Ligasa

The covalent attachment of ubiquitin (Ub) to internal lysine residue(s) of a substrate protein, a process termed ubiquitylation, represents one of the ...