El objetivo general de este protocolo es analizar aspectos clave importantes de la función de la ligasa E3, incluida la especificidad de la enzima E2, la selección de sustrato y la transferencia de ubiquitina. La principal ventaja de esta técnica es su amplia aplicabilidad, ya que las proteínas de todas las fuentes eucariotas pueden expresarse y estudiarse in vitro de forma recombinante sin necesidad de equipos especiales. Cuando se utiliza la técnica de descarga de lisina por primera vez, es importante optimizar los parámetros del ensayo, como las concentraciones de enzimas, para identificar las condiciones ideales de descarga para la ligasa E3 de elección.
Para realizar un ensayo de auto-ubiquitilación in vitro, configure un esquema de pipeteo para probar la capacidad funcional de diferentes enzimas E2 y prepare una mezcla maestra en hielo para todas las reacciones de ubiquitilación más una reacción adicional. A continuación, agregue un micromolar de enzimas E2 a los tubos apropiados e incube las muestras en un termociclador de PCR durante dos horas en las condiciones indicadas. Después de la incubación, agregue el tampón de muestra SDS a cada reacción y mezcle mediante pipeteo varias veces.
Luego hierva inmediatamente las muestras a 95 grados Celsius durante cinco minutos y almacene las proteínas desnaturalizadas a 20 grados Celsius. Para realizar un ensayo de ubiquitilación de sustrato in vitro, prepare el esquema de pipeteo para todas las reacciones. Después de calcular la cantidad de mezcla maestra requerida para una reacción, prepare la mezcla maestra para todas las reacciones en hielo y agregue la mezcla maestra a cada tubo.
Agregue las respectivas ligas E3 individualmente. A continuación, incubar las muestras en el termociclador de PCR durante dos horas como se ha demostrado. Al final de la incubación, agregue dos veces el tampón de muestra SDS a cada reacción, mezcle varias veces mediante pipeteo y hierva las muestras durante cinco minutos a 95 grados centígrados.
Para realizar un ensayo de descarga de lisina, configure el esquema de pipeteo para la reacción de carga e incube las reacciones de carga durante 15 minutos a 37 grados centígrados. Para detener la reacción de carga, agregue apirasa a una concentración final de 1,8 unidades por mililitro e incube la reacción durante cinco minutos a temperatura ambiente. Al final de la incubación, agregue EDTA a una concentración final de 30 milimolares y use agua de doble destilación para ajustar el volumen de la reacción a 30 microlitros.
Para descargar la ubiquitilación E2 por E3, configure cinco tubos correspondientes a los puntos de tiempo para el experimento, agregue 6.7 microlitros de tampón de muestra no reductor a cada tubo, elimine seis microlitros de la reacción de carga detenida del tubo de punto cero de tiempo y ajuste el volumen total a 26.7 microlitros. Para configurar las reacciones de descarga, agregue agua de doble destilación, tampón de ubiquitilación, BSA, lisina, ligasa E3 y la E2 cargada a cada reacción. Después de los períodos de tiempo seleccionados, transfiera muestras de 20 microlitros de cada reacción de descarga al tubo de muestra correspondiente.
Luego, vórtice inmediatamente las muestras y colóquelas a 70 grados centígrados durante 10 minutos. En este análisis representativo de Western blot, el CHIP inactivo no fue auto-ubiquitilado. Sin embargo, los productos de ubiquitina independientes de E3 se formaron en presencia de CHIP inactivo y en ausencia de CHIP.
El CHIP de tipo salvaje fue auto-ubiquitilado cuando se combinó con las proteínas de las familias UBE2D y UBE2E, mientras que las cadenas de poliubiquitina libre se produjeron en cooperación con las proteínas de la familia UBE2D pero no con las proteínas de la familia UBE2E. La unión de la ubiquitina por UBE2N/V1 dirigió la formación de cadenas libres de ubiquitina. La auto-ubiquitilación y ubiquitilación de UNC-45B se observó con CHIP de tipo salvaje pero no con el mutante inactivo de CHIP, lo que indica que UNC-45B actúa como sustrato conservado para CHIP.
Cuando se analizó la actividad catalítica de CHIP utilizando un ensayo de descarga de lisina, la enzima UBE2D2 no cargada tenía un peso molecular de 17 kilodaltons y la UBE2D2 cargada con una sola molécula de ubiquitina tenía un peso molecular de aproximadamente 26 kilodaltons. En el momento 0, se observó todo el rendimiento E2 cargado. En presencia de CHIP inactivo, se detectó una débil descarga independiente de la ligasa E3 de UBE2D2 pero no auto-ubiquitilación de CHIP.
En presencia de CHIP de tipo salvaje, la descarga de UBE2D2 fue rápida y se completó en 60 minutos, y la auto-ubiquitilación de CHIP indicó una transferencia de ubiquitina a sus propios residuos de lisina. Debido a la capacidad limitada de E2, trabaje lo más rápido posible e inmediatamente proceda con la reacción de descarga seguida de SDS-PAGE y Western blotting. Siguiendo estos protocolos de ubiquitilación in vitro, los tipos específicos de enlace de ubiquitilación se pueden identificar sondeando los Western blots con anticuerpos específicos de enlace.
