Somos conscientes de los miembros del laboratorio de Mably y Storer Narie por su asistencia técnica, y la Asociación Americana del Corazón (NCRP Desarrollo Científico subvención 0635363N) y el National Heart, Lung, and Blood Institute (Grant SCCOR RFA HL02-027) para su financiación.

Parte 1: La producción de huevos y la recolección <ol><li> La noche antes de la inyección, coloque el pescado en la cría de los tanques con divisiones en su lugar. Para aumentar la producción total de huevos, el pescado se puede configurar en una proporción de dos mujeres a un hombre si así lo desea. </li><li> A la mañana siguiente, después de la luces de la habitación a su vez, tire los divisores de varios tanques y permitir que durante unos 20 minutos de tiempo de apareamiento sin ser molestados. </li><li> Utilizando un colador, recoger los huevos de las jaulas de cría y enjuague con agua de huevo. Vierta los huevos en un plato Petri con agua de huevo y remover los óvulos no fertilizados y los escombros con una pipeta de transferencia. Los peces pueden ser reagrupados en grandes tanques para producir nuevas rondas de huevos para la inyección. Ajustar el tiempo de la recolección de huevos para permitir el máximo número de huevos que se producen, sin dejar pasar la etapa unicelular. </li><li> Colocar un portaobjetos en la tapa invertida de una placa de Petri de 100 mm. Use una pipeta de transferencia a la línea de los huevos contra el lado de la diapositiva que forman una sola columna. Eliminar el agua sobrante del huevo de diapositivas pulsando un Kimwipe contra el lado opuesto de los huevos. (Figura 1) </li></ol> Parte 2: la aguja de tracción, de carga, y la preparación <ol><li> Con un extractor de micropipeta, tirar de un vidrio de 1,0 mm OD capilar en dos agujas y guárdelo en un plato de Petri de 150 mm mediante la fijación sobre las rampas de plastilina. Las agujas se puede tirar de antemano. </li><li> Retrocarga la aguja con 3 l de material de inyección con una pipeta microloader. Agite bien el bolo hacia la punta de la aguja hasta que no haya burbujas de pocos o ningún resto. </li><li> Encienda la fuente de aire y microinyector. Insertar la aguja en el microinyector y asegurar un sello hermético en la vivienda. Compruebe que el micromanipulador se encuentra en una posición adecuada para permitir una amplia gama de movimiento y ajuste. Llevar la punta de la aguja en el plano de visión del microscopio de alta del escenario, y se centran en el más delgado de la región de la punta. Use un par de pinzas para apretar fuerte de la aguja en un punto que deja la aguja lo suficientemente estrecha como para perforar el corion y la yema, pero todavía capaz de ofrecer un tamaño de grano uniforme. Una gota de aceite mineral en un micrómetro puede utilizarse para calcular el volumen de cada inyección. Cuando se inyecta en el aceite, un cordón con un diámetro de 0,1 mm contiene 500 pL de material de inyección (figura 1B), los volúmenes de inyección de 500 pL o 1NL se utilizan normalmente. Pise el pedal y controlar el tamaño del grano, mientras que el recorte de la aguja y el ajuste de la presión de inyección, según sea necesario. Ideal volúmenes de inyección llenará aproximadamente el 10% del volumen del huevo. La calidad de la punta de la aguja es crucial tanto para la facilidad de la inyección y la calidad y la consistencia de los resultados. </li></ol> Parte 3: Inyección <ol><li> Asegúrese de que los embriones no se han desarrollado más allá de la etapa de cuatro células. Idealmente, los embriones debe estar en el estadio de una célula. </li><li> Baje la aguja hacia la columna de los huevos, la celebración de la antena en su lugar con la mano opuesta. </li><li> Perforar la superficie del corion y entrar en la yema de un solo golpe suave, mientras que la observación de cualquier aplastamiento o rotura de la vesícula vitelina. Inyectar el material de inyección en la yema (figura 1C). Evitar la inyección de burbujas de aire o estiramiento de la yema, como puede ser letal para el embrión. Trabajando en la línea, ajustar la presión según sea necesario para mantener un tamaño uniforme de cuentas y, con una punta de la pipeta, retirar los huevos no fertilizados que se ven o se destruyen durante el proceso de inyección. </li><li> Después de completar una columna de huevos, use un chorro suave de agua de huevos para mover los huevos se inyecta en una placa de Petri limpia. Repita según sea necesario. Mantener varios embriones inyectados como un control. Al final del día, eliminar embriones muertos y registrar el número de embriones inyectados. Cambie el agua de huevo en el plato de forma periódica para reducir el riesgo de infección. </li></ol> Parte 4: Los resultados representativos Dependiendo de lo que se está inyectando, los embriones pueden sobrevivir a un ritmo menor que sus hermanos no inyectadas. Afortunadamente, es fácil de inyectar un gran número de ellos, así que esto es raramente un problema. Es normal que morphants para exponer el desarrollo de un ligero retraso. Para ilustrar los resultados de la microinyección, hemos utilizado este protocolo para manipular los niveles de la proteína del Corazón de cristal (HEG). HEG es una proteína transmembrana necesaria para el desarrollo normal del corazón. En su ausencia, se desarrollan los embriones corazones con tractos de entrada gigantes y cámaras de 1. Hemos inyectado dos morfolinos no descrita con anterioridad en contra de HEG, heg_e3i3_egfr1 y heg_e4i4_egfr2, a una concentración de 500 mM. A los 2 días después de la fecundación, los controles no inyectados hermano parece normal, como se esperaba (Figura 2A y B). Embriones inyectados con heg_e3i3_egfr1 tiene edema cerebral (figura 2C). Aunque los corazones de la mayoría de estos morphants han alterado la morfología, las cámaras son de tamaño normal (Figura 2). Embriones inyectadosheg_e4i4_egfr2 con defectos cardíacos presentan variables. Algunos parecen normales, mientras que otros tienen grandes extensiones de entrada y atrios moderadamente grande (Figura 2 E y F). El mutante HEG, como se informó anteriormente 1, tiene un tracto de entrada enormemente ampliada y la aurícula (Figura 2 G y H). También inyecta embriones de tipo salvaje con 400 ARNm ng / l transcribe a partir de larga duración HEG cDNA. Mientras que los controles no inyectados se desarrollan normalmente (figura 3 A y B), los embriones inyectados con ARNm HEG muestran un espectro de fenotipos que van desde la apariencia de tipo salvaje de ciclopía severa, acortamiento del eje del cuerpo principal, la necrosis de la cabeza y el cuerpo, y los defectos de la línea media (figura 3C y D). <img src="/files/ftp_upload/1115/Figure%201%20FINAL.png" alt="" /> Los embriones Figura 1. Que se inyecta se alinean en contra de un portaobjetos de microscopio en una placa de Petri (A). El volumen de inyección se determina mediante la inyección en aceite mineral colocado en un micrómetro. Un volumen de inyección de 500 pL, que se usa comúnmente, tiene un diámetro de 0,1 mm (B). Inmediatamente después de la inyección, el morfolino o ARNm es visible como un punto de puntuar en la yema (C). <img src="/files/ftp_upload/1115/Figure%202%20FINAL.png" alt="" /> Figura 2. A los 2 días después de la fecundación, los embriones inyectados no tienen defectos graves (A) o fenotipo cardíaco (B). Embriones inyectados con la heg_e3i3_egfr1 morfolino tiene edema cerebral (C, flecha), pero las cámaras del corazón de tamaño normal (D). Algunos embriones inyectados con la heg_e4i4_egfr2 morfolino tienen tractos ampliada de entrada y atrios (E, F). HEG mutantes tienen tractos de entrada graves ampliada y en los atrios (G, H). (A), (C), (E) y (G) son 4x imágenes DIC; (B), (D), (F) y (H) es de 20x imágenes DIC. un atrio =, que = tracto de entrada. <img src="/files/ftp_upload/1115/Figure%203%20FINAL.png" alt="" /> Figura 3. A las 24 horas posteriores a la fecundación, los embriones inyectados tienen un cuerpo largo y recto sin defectos necrosis o la línea media (A) y dos ojos claramente definidos, con un tubo neural entre ellos (B). Algunos embriones inyectados con ARNm HEG, en cambio, presentan un eje corporal reducido, necrosis, somitas deformado (C) y ciclopía (D). (A) y (C) son 4x imágenes DIC; (B) y (D) es de 20x imágenes DIC.

<ol>
	<li>Mably, J. D., Mohideen, M. P. K., Burns, C. G., Chen, J., Fishman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=heart+of+glass+regulates+the+concentric+growth+of+the+heart+in+zebrafish.">heart of glass regulates the concentric growth of the heart in zebrafish.</a> Curr. Biol. 13, 2138-2147 (2003).</li></ol>

Una de las fortalezas del sistema de modelo de pez cebra es la facilidad con que los productos de genes específicos puede ser añadido o eliminado del embrión mediante microinyección. Para doquier sobreexpresan una proteína en particular, el mRNA se inyecta en la yema de huevo en la etapa 1 de las células. Durante el desarrollo posterior del embrión, el ARN se distribuye por todo el organismo y traducido. Por el contrario, para eliminar una proteína en particular, morfolinos se utilizan. Morfolinos son oligonucleótidos sintéticos diseñados con la complementariedad de los ARN antisentido específicos. Al igual que los ARNm, morfolinos son inyectados en la yema de huevo en la etapa 1 de las células. Dentro del embrión, que se unen a sus ARNs dianas, la prevención de la traducción. La principal modificación que debe hacerse para cada morfolino o ARNm es la concentración de material inyectado. Una concentración demasiado alta de cualquiera de morfolino o ARNm no puede causar la toxicidad específica, mientras que cada morfolino debe ser probado empíricamente para determinar su concentración óptima, generalmente entre las concentraciones de morfolino 200 M y M 500 derribar actividad de los genes con eficacia sin causar defectos no específicos. El tamaño exacto de la abertura de la aguja no es crucial. Dentro de un rango de tamaños de aguja, la presión de inyección y el tiempo de inyección se puede ajustar para producir un bolo del volumen correcto. Morfolinos tienen muchas aplicaciones, incluyendo la disección funcional de los dominios de una proteína. Cuando estén diseñados para destinatarios específicos exón-intrón cruces, morfolinos evitará el empalme que se produzcan allí. Hemos examinado los efectos de dos morfolinos que se unen los exones e intrones cruces en el pre-ARNm de HEG. El heg_e3i3_egfr1 morfolino une la unión entre el exón 3 y el intrón 3, la prevención de la maquinaria de empalme de la incorporación de exón 3 en transcripciones de madurez. El heg_e4i4_egfr2 morfolino similar elimina el exón 4. Tanto los exones 3 y 4 de codificar los dominios que contienen EGF-como repite. Algunos embriones inyectados con heg_e4i4_egfr2 moderadamente fenocopia el mutante más experimentos serán necesarios para comprender el papel de HEG exón 4 en el desarrollo del corazón. Sorprendentemente, los embriones inyectados con heg_e3i3_egfr1 tiene edema cerebral, una característica que no se ve en los mutantes HEG. Esto puede ser debido a la capacidad de morfolinos para obligar a la madre que las transcripciones no se verían afectadas en los mutantes cigóticos.

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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Microinjector</td>
<td>Tool</td>
<td>Harvard Apparatus</td>
<td>PLI 100</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Micromanipulator</td>
<td>Tool</td>
<td>Narishige</td>
<td>MN 153</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Needle Puller</td>
<td>Tool</td>
<td>Sutter Instruments</td>
<td>P 97</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glass Capillaries</td>
<td>Tool</td>
<td>World Precision Instruments</td>
<td>TW100 F6</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microloader Pipettes</td>
<td>Tool</td>
<td>Eppendorf</td>
<td>5242956.003</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Needle Holder</td>
<td>Tool</td>
<td>World Precision Instruments</td>
<td>MPH310</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function

Una de las ventajas del pez cebra el estudio es la facilidad y la velocidad de la manipulación de los niveles de proteína en el embrión. Morfolinos, que son oligonucleótidos sintéticos con la complementariedad de los ARN antisentido objetivo, se puede agregar a los embriones para reducir la expresión de un producto genético particular. Por el contrario, el ARNm procesado se puede agregar a los embriones para aumentar los niveles de un producto genético. El vehículo para incorporar el uso de ARNm o morfolino a un embrión es la microinyección. Microinyección es eficiente y rápida, lo que permite la inyección de cientos de embriones por hora. Este video muestra todos los pasos necesarios para la microinyección. En pocas palabras, los huevos son recogidos inmediatamente después de ser despedido y se alinearon en contra de un portaobjetos de microscopio en una placa de Petri. A continuación, una aguja de punta fina cargados con material de inyección está conectado a un microinyector y una fuente de aire, y los controles microinyector se ajustan para producir un volumen de inyección deseable. Finalmente, la aguja se hundió en la yema del embrión y el morfolino o ARNm es expulsado.

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Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function

Este vídeo muestra cómo morfolino o ARNm puede ser inyectado en embriones de pez cebra en el estadio de una célula para aumentar o disminuir el nivel de productos específicos de genes durante el desarrollo posterior.

Microinyección de embriones de pez cebra para analizar la función génica

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic ...

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Research

JoVE Journal

Biology

77.1K vistas.  Harvard Medical School. Este vídeo muestra cómo morfolino o ARNm puede ser inyectado en embriones de pez cebra en el estadio de una célula para aumentar o disminuir el nivel de productos específicos de genes durante el desarrollo posterior.

Video: Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function

Microinjection of A. aegypti Embryos to Obtain Transgenic Mosquitoes

In this video, Nijole Jasinskiene demonstrates the methodology employed to generate transgenic Aedes aegypti mosquitoes, which are vectors for dengue fever.  The techniques for correctly preparing microinjection needles, dessicating embryos, and performing microinjection are demonstrated.

In this video, Nijole Jasinskiene demonstrates the methodology employed to generate transgenic Aedes aegypti mosquitoes, which are vectors for dengue fever. The techniques for correctly preparing microinjection needles, dessicating embryos, and performing microinjection are demonstrated.

Microinyección de A. aegypti embriones para obtener los mosquitos transgénicos

In this video, Nijole Jasinskiene demonstrates the methodology employed to generate transgenic Aedes aegypti mosquitoes, which are vectors for dengue ...

Investigación

Biología

Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression studies. In zebrafish (Danio rerio), microinjection of RNA, DNA, proteins, antisense oligonucleotides and other small molecules into the developing embryo provides researchers a quick and robust assay for exploring gene function in vivo. In this video-article, we will demonstrate how to prepare and microinject in vitro synthesized EGFP mRNA and a translational-blocking morpholino oligo against pkd2, a gene associated with autosomal dominant polycystic kidney disease (ADPKD), into 1-cell stage zebrafish embryos. We will then analyze the success of the mRNA and morpholino microinjections by verifying GFP expression and phenotype analysis. Broad applications of this technique include generating transgenic animals and germ-line chimeras, cell-fate mapping and gene screening. Herein we describe a protocol for overexpression of EGFP and knockdown of pkd2 by mRNA and morpholino oligonucleotide injection.

Microinjection is a well-established and effective method for introducing foreign substances into fertilized zebrafish embryos. Here, we demonstrate a robust microinjection technique for performing mRNA overexpression, and morpholino oligonucleotide gene knockdown studies in zebrafish.

Microinyección de ARNm y oligonucleótidos antisentido Morpholino en embriones de pez cebra.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression ...

Generating Chimeric Zebrafish Embryos by Transplantation

One of the most powerful tools used to gain insight into complex developmental processes is the analysis of chimeric embryos. A chimera is defined as an organism that contains cells from more than one animal; mosaics are one type of chimera in which cells from more than one genotype are mixed, usually wild-type and mutant. In the zebrafish, chimeras can be readily made by transplantation of cells from a donor embryo into a host embryo at the appropriate embryonic stage. Labeled donor cells are generated by injection of a lineage marker, such as a fluorescent dye, into the one-cell stage embryo. Labeled donor cells are removed from donor embryos and introduced into unlabeled host embryos using an oil-controlled glass pipette mounted on either a compound or dissecting microscope. Donor cells can in some cases be targeted to a specific region or tissue of the developing blastula or gastrula stage host embryo by choosing a transplantation site in the host embryo based on well-established fate maps.

A step-by-step guide to generating targeted chimeric zebrafish embryos by transplantation at the blastula or gastrula stage.

La generación de embriones quiméricos de pez cebra mediante un trasplante

One of the most powerful tools used to gain insight into complex developmental processes is the analysis of chimeric embryos. A chimera is defined as an ...

Using the optokinetic response to study visual function of zebrafish

Optokinetic response (OKR) is a behavior that an animal vibrates its eyes to follow a rotating grating around it. It has been widely used to assess the visual functions of larval zebrafish1-5. Nevertheless, the standard protocol for larval fish is not yet readily applicable in adult zabrafish. Here, we introduce how to measure the OKR of adult zebrafish with our simple custom-built apparatus using a new protocol which is established in our lab. Both our apparatus and step-by-step procedure of OKR in adult zebrafish are illustrated in this video. In addition, the measurements of the larval OKR, as well as the optomotor response (OMR) test of adult zebrafish, are also demonstrated in this video. This OKR assay of adult zebrafish in our experiment may last for up to 4 hours. Such OKR test applied in adult fish will benefit to visual function investigation more efficiently when the adult fish vision system is manipulated.
Su-Qi Zou and Wu Yin contributed equally to this paper.

Optokinetic response has been widely used to assess the visual functions of larval zebrafish. Nevertheless, the standard protocol for larval fish is not yet readily applicable in adults1-5. Here, we introduce how to measure the OKR of adult zebrafish using a new protocol which is established in our lab.

Usando la respuesta de optocinético para estudiar la función visual del pez cebra

Optokinetic response (OKR) is a behavior that an animal vibrates its eyes to follow a rotating grating around it. It has been widely used to assess the ...

Microinjection of Medaka Embryos for use as a Model Genetic Organism

In this video, we demonstrate the technique of microinjection into one-cell stage medaka embryos. Medaka is a small egg-laying freshwater fish that allows both genetic and embryological analyses and is one of the vertebrate model organisms in which genome-wide phenotype-driven mutant screens were carried out 1, as in zebrafish and the mouse. Divergence of functional overlap of related genes between medaka and zebrafish allows identification of novel phenotypes that are unidentifiable in a single species 2, thus medaka and zebrafish are complementary for genetic dissection of vertebrate genome functions.
To take advantage of medaka fish whose embryos are transparent and develop externally, microinjection is an essential technique to inject cell-tracers for labeling cells, mRNAs or anti-sense oligonucleotides for over-expressing and knocking-down genes of interest, and DNAs for making transgenic lines.

Medaka and zebrafish are complementary for genetic dissection of vertebrate genome functions. This protocol highlights the key points for successful microinjection into medaka embryos, an important technique for embryological and genetic analysis using medaka and zebrafish in a laboratory.

Microinyección de embriones de medaka para su uso como un organismo modelo genético

In this video, we demonstrate the technique of microinjection into one-cell stage medaka embryos. Medaka is a small egg-laying freshwater fish that allows ...

Metabolic Profile Analysis of Zebrafish Embryos

A growing goal in the field of metabolism is to determine the impact of genetics on different aspects of mitochondrial function. Understanding these relationships will help to understand the underlying etiology for a range of diseases linked with mitochondrial dysfunction, such as diabetes and obesity. Recent advances in instrumentation, has enabled the monitoring of distinct parameters of mitochondrial function in cell lines or tissue explants. Here we present a method for a rapid and sensitive analysis of mitochondrial function parameters in vivo during zebrafish embryonic development using the Seahorse bioscience XF 24 extracellular flux analyser. This protocol utilizes the Islet Capture microplates where a single embryo is placed in each well, allowing measurement of bioenergetics, including: (i) basal respiration; (ii) basal mitochondrial respiration (iii) mitochondrial respiration due to ATP turnover; (iv) mitochondrial uncoupled respiration or proton leak and (iv) maximum respiration. Using this approach embryonic zebrafish respiration parameters can be compared between wild type and genetically altered embryos (mutant, gene over-expression or gene knockdown) or those manipulated pharmacologically. It is anticipated that dissemination of this protocol will provide researchers with new tools to analyse the genetic basis of metabolic disorders in vivo in this relevant vertebrate animal model.

Zebrafish represent a powerful vertebrate model that has been under-utilised for metabolic studies. Here we describe a rapid way to measure the in vivo metabolic profile of developing zebrafish that allows the comparison of different mitochondrial function parameters between genetically or pharmacologically manipulated embryos, thereby increasing the applicability of this organism.

Análisis del perfil metabólico de embriones de pez cebra

A growing goal in the field of metabolism is to determine the impact of genetics on different aspects of mitochondrial function. Understanding these ...

Gene Trapping Using Gal4 in Zebrafish

Large clutch size and external development of optically transparent embryos make zebrafish an exceptional vertebrate model system for in vivo insertional mutagenesis using fluorescent reporters to tag expression of mutated genes. Several laboratories have constructed and tested enhancer- and gene-trap vectors in zebrafish, using fluorescent proteins, Gal4- and lexA- based transcriptional activators as reporters 1-7. These vectors had two potential drawbacks: suboptimal stringency (e.g. lack of ability to differentiate between enhancer- and gene-trap events) and low mutagenicity (e.g. integrations into genes rarely produced null alleles). Gene Breaking Transposon (GBTs) were developed to address these drawbacks 8-10. We have modified one of the first GBT vectors, GBT-R15, for use with Gal4-VP16 as the primary gene trap reporter and added UAS:eGFP as the secondary reporter for direct detection of gene trap events. Application of Gal4-VP16 as the primary gene trap reporter provides two main advantages. First, it increases sensitivity for genes expressed at low expression levels. Second, it enables researchers to use gene trap lines as Gal4 drivers to direct expression of other transgenes in very specific tissues. This is especially pertinent for genes with non-essential or redundant functions, where gene trap integration may not result in overt phenotypes. The disadvantage of using Gal4-VP16 as the primary gene trap reporter is that genes coding for proteins with N-terminal signal sequences are not amenable to trapping, as the resulting Gal4-VP16 fusion proteins are unlikely to be able to enter the nucleus and activate transcription. Importantly, the use of Gal4-VP16 does not pre-select for nuclear proteins: we recovered gene trap mutations in genes encoding proteins which function in the nucleus, the cytoplasm and the plasma membrane.

This protocol describes the method of gene trap insertional mutagenesis using Gal4-VP16 as the primary reporter and GFP/RFP as secondary reporters in zebrafish. Approximately one in ten high-expressing F0 fish yield gene trap progeny co-expressing GFP and RFP. The screening procedure can be readily scaled to adapt to the size of the laboratory performing the insertional mutagenesis screen.

Gene reventado Usando Gal4 en pez cebra

Large clutch size and external development of optically transparent embryos make zebrafish an exceptional vertebrate model system for in vivo insertional ...

Force Measurement During Contraction to Assess Muscle Function in Zebrafish Larvae

Zebrafish larvae provide models of muscle development, muscle disease and muscle-related chemical toxicity, but related studies often lack functional measures of muscle health. In this video article, we demonstrate a method to measure force generation during contraction of zebrafish larval trunk muscle. Force measurements are accomplished by placing an anesthetized larva into a chamber filled with a salt solution. The anterior end of the larva is tied to a force transducer and the posterior end of the larva is tied to a length controller. An isometric twitch contraction is elicited by electric field stimulation and the force response is recorded for analysis. Force generation during contraction provides a measure of overall muscle health and specifically provides a measure of muscle function. Although we describe this technique for use with wild-type larvae, this method can be used with genetically modified larvae or with larvae treated with drugs or toxicants, to characterize muscle disease models and evaluate treatments, or to study muscle development, injury, or chemical toxicity.

Force measurements can be used to demonstrate changes in muscle function due to development, injury, disease, treatment or chemical toxicity. In this video, we demonstrate a method to measure force during a maximal contraction of zebrafish larval trunk muscle.

Medición de fuerza durante la contracción para evaluar la función muscular en larvas de pez cebra

Zebrafish larvae provide models of muscle development, muscle disease and muscle-related chemical toxicity, but related studies often lack functional ...

High Resolution Whole Mount In Situ Hybridization within Zebrafish Embryos to Study Gene Expression and Function

This article focuses on whole-mount in situ hybridization (WISH) of zebrafish embryos. The WISH technology facilitates the assessment of gene expression both in terms of tissue distribution and developmental stage. Protocols are described for the use of WISH of zebrafish embryos using antisense RNA probes labeled with digoxigenin. Probes are generated by incorporating digoxigenin-linked nucleotides through in vitro transcription of gene templates that have been cloned and linearized. The chorions of embryos harvested at defined developmental stages are removed before incubation with specific probes. Following a washing procedure to remove excess probe, embryos are incubated with anti-digoxigenin antibody conjugated with alkaline phosphatase. By employing a chromogenic substrate for alkaline phosphatase, specific gene expression can be assessed. Depending on the level of gene expression the entire procedure can be completed within 2-3 days.

High Resolution Whole Mount In Situ Hybridization within Zebrafish Embryos to Study Gene Expression and Function

The zebrafish, a small tropical fish, has become a popular model for studying gene function during vertebrate development and disease. The temporal and spatial expression of target genes can be determined by in situ hybridization. Our improved protocol allows for the detection of low abundant transcripts with low non-specific background signal.

Alta resolución todo el montaje de<em&gt; In Situ</em&gt; La hibridación en embriones de pez cebra para estudiar la expresión génica y la función

This article focuses on whole-mount in situ hybridization (WISH) of zebrafish embryos. The WISH technology facilitates the assessment of gene expression ...

Analysis of Apoptosis in Zebrafish Embryos by Whole-mount Immunofluorescence to Detect Activated Caspase 3

Whole-mount immunofluorescence to detect activated Caspase 3 (Casp3 assay) is useful to identify cells undergoing either intrinsic or extrinsic apoptosis in zebrafish embryos. The whole-mount analysis provides spatial information in regard to tissue specificity of apoptosing cells, although sectioning and/or colabeling is ultimately required to pinpoint the exact cell types undergoing apoptosis. The whole-mount Casp3 assay is optimized for analysis of fixed embryos between the 4-cell stage and 32 hr-post-fertilization and is useful for a number of applications, including analysis of zebrafish mutants and morphants, overexpression of mutant and wild-type mRNAs, and exposure to chemicals. Compared to acridine orange staining, which can identify apoptotic cells in live embryos in a matter of hours, Casp3 and TUNEL assays take considerably longer to complete (2-4 days). However, because of the dynamic nature of apoptotic cell formation and clearance, analysis of fixed embryos ensures accurate comparison of apoptotic cells across multiple samples at specific time points. We have also found the Casp3 assay to be superior to analysis of apoptotic cells by the whole-mount TUNEL assay in regard to cost and reliability. Overall, the Casp3 assay represents a robust, highly reproducible assay in which to analyze apoptotic cells in early zebrafish embryos.

Certain genetic perturbations or exposure to toxins can disrupt normal developmental processes leading to death of specific cell types. The analysis of activated Caspase 3 by whole-mount immunofluorescence in zebrafish embryos reveals stage- and tissue-specific localization of cells specifically undergoing apoptosis.

Análisis de la apoptosis en embriones de pez cebra en Todo el montaje de inmunofluorescencia para detectar la caspasa 3 activada

Whole-mount immunofluorescence to detect activated Caspase 3 (Casp3 assay) is useful to identify cells undergoing either intrinsic or extrinsic apoptosis ...