Este protocolo proporciona una estrategia ventajosa para enriquecer las células madre de la glándula lagrimal para la regeneración y reconstrucción de la glándula lagrimal. Las células madre de la glándula lagrimal muestran capacidad de expansión a largo plazo y el potencial de diferenciación. La principal ventaja de esta técnica es que el medio de cultivo para las células madre de la glándula lagrimal está libre de suero, lo que muestra el enorme valor para la reparación de la glándula lagrimal Comience por obtener un ratón macho BALB / c de seis a ocho semanas de edad sacrificado y corte la piel detrás de la oreja para exponer la glándula lagrimal y el tejido conectivo que lo rodea.
Pelar el tejido conectivo mediante disección roma con la ayuda de pinzas y eliminar la glándula lagrimal. Sumerja las glándulas lagrimales en un plato de seis centímetros con cuatro mililitros de etanol al 75% durante 10 segundos y enjuague inmediatamente con una solución de PBS 10 milimolar dos veces. Cortar las glándulas lagrimales en pequeños fragmentos de aproximadamente un milímetro cúbico.
Transfiéralos a un tubo centrífugo estéril de 15 mililitros y trate los tejidos con 500 microlitros de 25 unidades por mililitro de dispase y 500 microlitros de 0,1% colagenasa I durante una hora a 37 grados centígrados. Trate los fragmentos de la glándula lagrimal con un mililitro de EDTA de tripsina al 0,05% durante 10 minutos a 37 grados centígrados y disocie los fragmentos en células individuales pipeteando repetidamente. Filtre la suspensión a través de un filtro de 70 micrómetros, recoja el filtro en un tubo de centrífuga estéril de 15 mililitros y centrífuga a 150 veces G durante cinco minutos.
Después de la centrifugación, retire el sobrenadante, agregue 10 mililitros de solución de PBS de 10 milimolares para lavar el gránulo celular y centrifugue la suspensión a 150 veces G durante cinco minutos. Repita el lavado del pellet celular. Luego, retire el sobrenadante y agregue un mililitro de una proporción de 1: 1 de Modified Eagles Medium de Dulbecco y F-12 de Ham para resuspendir los gránulos celulares.
Agregue 20 microlitros de matriz de células madre de células madre de la glándula lagrimal en el centro del pozo de una placa de 24 pocillos. Use una punta de pipeta para expandirla a un círculo de aproximadamente seis a ocho milímetros de diámetro e incube la mezcla durante 20 minutos a 37 grados Celsius para cubrir previamente el pozo. Use un contador celular para determinar el número de células y agregue 40 microlitros de medio de células madre de la glándula lagrimal, o LGSCM, con un total de 10, 000 células en 40 microlitros del gel de matriz.
Mézclalos suavemente con una pipeta. Use una pipeta para dejar caer cuidadosamente 80 microlitros de la mezcla sobre el área pre-recubierta en cada pocillo de la placa de 24 pocillos. Incubar la mezcla durante 20 minutos a 37 grados centígrados y añadir 600 microlitros de LGSCM.
Cambie el medio de cultivo en cada pozo una vez cada dos días. Después de siete días de cultivo, busque esferas LGSC que tengan un diámetro de 100 a 300 micrómetros bajo el microscopio invertido. Utilice este protocolo para aislar y cultivar células madre primarias de la glándula lagrimal de ratones Rosa26 y NOD.
Después de siete días de cultura, retire bien el medio de cultivo de la esfera de la cultura. Desagregar las esferas LGSC mediante incubación en 20 microlitros de 10 unidades por mililitro de dispase y 100 microlitros de PBS 10 milimolares durante 30 minutos a 37 grados centígrados. Transfiera la suspensión a un tubo de centrífuga de 15 mililitros y centrífuga a 150 veces G durante cuatro minutos.
Retire el sobrenadante. Trate las esferas con un mililitro de EDTA de tripsina al 0,05% durante cinco minutos a 37 grados Celsius Agregue un mililitro de inhibidor de tripsina al 0,05% y pipetee repetidamente para neutralizar la tripsina y disociar las esferas en células individuales. Centrifugar a 150 veces G durante cinco minutos y retirar el sobrenadante para peletizar los LGSC.
Agregue un mililitro de LGSCM para resuspendir el pellet de células madre de la glándula lagrimal y placa las células como se demostró anteriormente. Si realiza el procedimiento uno, extienda el tiempo de cultivo de las LGSC de siete a 14 días con el sistema de cultivo de células madre de la glándula lagrimal para la diferenciación aleatoria. Para el procedimiento dos, cambie la proporción del gel de matriz a LGSCM de 1: 1 a 1: 2 al comienzo del cultivo de células madre de la glándula lagrimal para la diferenciación de células ductales.
Sembrar las células madre de la glándula lagrimal en la matriz para la inducción durante 14 días. Para el procedimiento tres, después del paso, reemplace el LGSCM con LGSCM 10% FBS para la diferenciación de las células acinares. Inducir la diferenciación durante 14 días.
Después de una semana de cultivo, Kr14 y Ki67 se expresaron en todas las esferas formadas por células madre de la glándula lagrimal. Las esferas alcanzaron un diámetro de 100 micrómetros. La tinción de hematoxilina y eosina mostró celularidad en el séptimo día.
Los factores de enriquecimiento de las células madre de la glándula lagrimal obtenidos después de siete días de cultivo primario y subcultivo indicaron que las células enriquecidas por este método tenían una fuerte capacidad proliferativa. En este sistema, las células madre de la glándula lagrimal podrían pasar más de 40 veces y aún así mantener las características de las células madre. Las células madre de la glándula lagrimal fueron inducidas a formar más brotes por el suero fetal bovino y una baja proporción de gel de matriz.
La tinción de hematoxilina y eosina indicó que el suero fetal bovino podría inducir a las esferas a producir estructuras más cavitantes. Después de la inyección ortotópica de células madre de la glándula lagrimal rosa en ratones NOD, se formaron nuevos lóbulos lagrimales adyacentes a las glándulas lagrimales. La mayoría de los lóbulos estaban compuestos por células acinares maduras con alta expresión de AQP5 y había formación de conductos intralobulares con baja expresión de AQP5.
La cantidad de secreción lagrimal en el lado de la inyección de células madre de la glándula lagrimal rosa fue mayor que en el lado de control, pero menor que en los ratones de tipo salvaje El gel de matriz y su mezcla relacionada siempre deben mantenerse en hielo antes de su uso y el tubo de microcentrífuga y las puntas en contacto con el gel de matriz deben enfriarse previamente. El sistema proporciona un modelo ideal para el estudio adicional de las células madre de la glándula lagrimal, la reparación de la glándula lagrimal y la detección de medicamentos para enfermedades de la glándula lagrimal.
