Nuestro protocolo permite medir la velocidad de autofagia y actividad proteasomal en los tejidos del ratón y es lo suficientemente sensible como para detectar variaciones circadianas dentro de estas actividades. Esta técnica se puede utilizar in vivo para evaluar el catabolismo proteico en células y tejidos y los materiales requeridos son relativamente de baja tecnología y accesibles a cualquier laboratorio de biología molecular. Demostrando el procedimiento estará Mikhail Ryzhikov, un post-doc de mi laboratorio.
Durante quince minutos antes de cada punto de tiempo, caliente las soluciones de stock de leupeptina y bortezomib a temperatura ambiente y diluya el bortezomib descongelado en PBS estéril para producir una solución de trabajo de 50 miligramos por mililitro. Para la administración de inhibidores de la proteasa, inyectar por vía intraperitoneal 40 miligramos por kilogramo de leupeptina o 1,6 microgramos por kilogramo de bortezomib en cada animal experimental. Para un control negativo, inyecte ratones con 0,5 mililitros de PBS.
Devolver cada ratón a las jaulas agrupadas por el tipo de tratamiento recibido a medida que se inyectan y registrar el tiempo que los ratones son tratados o manipulados en una tabla estandarizada. Dos horas después de la inyección, sumerja el lóbulo hepático izquierdo cosechado de cada animal experimental sacrificado en siete mililitros de tampón de homogeneización con frío en tubos cónicos de 15 mililitros debidamente etiquetados sobre hielo. Una vez adquiridas todas las muestras, transfiera la primera muestra y todo el volumen del tampón de homogeneización a un homogeneizador Dounce de 15 mililitros de capacidad y homogeneice la muestra con 10 golpes del pistón suelto y 15 golpes del pistón apretado.
Devuelva el crudo resultante a su tubo original y homogeneice la siguiente muestra como se acaba de demostrar. Cuando todas las muestras han sido homogeneizadas, sedimentar los núcleos homogeneizados y escombros por centrifugación y transferir los cuatro mililitros superiores de cada sobrenadante post-nuclear en nuevos tubos de 15 mililitros. Determinar la concentración proteica de esta primera fracción sobrenadante de acuerdo con los protocolos estándar e igualar las concentraciones de todas las muestras a 2,1 miligramos por mililitro con tampón de homogeneización fresca según sea necesario.
Para el análisis posterior y la mejora de la calidad, aliquot 500 microlitros de las fracciones totales de proteínas normalizadas en tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitros para un almacenamiento de menos 80 grados Centígrados. Transfiera 1,5 mililitros de cada una de las fracciones totales de proteínas restantes a tubos de microcentrífuga individuales y pelete las muestras de proteínas por centrifugación. Transfiera un mililitro de los sobrenadantes de segunda fracción resultantes a nuevos tubos de microcentrífuga sobre hielo y aspire los sobrenadantes restantes.
Lave los pellets 3K dos veces en 1,5 mililitros de tampón de homogeneización en frío fresco por lavado, luego resuspender el pellet 3K en 200 microlitros de tampón de muestra SDS-PAGE y hervir las muestras a 95 grados Celsius durante cinco minutos. Gire los sobrenadantes de segunda fracción durante 20 minutos a 20.000 x g y cuatro grados Celsius y transfiera los sobrenadantes de fracción citoplasmático resultantes a un nuevo tubo de microcentrífuga. Para el análisis SDS-PAGE, combine 150 microlitros de la fracción citoplasmático con 50 microlitros de tampón de muestra 4x SDS-PAGE y hierva las muestras de fracción citoplasmático a 95 grados Celsius durante cinco minutos.
Aspirar el sobrenadante restante de los pellets de 20K y lavar las muestras dos veces con 1,5 mililitros de tampón de homogeneización fría fresca por lavado. A continuación, resuspender el pellet 20K en 100 microlitros de tampón de muestra SDS-PAGE para hervir a 95 grados Cent durante cinco minutos. Para el análisis de manchas occidentales, diluir en serie las proteínas de curva estándar de uno a tres en 1x tampón de muestra para un total de seis diluciones y cargar 10 microlitros de cada muestra de curva estándar en un pozo de 26 pozos de cuatro a 12%SDS-PAGE midi gel, a continuación, cargar un estándar de peso molecular comercial prestenido.
Para medir el flujo autofágico, cargue 12 microlitros de cada muestra de pellet 3K en los pozos apropiados. Para medir el flujo proteasomal, cargue 12 microlitros de cada fracción citoplasmático en los pozos apropiados. Una vez cargadas todas las muestras de control y experimentales, separe las muestras de proteínas por SDS-PAGE antes de transferir las proteínas a membranas de fluoruro de polivinilideno de acuerdo con los protocolos estándar.
Para analizar el flujo macroautofágico, membranas manchadas que contienen las muestras de pellets 3K con anticuerpos anti-p62 o anti-LcB durante la noche a cuatro grados Celsius. Para analizar el flujo proteasomal, membranas manchadas que contienen las muestras de fracción citoplasmática con anticuerpos de poliubiquitina anti lisina 48-Específicos durante la noche a cuatro grados Celsius. A continuación, imagine las manchas occidentales utilizando anticuerpos secundarios estándar y dispositivos de imágenes.
Para realizar mediciones densitométricas en bandas de interés tanto para la curva estándar como para las muestras experimentales, abra un programa de software de análisis de imágenes adecuado y dibuje un rectángulo largo que abarque el monómero de proteínas de interés en la parte inferior de la imagen de la mancha que se extiende hasta la parte superior de la membrana. Copie y pegue para mover el rectángulo a las muestras restantes, manteniendo el rectángulo coherente entre las muestras. Guarde la cuantificación en una hoja de cálculo y genere una curva estándar densitométrica dentro de la hoja de cálculo utilizando la muestra estándar diluida en serie en regresión lineal o polinómica para obtener una ecuación de curva estándar de mejor ajuste.
Usando esta ecuación, extrapolar la cantidad de los monómeros de interés dentro de las muestras experimentales. Para obtener mediciones de flujo, reste la cantidad de proteína extrapolada de cada muestra tratada con inhibidor del valor medio de las muestras de PBS del mismo punto de tiempo. A continuación, evalúe la significancia estadística de la variación temporal en la rotación de proteínas utilizando ANOVA unidireccional.
La lectura primaria para el flujo autofágico en cualquier punto de tiempo dado es la diferencia en la cantidad de marcadores específicos de macroautofagia entre la leupeptina tratada frente a las muestras falsas en la fracción de pellet 3K enriquecida con lisosoma dividida por dos. Normalmente, los resultados se normalizan a la media que simplifica la comparación entre experimentos independientes. Nuestro procedimiento para medir el flujo proteolítico depende de la capacidad de la leupeptina o bortezomib para causar la acumulación de sustratos de autofagia y proteasoma, que es un proceso dependiente del tiempo.
Esta técnica ha permitido explorar cómo los ritmos biológicos programan el catabolismo de proteínas hepáticas. Esperamos que allane el camino para investigar los efectos de la enfermedad en las funciones de limpieza celular.
