Name: microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function
Uploaded: 2009-03-09T00:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 18 s
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Somos conscientes de los miembros del laboratorio de Mably y Storer Narie por su asistencia técnica, y la Asociación Americana del Corazón (NCRP Desarrollo Científico subvención 0635363N) y el National Heart, Lung, and Blood Institute (Grant SCCOR RFA HL02-027) para su financiación.

Parte 1: La producción de huevos y la recolección <ol><li> La noche antes de la inyección, coloque el pescado en la cría de los tanques con divisiones en su lugar. Para aumentar la producción total de huevos, el pescado se puede configurar en una proporción de dos mujeres a un hombre si así lo desea. </li><li> A la mañana siguiente, después de la luces de la habitación a su vez, tire los divisores de varios tanques y permitir que durante unos 20 minutos de tiempo de apareamiento sin ser molestados. </li><li> Utilizando un colador, recoger los huevos de las jaulas de cría y enjuague con agua de huevo. Vierta los huevos en un plato Petri con agua de huevo y remover los óvulos no fertilizados y los escombros con una pipeta de transferencia. Los peces pueden ser reagrupados en grandes tanques para producir nuevas rondas de huevos para la inyección. Ajustar el tiempo de la recolección de huevos para permitir el máximo número de huevos que se producen, sin dejar pasar la etapa unicelular. </li><li> Colocar un portaobjetos en la tapa invertida de una placa de Petri de 100 mm. Use una pipeta de transferencia a la línea de los huevos contra el lado de la diapositiva que forman una sola columna. Eliminar el agua sobrante del huevo de diapositivas pulsando un Kimwipe contra el lado opuesto de los huevos. (Figura 1) </li></ol> Parte 2: la aguja de tracción, de carga, y la preparación <ol><li> Con un extractor de micropipeta, tirar de un vidrio de 1,0 mm OD capilar en dos agujas y guárdelo en un plato de Petri de 150 mm mediante la fijación sobre las rampas de plastilina. Las agujas se puede tirar de antemano. </li><li> Retrocarga la aguja con 3 l de material de inyección con una pipeta microloader. Agite bien el bolo hacia la punta de la aguja hasta que no haya burbujas de pocos o ningún resto. </li><li> Encienda la fuente de aire y microinyector. Insertar la aguja en el microinyector y asegurar un sello hermético en la vivienda. Compruebe que el micromanipulador se encuentra en una posición adecuada para permitir una amplia gama de movimiento y ajuste. Llevar la punta de la aguja en el plano de visión del microscopio de alta del escenario, y se centran en el más delgado de la región de la punta. Use un par de pinzas para apretar fuerte de la aguja en un punto que deja la aguja lo suficientemente estrecha como para perforar el corion y la yema, pero todavía capaz de ofrecer un tamaño de grano uniforme. Una gota de aceite mineral en un micrómetro puede utilizarse para calcular el volumen de cada inyección. Cuando se inyecta en el aceite, un cordón con un diámetro de 0,1 mm contiene 500 pL de material de inyección (figura 1B), los volúmenes de inyección de 500 pL o 1NL se utilizan normalmente. Pise el pedal y controlar el tamaño del grano, mientras que el recorte de la aguja y el ajuste de la presión de inyección, según sea necesario. Ideal volúmenes de inyección llenará aproximadamente el 10% del volumen del huevo. La calidad de la punta de la aguja es crucial tanto para la facilidad de la inyección y la calidad y la consistencia de los resultados. </li></ol> Parte 3: Inyección <ol><li> Asegúrese de que los embriones no se han desarrollado más allá de la etapa de cuatro células. Idealmente, los embriones debe estar en el estadio de una célula. </li><li> Baje la aguja hacia la columna de los huevos, la celebración de la antena en su lugar con la mano opuesta. </li><li> Perforar la superficie del corion y entrar en la yema de un solo golpe suave, mientras que la observación de cualquier aplastamiento o rotura de la vesícula vitelina. Inyectar el material de inyección en la yema (figura 1C). Evitar la inyección de burbujas de aire o estiramiento de la yema, como puede ser letal para el embrión. Trabajando en la línea, ajustar la presión según sea necesario para mantener un tamaño uniforme de cuentas y, con una punta de la pipeta, retirar los huevos no fertilizados que se ven o se destruyen durante el proceso de inyección. </li><li> Después de completar una columna de huevos, use un chorro suave de agua de huevos para mover los huevos se inyecta en una placa de Petri limpia. Repita según sea necesario. Mantener varios embriones inyectados como un control. Al final del día, eliminar embriones muertos y registrar el número de embriones inyectados. Cambie el agua de huevo en el plato de forma periódica para reducir el riesgo de infección. </li></ol> Parte 4: Los resultados representativos Dependiendo de lo que se está inyectando, los embriones pueden sobrevivir a un ritmo menor que sus hermanos no inyectadas. Afortunadamente, es fácil de inyectar un gran número de ellos, así que esto es raramente un problema. Es normal que morphants para exponer el desarrollo de un ligero retraso. Para ilustrar los resultados de la microinyección, hemos utilizado este protocolo para manipular los niveles de la proteína del Corazón de cristal (HEG). HEG es una proteína transmembrana necesaria para el desarrollo normal del corazón. En su ausencia, se desarrollan los embriones corazones con tractos de entrada gigantes y cámaras de 1. Hemos inyectado dos morfolinos no descrita con anterioridad en contra de HEG, heg_e3i3_egfr1 y heg_e4i4_egfr2, a una concentración de 500 mM. A los 2 días después de la fecundación, los controles no inyectados hermano parece normal, como se esperaba (Figura 2A y B). Embriones inyectados con heg_e3i3_egfr1 tiene edema cerebral (figura 2C). Aunque los corazones de la mayoría de estos morphants han alterado la morfología, las cámaras son de tamaño normal (Figura 2). Embriones inyectadosheg_e4i4_egfr2 con defectos cardíacos presentan variables. Algunos parecen normales, mientras que otros tienen grandes extensiones de entrada y atrios moderadamente grande (Figura 2 E y F). El mutante HEG, como se informó anteriormente 1, tiene un tracto de entrada enormemente ampliada y la aurícula (Figura 2 G y H). También inyecta embriones de tipo salvaje con 400 ARNm ng / l transcribe a partir de larga duración HEG cDNA. Mientras que los controles no inyectados se desarrollan normalmente (figura 3 A y B), los embriones inyectados con ARNm HEG muestran un espectro de fenotipos que van desde la apariencia de tipo salvaje de ciclopía severa, acortamiento del eje del cuerpo principal, la necrosis de la cabeza y el cuerpo, y los defectos de la línea media (figura 3C y D). <img src="/files/ftp_upload/1115/Figure%201%20FINAL.png" alt="" /> Los embriones Figura 1. Que se inyecta se alinean en contra de un portaobjetos de microscopio en una placa de Petri (A). El volumen de inyección se determina mediante la inyección en aceite mineral colocado en un micrómetro. Un volumen de inyección de 500 pL, que se usa comúnmente, tiene un diámetro de 0,1 mm (B). Inmediatamente después de la inyección, el morfolino o ARNm es visible como un punto de puntuar en la yema (C). <img src="/files/ftp_upload/1115/Figure%202%20FINAL.png" alt="" /> Figura 2. A los 2 días después de la fecundación, los embriones inyectados no tienen defectos graves (A) o fenotipo cardíaco (B). Embriones inyectados con la heg_e3i3_egfr1 morfolino tiene edema cerebral (C, flecha), pero las cámaras del corazón de tamaño normal (D). Algunos embriones inyectados con la heg_e4i4_egfr2 morfolino tienen tractos ampliada de entrada y atrios (E, F). HEG mutantes tienen tractos de entrada graves ampliada y en los atrios (G, H). (A), (C), (E) y (G) son 4x imágenes DIC; (B), (D), (F) y (H) es de 20x imágenes DIC. un atrio =, que = tracto de entrada. <img src="/files/ftp_upload/1115/Figure%203%20FINAL.png" alt="" /> Figura 3. A las 24 horas posteriores a la fecundación, los embriones inyectados tienen un cuerpo largo y recto sin defectos necrosis o la línea media (A) y dos ojos claramente definidos, con un tubo neural entre ellos (B). Algunos embriones inyectados con ARNm HEG, en cambio, presentan un eje corporal reducido, necrosis, somitas deformado (C) y ciclopía (D). (A) y (C) son 4x imágenes DIC; (B) y (D) es de 20x imágenes DIC.

<ol>
	<li>Mably, J. D., Mohideen, M. P. K., Burns, C. G., Chen, J., Fishman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=heart+of+glass+regulates+the+concentric+growth+of+the+heart+in+zebrafish.">heart of glass regulates the concentric growth of the heart in zebrafish.</a> Curr. Biol. 13, 2138-2147 (2003).</li></ol>

Una de las fortalezas del sistema de modelo de pez cebra es la facilidad con que los productos de genes específicos puede ser añadido o eliminado del embrión mediante microinyección. Para doquier sobreexpresan una proteína en particular, el mRNA se inyecta en la yema de huevo en la etapa 1 de las células. Durante el desarrollo posterior del embrión, el ARN se distribuye por todo el organismo y traducido. Por el contrario, para eliminar una proteína en particular, morfolinos se utilizan. Morfolinos son oligonucleótidos sintéticos diseñados con la complementariedad de los ARN antisentido específicos. Al igual que los ARNm, morfolinos son inyectados en la yema de huevo en la etapa 1 de las células. Dentro del embrión, que se unen a sus ARNs dianas, la prevención de la traducción. La principal modificación que debe hacerse para cada morfolino o ARNm es la concentración de material inyectado. Una concentración demasiado alta de cualquiera de morfolino o ARNm no puede causar la toxicidad específica, mientras que cada morfolino debe ser probado empíricamente para determinar su concentración óptima, generalmente entre las concentraciones de morfolino 200 M y M 500 derribar actividad de los genes con eficacia sin causar defectos no específicos. El tamaño exacto de la abertura de la aguja no es crucial. Dentro de un rango de tamaños de aguja, la presión de inyección y el tiempo de inyección se puede ajustar para producir un bolo del volumen correcto. Morfolinos tienen muchas aplicaciones, incluyendo la disección funcional de los dominios de una proteína. Cuando estén diseñados para destinatarios específicos exón-intrón cruces, morfolinos evitará el empalme que se produzcan allí. Hemos examinado los efectos de dos morfolinos que se unen los exones e intrones cruces en el pre-ARNm de HEG. El heg_e3i3_egfr1 morfolino une la unión entre el exón 3 y el intrón 3, la prevención de la maquinaria de empalme de la incorporación de exón 3 en transcripciones de madurez. El heg_e4i4_egfr2 morfolino similar elimina el exón 4. Tanto los exones 3 y 4 de codificar los dominios que contienen EGF-como repite. Algunos embriones inyectados con heg_e4i4_egfr2 moderadamente fenocopia el mutante más experimentos serán necesarios para comprender el papel de HEG exón 4 en el desarrollo del corazón. Sorprendentemente, los embriones inyectados con heg_e3i3_egfr1 tiene edema cerebral, una característica que no se ve en los mutantes HEG. Esto puede ser debido a la capacidad de morfolinos para obligar a la madre que las transcripciones no se verían afectadas en los mutantes cigóticos.

<table><tbody><tr><td>Microinjector</td><td>Tool</td><td>Harvard Apparatus</td><td>PLI 100</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>Tool</td><td>Narishige International</td><td>MN 153</td><td></td></tr><tr><td>Needle Puller</td><td>Tool</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P 97</td><td></td></tr><tr><td>Glass Capillaries</td><td>Tool</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>TW100 F6</td><td></td></tr><tr><td>Microloader Pipettes</td><td>Tool</td><td>Eppendorf</td><td>5242956.003</td><td></td></tr><tr><td>Needle Holder</td><td>Tool</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>MPH310</td><td></td></tr></tbody></table>

microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function

Una de las ventajas del pez cebra el estudio es la facilidad y la velocidad de la manipulación de los niveles de proteína en el embrión. Morfolinos, que son oligonucleótidos sintéticos con la complementariedad de los ARN antisentido objetivo, se puede agregar a los embriones para reducir la expresión de un producto genético particular. Por el contrario, el ARNm procesado se puede agregar a los embriones para aumentar los niveles de un producto genético. El vehículo para incorporar el uso de ARNm o morfolino a un embrión es la microinyección. Microinyección es eficiente y rápida, lo que permite la inyección de cientos de embriones por hora. Este video muestra todos los pasos necesarios para la microinyección. En pocas palabras, los huevos son recogidos inmediatamente después de ser despedido y se alinearon en contra de un portaobjetos de microscopio en una placa de Petri. A continuación, una aguja de punta fina cargados con material de inyección está conectado a un microinyector y una fuente de aire, y los controles microinyector se ajustan para producir un volumen de inyección deseable. Finalmente, la aguja se hundió en la yema del embrión y el morfolino o ARNm es expulsado.

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Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function

Este vídeo muestra cómo morfolino o ARNm puede ser inyectado en embriones de pez cebra en el estadio de una célula para aumentar o disminuir el nivel de productos específicos de genes durante el desarrollo posterior.

Microinyección de embriones de pez cebra para analizar la función génica

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic ...

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Research

JoVE Journal

Biology

77.3K vistas.  Harvard Medical School. Este vídeo muestra cómo morfolino o ARNm puede ser inyectado en embriones de pez cebra en el estadio de una célula para aumentar o disminuir el nivel de productos específicos de genes durante el desarrollo posterior.

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Labeling and Imaging Cells in the Zebrafish Hindbrain

Key to understanding the morphogenetic processes that shape the early vertebrate embryo is the ability to image cells at high resolution. In zebrafish embryos, injection of plasmid DNA results in mosaic expression, allowing for the visualization of single cells or small clusters of cells 1 . We describe how injection of plasmid DNA encoding membrane-targeted Green Fluorescent Protein (mGFP) under the control of a ubiquitous promoter can be used for imaging cells undergoing neurulation. Central to this protocol is the methodology for imaging labeled cells at high resolution in sections and also in real time. This protocol entails the injection of mGFP DNA into young zebrafish embryos. Embryos are then processed for vibratome sectioning, antibody labeling and imaging with a confocal microscope. Alternatively, live embryos expressing mGFP can be imaged using time-lapse confocal microscopy. We have previously used this straightforward approach to analyze the cellular behaviors that drive neural tube formation in the hindbrain region of zebrafish embryos 2. The fixed preparations allowed for unprecedented visualization of cell shapes and organization in the neural tube while live imaging complemented this approach enabling a better understanding of the cellular dynamics that take place during neurulation.

Key to understanding the morphogenetic processes that shape the early embryo is the ability to image cells at high resolution. We describe here a technique for labeling single cells or small clusters of cells in whole zebrafish embryos with membrane-targeted Green Fluorescent Protein.

Etiquetado y las Pilas de imágenes en la parte posterior del cerebro de pez cebra

Key to understanding the morphogenetic processes that shape the early vertebrate embryo is the ability to image cells at high resolution. In zebrafish ...

Investigación

Neurociencias

Microbead Implantation in the Zebrafish Embryo

The zebrafish has emerged as a valuable genetic model system for the study of developmental biology and disease. Zebrafish share a high degree of genomic conservation, as well as similarities in cellular, molecular, and physiological processes, with other vertebrates including humans. During early ontogeny, zebrafish embryos are optically transparent, allowing researchers to visualize the dynamics of organogenesis using a simple stereomicroscope. Microbead implantation is a method that enables tissue manipulation through the alteration of factors in local environments. This allows researchers to assay the effects of any number of signaling molecules of interest, such as secreted peptides, at specific spatial and temporal points within the developing embryo. Here, we detail a protocol for how to manipulate and implant beads during early zebrafish development.

The zebrafish is an excellent model system for genetic and developmental studies. Bead implantation is a valuable tissue manipulation technique that can be used to interrogate developmental mechanisms by introducing alterations in local cellular environments. This protocol describes how to perform microbead implantation in the zebrafish embryo.

Microbead Implantación en el embrión de pez cebra

The zebrafish has emerged as a valuable genetic model system for the study of developmental biology and disease. Zebrafish share a high degree of genomic ...

Biología del Desarrollo

Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression studies. In zebrafish (Danio rerio), microinjection of RNA, DNA, proteins, antisense oligonucleotides and other small molecules into the developing embryo provides researchers a quick and robust assay for exploring gene function in vivo. In this video-article, we will demonstrate how to prepare and microinject in vitro synthesized EGFP mRNA and a translational-blocking morpholino oligo against pkd2, a gene associated with autosomal dominant polycystic kidney disease (ADPKD), into 1-cell stage zebrafish embryos. We will then analyze the success of the mRNA and morpholino microinjections by verifying GFP expression and phenotype analysis. Broad applications of this technique include generating transgenic animals and germ-line chimeras, cell-fate mapping and gene screening. Herein we describe a protocol for overexpression of EGFP and knockdown of pkd2 by mRNA and morpholino oligonucleotide injection.

Microinjection is a well-established and effective method for introducing foreign substances into fertilized zebrafish embryos. Here, we demonstrate a robust microinjection technique for performing mRNA overexpression, and morpholino oligonucleotide gene knockdown studies in zebrafish.

Microinyección de ARNm y oligonucleótidos antisentido Morpholino en embriones de pez cebra.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression ...

Biología

Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the developing zebrafish brain (Gutzman et al, 2008). Such analysis affords a new understanding of the underlying cell biology required for development of the 3D structure of the vertebrate brain, and significantly increases our ability to study neural tube morphogenesis. The embryonic zebrafish brain is shaped beginning at 18 hours post fertilization (hpf) as the ventricles within the neuroepithelium inflate. By 24 hpf, the initial steps of neural tube morphogenesis are complete. Using the method described here, embryos at the one cell stage are injected with mRNA encoding membrane-targeted green fluorescent protein (memGFP). After injection and incubation, the embryo, now between 18 and 24 hpf, is mounted, inverted, in agarose and imaged by confocal microscopy. Notably, the zebrafish embryo is transparent making it an ideal system for fluorescent imaging. While our analyses have focused on the midbrain-hindbrain boundary and the hindbrain, this method could be extended for analysis of any region in the zebrafish to a depth of 
80-100 &mu;m.

In this video, we demonstrate a method by which to analyze the developing vertebrate brain in live zebrafish embryos at single cell resolution by confocal microscopy. This includes the method by which we inject the single-cell zebrafish embryo and subsequently mount and image the developing brain.

Imágenes en vivo del cerebro del embrión de pez cebra mediante microscopía confocal

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the ...

Micromanipulation of Gene Expression in the Adult Zebrafish Brain Using Cerebroventricular Microinjection of Morpholino Oligonucleotides

Manipulation of gene expression in tissues is required to perform functional studies. In this paper, we demonstrate the cerebroventricular microinjection (CVMI) technique as a means to modulate gene expression in the adult zebrafish brain. By using CVMI, substances can be administered into the cerebroventricular fluid and be thoroughly distributed along the rostrocaudal axis of the brain. We particularly focus on the use of antisense morpholino oligonucleotides, which are potent tools for knocking down gene expression in vivo. In our method, when applied, morpholino molecules are taken up by the cells lining the ventricular surface. These cells include the radial glial cells, which act as neurogenic progenitors. Therefore, knocking down gene expression in the radial glial cells is of utmost importance to analyze the widespread neurogenesis response in zebrafish, and also would provide insight into how vertebrates could sustain adult neurogenesis response. Such an understanding would also help the efforts for clinical applications in human neurodegenerative disorders and central nervous system regeneration. Thus, we present the cerebroventricular microinjection method as a quick and efficient way to alter gene expression and neurogenesis response in the adult zebrafish forebrain. We also provide troubleshooting tips and other useful information on how to carry out the CVMI procedure.

In this article, we demonstrate a method for manipulation of gene expression in the ventricular cells of the adult zebrafish telencephalon using antisense morpholino oligonucleotides. We present this method as an efficient and quick protocol that can be used for functional studies in the adult vertebrate brain.

Micromanipulación de la expresión génica en el cerebro de pez cebra adulto Uso Microinyección cerebroventricular de oligonucleótidos Morpholino

Manipulation of gene expression in tissues is  required to perform functional studies. In this paper, we demonstrate the  cerebroventricular ...

Design and Microinjection of Morpholino Antisense Oligonucleotides and mRNA into Zebrafish Embryos to Elucidate Specific Gene Function in Heart Development

The morpholino oligomer-based knockdown system has been used to identify the function of various gene products through loss or reduced expression. Morpholinos (MOs) have the advantage in biological stability over DNA oligos because they are not susceptible to enzymatic degradation. For optimal effectiveness, MOs are injected into 1-4 cell stage embryos. The temporal efficacy of knockdown is variable, but MOs are believed to lose their effects due to dilution eventually. Morpholino dilution and injection amount should be closely controlled to minimize the occurrence of off-target effects while maintaining on-target efficacy. Additional complementary tools, such as CRISPR/Cas9 should be performed against the target gene of interest to generate mutant lines and to confirm the morphant phenotype with these lines. This article will demonstrate how to design, prepare, and microinject a translation-blocking morpholino against hand2 into the yolk of 1-4 cell stage zebrafish embryos to knockdown hand2 function and rescue these "morphants" by co-injection of mRNA encoding the corresponding cDNA. Subsequently, the efficacy of the morpholino microinjections is assessed by first verifying the presence of morpholino in the yolk (co-injected with phenol red) and then by phenotypic analysis. Moreover, cardiac functional analysis to test for knockdown efficacy will be discussed. Finally, assessing the effect of morpholino-induced blockage of gene translation via western blotting will be explained.

The present protocol describes designing, preparing, and microinjecting a translational-blocking morpholino against a representative cardiac gene; Heart And Neural Crest Derivatives Expressed2 (hand2) into the yolk of newly fertilized zebrafish embryos to knock down gene function. It also shows a transient rescue of these "morphants" by co-injection of mRNA encoding this gene product.

The morpholino oligomer-based knockdown system has been used to identify the function of various gene products through loss or reduced expression.  ...

Live Imaging of Cell Extrusion from the Epidermis of Developing Zebrafish

Homeostatic maintenance of epithelial tissues requires the continual removal of damaged cells without disrupting barrier function. Our studies have found that dying cells send signals to their live neighbors to form and contract a ring of actin and myosin that ejects it out from the epithelial sheet while closing any gaps that might have resulted from its exit, a process termed cell extrusion1. The optical clarity of developing zebrafish provides an excellent system to visualize extrusion in living epithelia. Here we describe a method to induce and image extrusion in the larval zebrafish epidermis. To visualize extrusion, we inject a red fluorescent protein labeled probe for F-actin into one-cell stage transgenic zebrafish embryos expressing green fluorescent protein in the epidermis and induce apoptosis by addition of G418 to larvae. We then use time-lapse imaging on a spinning disc confocal microscope to observe actin dynamics and epithelial cell behaviors during the process of apoptotic cell extrusion. This approach allows us to investigate the extrusion process in live epithelia and will provide an avenue to study disease states caused by the failure to eliminate apoptotic cells.

Dying cells are extruded from epithelial tissues by concerted contraction of neighboring cells without disrupting barrier function. The optical clarity of developing zebrafish provides an excellent system to visualize extrusion in living epithelia. Here we describe methods to induce and image extrusion in the larval zebrafish epidermis at cellular resolution.

Imágenes en directo de extrusión celular de la epidermis del pez cebra en desarrollo

Homeostatic maintenance of epithelial tissues requires the continual removal of damaged cells without disrupting barrier function.  Our studies have found ...

An Efficient Protocol to Assess ERK Activity Modulation in Early Zebrafish Noonan Syndrome Models via Live FRET Microscopy and Immunofluorescence

RASopathies are genetic syndromes caused by ERK hyperactivation and resulting in multisystemic diseases that can also lead to cancer predisposition. Despite a broad genetic heterogeneity, germline gain-of-function mutations in key regulators of the RAS-MAPK pathway underlie the majority of the cases, and, thanks to advanced sequencing techniques, potentially pathogenic variants affecting the RAS-MAPK pathway continue to be identified. Functional validation of the pathogenicity of these variants, essential for accurate diagnosis, requires fast and reliable protocols, preferably in vivo. Given the scarcity of effective treatments in early childhood, such protocols, especially if scalable in cost-effective animal models, can be instrumental in offering a preclinical ground for drug repositioning/repurposing. 
Here we describe step-by-step the protocol for rapid generation of transient RASopathy models in zebrafish embryos and direct inspection of live disease-associated ERK activity changes occurring already during gastrulation through real-time multispectral F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) imaging. The protocol uses a transgenic ERK reporter recently established and integrated with the hardware of commercial microscopes. We provide an example application for Noonan syndrome (NS) zebrafish models obtained by expression of the Shp2D61G. We describe a straightforward method that enables registration of ERK signal change in the NS fish model before and after pharmacological signal modulation by available low-dose MEK inhibitors. We detail how to generate, retrieve, and assess ratiometric FRET signals from multispectral acquisitions before and after treatment and how to cross-validate the results via classical immunofluorescence on whole embryos at early stages. We then describe how, via examining standard morphometric parameters, to query late changes in embryo shape, indicative of a resulting impairment of gastrulation, in the same embryos whose ERK activity is assessed by live FRET at 6 h post fertilization.

RASopathies are multisystem genetic syndromes caused by RAS-MAPK pathway hyperactivation. Potentially pathogenic variants awaiting validation emerge continuously while poor preclinical evidence limits therapy. Here, we describe our in vivo protocol to test and cross-validate RASopathy-associated ERK activation levels and its pharmacological modulation during embryogenesis by live FRET imaging in Teen-reporter zebrafish.

Un protocolo eficiente para evaluar la modulación de la actividad de ERK en modelos tempranos de síndrome de Noonan de pez cebra mediante microscopía FRET en vivo e inmunofluorescencia

RASopathies are genetic syndromes caused by ERK hyperactivation and resulting in multisystemic diseases that can also lead to cancer predisposition. ...

Bioquímica

High Resolution Whole Mount In Situ Hybridization within Zebrafish Embryos to Study Gene Expression and Function

This article focuses on whole-mount in situ hybridization (WISH) of zebrafish embryos. The WISH technology facilitates the assessment of gene expression both in terms of tissue distribution and developmental stage. Protocols are described for the use of WISH of zebrafish embryos using antisense RNA probes labeled with digoxigenin. Probes are generated by incorporating digoxigenin-linked nucleotides through in vitro transcription of gene templates that have been cloned and linearized. The chorions of embryos harvested at defined developmental stages are removed before incubation with specific probes. Following a washing procedure to remove excess probe, embryos are incubated with anti-digoxigenin antibody conjugated with alkaline phosphatase. By employing a chromogenic substrate for alkaline phosphatase, specific gene expression can be assessed. Depending on the level of gene expression the entire procedure can be completed within 2-3 days.

High Resolution Whole Mount In Situ Hybridization within Zebrafish Embryos to Study Gene Expression and Function

The zebrafish, a small tropical fish, has become a popular model for studying gene function during vertebrate development and disease. The temporal and spatial expression of target genes can be determined by in situ hybridization. Our improved protocol allows for the detection of low abundant transcripts with low non-specific background signal.

Alta resolución todo el montaje de<em&gt; In Situ</em&gt; La hibridación en embriones de pez cebra para estudiar la expresión génica y la función

This article focuses on whole-mount in situ hybridization (WISH) of zebrafish embryos. The WISH technology facilitates the assessment of gene expression ...

Zebrafish Microinjection Techniques

One of the major advantages to working with zebrafish (Danio rerio) is that their genetics can be easily manipulated by microinjection of early stage embryos. Using this technique, solutions containing genetic material or knockdown constructs are delivered into the blastomeres: the embryonic cells sitting atop the yolk of the newly fertilized egg. Delivery into the cytoplasm is achieved either through direct injection into the blastomere, or via natural cytoplasmic movements that occur after a solution is injected into the yolk. Successful genetic manipulations are usually followed by quantification of embryonic phenotypes in order to elucidate the genetic mechanisms of development.
This video will provide an introduction to carrying out microinjections in zebrafish embryos. The discussion begins with a review of the essential tools for the technique, including the injection apparatus and the microinjector, which controls fluid movement with pressure pulses of air. Next, important preparatory steps are demonstrated, such as the pouring of agar plates to stabilize embryos during injection and calibration of the microinjection apparatus. The injection procedure is then presented along with tips on when and where injections should be performed. Finally, applications of the microinjection technique are discussed, including gene overexpression via mRNA injection, gene silencing by delivery of antisense morpholino oligonucleotides, and the generation of transgenic zebrafish using specially engineered plasmid DNA.

Introduction to Microinjection of Early Zebrafish Embryos

Técnicas de microinyección en el pez cebra

One of the major advantages to working with zebrafish (Danio rerio) is that their genetics can be easily manipulated by microinjection of early stage ...