Este trabajo fue apoyado por una beca de los Institutos Nacionales de Salud, R01CA142928.

1. La inyección intravenosa de azul de Evans en la vena lateral de la cola de ratones <ol><li> Preparar una solución de 0,5% estéril de azul de Evans en PBS. Si es necesario, filtro-esterilizar la solución para eliminar cualquier material particulado que no se ha disuelto. </li><li> Aspirar 200 l Evans solución azul en una jeringa. Evitar todas las burbujas de aire que podrían haber escapado a la jeringa. </li><li> Coloque los ratones que son 8-12 semanas de edad en un dispositivo de retención para que el animal no es libremente móvil, pero la cola puede ser manejado. </li><li> Coloque el dispositivo de sujeción del ratón sobre su lado para que la vena lateral de la cola es fácilmente visible y están mirando hacia arriba. </li><li> Apóyese en la cola con la mano no dominante entre el pulgar y el índice. </li><li> Insertar la aguja (calibre pequeño, 27-30) en un avance 10-15 grados de ángulo, bisel hacia arriba, en la vena lateral de la cola hacia la dirección de la cabeza. Mantener la aguja y la jeringa paralela a la cola. </li><li> Do No se aplica la presión de retorno para confirmar la colocación adecuada, ya que podría colapsar la vena. </li><li> Inyecte lentamente 200 l solución Evans Blue en la vena de la cola del ratón. </li><li> Observar la facilidad con la que avanza el émbolo, ya que esta es la prueba de la colocación correcta de la aguja en la vena. </li><li> Ponga el ratón de nuevo en su jaula y observarla durante 30 min. </li></ol> 2. Colección de órganos y extracción de Evans Blue de los Órganos <ol><li> El sacrificio de los ratones mediante dislocación cervical. Para fines de ensayo Miles dislocación cervical se recomienda ya que limita la interferencia significativa con la permeabilidad vascular. Sacrificar todos los ratones al mismo tiempo, tan rápido como sea posible. Trabaja con cohortes de 6 ratones o menos, porque poco después de la muerte vasos sanguíneos se vuelven más permeables. </li><li> Coloque los ratones en sus espaldas y ponen sus pies sobre una superficie blanca. </li><li> Abra la cavidad abdominal y torácica para exponer thorACIC y órganos abdominales. </li><li> Tome fotografías representativas para mostrar las diferencias en Evans extravasación de azul. Incluyen todos los ratones en el mismo campo con el fin de tener idénticas condiciones de iluminación para todos los ratones. </li><li> Recoge los órganos de interés y los puso en tubos de 1,5 ml </li><li> Pesar un tubo vacío y llevar el valor del balance a cero. </li><li> Transferir la muestra de tejido y ponderar la misma. Repita para todas las muestras de tejido. Los tejidos pueden ser secadas al aire para eliminar la variabilidad del contenido de agua entre los diferentes órganos. </li><li> . Añadir 500 l de formamida a cada tubo de muestra de tejido. </li><li> Transferir todos los tubos a un baño de agua a 55 ° C o bloque de calor. Incubar durante 24-48 horas para extraer tejido de azul de Evans. </li></ol> 3. La cuantificación de azul de Evans extravasado en el tejido intersticial <ol><li> Centrifugar la formamida / mezcla de azul de Evans para sedimentar los fragmentos de tejidos restantes. </li><li> Medir la absorbancia a 610nm. Utilizar 500 l formamida como blanco. </li><li> Calcular ng azul de Evans extravasado por mg de tejido. </li><li> Trazar todos los datos en un gráfico. </li><li> Realizar análisis estadístico para determinar diferencias significativas. </li></ol>

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	<li>Beck, K. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+NO+synthase:+role+in+cellular+signaling.">Inducible NO synthase: role in cellular signaling.</a> J. Exp. Biol. 202, 645-653 (1999).</li><li>Bertglia, S., Giusti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+nitric+oxide+in+capillary+perfusion+and+oxygen+delivery+regulation+during+systemic+hypoxia.">Role of nitric oxide in capillary perfusion and oxygen delivery regulation during systemic hypoxia.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 288, H525-H531 (2005).</li><li>Miles, A. A., Miles, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+reactions+to+histamine,+histamine-liberator+and+leutaxine+in+the+skin+of+guinea+pigs.">Vascular reactions to histamine, histamine-liberator and leutaxine in the skin of guinea pigs.</a> J. Physiol. (London). 118, 228-257 (1952).</li><li>Weis, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+permeability+in+cardiovascular+disease+and+cancer.">Vascular permeability in cardiovascular disease and cancer.</a> Curr. Opin. Hematol. 15, 243-249 (2008).</li><li>Kumar, P., Shen, Q., Pivetii, C. D., Lee, E. S., We, M. H., Yuan, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+endothelial+hyperpermeability:+implications+in+inflammation.">Molecular mechanisms of endothelial hyperpermeability: implications in inflammation.</a> Expert Rev. Mol. Med. 30, 11-19 (2009).</li><li>Viazzi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+permeability,+blood+pressure,+and+organ+damage+in+primary+hypertension.">Vascular permeability, blood pressure, and organ damage in primary hypertension.</a> Hypertens. Res. 31, 873-879 (2008).</li><li>Scheppke, ., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+vascular+permeability+suppression+by+topical+application+of+a+novel+VEGFR2/Src+kinase+inhibitor+in+mice+and+rabbits.">Retinal vascular permeability suppression by topical application of a novel VEGFR2/Src kinase inhibitor in mice and rabbits.</a> J. Clin. Invest. 118, 2337-2346 (2008).</li><li>Blanchet, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+CD34+Leads+To+Exacerbated+Autoimmune+Arthritis+through+Increased+Vascular+Permeability.">Loss of CD34 Leads To Exacerbated Autoimmune Arthritis through Increased Vascular Permeability.</a> J. Immunol. 184, 1292-1299 (2010).</li><li>Dvorak, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mast+cell-derived+mediators+of+enhanced+microvascular+permeability,+vascular+permeability+factor/vascular+endothelial+growth+factor,+histamine,+and+serotonin,+cause+leakage+of+macromolecules+through+a+new+endothelial+cell+permeability+organelle,+the+vesiculo-vacuolar+organelle.">Mast cell-derived mediators of enhanced microvascular permeability, vascular permeability factor/vascular endothelial growth factor, histamine, and serotonin, cause leakage of macromolecules through a new endothelial cell permeability organelle, the vesiculo-vacuolar organelle.</a> Chem. Immunol. Allergy. 85, 185-204 (2005).</li><li>Le Guelte, A., Gavard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+endothelial+cell-cell+junctions+in+endothelial+permeability.">Role of endothelial cell-cell junctions in endothelial permeability.</a> Methods Mol. Biol. 763, 265-279 (2011).</li><li>Martins-Green, M., Petreaca, M., Yao, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+assay+system+for+in+vitro+detection+of+permeability+in+human+"endothelium".">An assay system for in vitro detection of permeability in human "endothelium".</a> Methods Enzymol. 443, 137-153 (2008).</li></ol>

Los autores no tienen conflicto o competencia de los intereses financieros.

La permeabilidad vascular es un marcador crítico para el estado de los vasos sanguíneos. Aumento de la permeabilidad vascular se ha demostrado que está presente en varias enfermedades sistémicas, incluyendo la diabetes, la hipertensión y las enfermedades autoinmunes 6,7,8. Aumento de la permeabilidad vascular ha demostrado ser mediada por esfuerzo cortante, factores de crecimiento tales como el factor de crecimiento endotelial vascular y el factor de crecimiento de fibroblastos, mediadores de la inflamación como la serotonina, la histamina y la bradiquinina 9. La extravasación de agua y las moléculas pequeñas se cree que ocurre a través de pequeñas aberturas entre las células endoteliales. La fuerza de las uniones célula a célula está estrictamente regulada por la interacción entre las moléculas 10. En condiciones fisiológicas endotelio es permeable al agua y los iones, e impermeable a las proteínas. Por lo tanto, en ausencia de estímulos inflamatorios, albúmina está restringido al flujo de sangre y no se mueve en el fluido extracelular. Mediante la inyección de Efurgonetas Blue, un tinte que se une a la albúmina, se puede supervisar el grado de pérdida de proteínas de la corriente de sangre en el tejido intersticial. Una versión modificada de este ensayo utiliza microesferas marcadas con fluorescencia. Mediante el uso de diferente tamaño de microesferas o diferente peso molecular fluorescente marcada con dextrano (4-70 KDa) uno puede evaluar mejor el grado de lesión endotelial. Sin embargo, esta opción elimina la facilidad de visualización y requiere la fijación de los tejidos y formación de imágenes de microscopía fluorescente, o la medida usando un lector de placas de fluorescencia. En estudios in vitro de permeabilidad de los vasos se han utilizado con éxito en la bibliografía 11. Un ingrediente esencial de cualquier estudio de permeabilidad in vitro es una monocapa de células intactas, células confluentes. Estos ensayos utilizan una cámara de doble clásica donde las células endoteliales se cultivan en una monocapa sobre una membrana permeable situada en la cámara superior. Un colorante se aplica a la parte superiorcámara y la permeabilidad de las células endoteliales se evalúa midiendo la cantidad de colorante que llega a la cámara inferior. Los resultados imitar en la mayoría de los casos en los resultados del ensayo in vivo. Sin embargo, carecen del contexto fisiológico apropiado y con ello se complica por la complejidad de los resultados. El enfoque in vitro también elimina el papel de los pericitos, células que, en tejidos vivos, están en estrecho contacto con las células endoteliales y enviar señales para la proliferación de células endoteliales, el crecimiento de vasos y la ramificación. Los resultados de las pruebas Miles idealmente deberían ir acompañadas de estudios moleculares que examinar más a fondo la hipótesis de que se está probando. Como se ha mencionado, en un organismo completo, la permeabilidad vascular depende de muchas variables, y por lo tanto los resultados de un ensayo de permeabilidad in vivo deben ser interpretadas a la luz de la complejidad del sistema analizado.

Formación y mantenimiento de barreras permeables selectivas son esenciales para el desarrollo adecuado de los órganos y 1,2 rendimiento. Las células endoteliales recubren el lumen del vaso sanguíneo y forman una barrera semi-permeable que es esencial en el transporte selectivo entre la sangre y el espacio intersticial de todos los órganos. Una barrera de permeabilidad adecuada se mantiene a través de estrechos célula a célula uniones que están estrictamente controladas por factores de crecimiento, citoquinas y otras moléculas relacionadas con el estrés 3. La interrupción de la barrera de células endoteliales puede resultar en aumento de la permeabilidad vascular y las fugas. Estos efectos se observan en diversos estados de enfermedad y la comprensión de la señalización molecular subrayado requiere métodos multidisciplinarios 4,5. En este artículo, se describe un método in vivo para medir la permeabilidad de los vasos utilizando un modelo de ratón. El ensayo que se describe, también conocido como ensayo de Miles, es un bien establISHED método para probar la permeabilidad vascular in vivo. El ensayo se basa en el hecho de que, bajo condiciones fisiológicas basales, la albúmina no cruza la barrera endotelial. Evans Blue, un colorante azoico con alta afinidad para la albúmina, se inyecta en la corriente sanguínea de un animal experimental, y bajo condiciones fisiológicas, se espera a ser restringido dentro de los vasos sanguíneos. Cuando un estímulo permeabilidad vascular se añade, ya sea tópica o sistémica, los vasos sanguíneos comienzan a gotear proteína y, por tanto, también el azul de Evans que se une a la albúmina. Esto resulta en una coloración azulada rápida de los tejidos que tienen vasos permeables. Inyección exitosa del colorante en la vena lateral de la cola del ratón es crítica para el buen resultado del experimento. Vena de la cola técnica de inyección requiere una amplia práctica y debe ser dominado antes de iniciar el experimento. Permeabilidad de los vasos es altamente dependiente de la edad y el peso de la unaimal, por lo que cuando se comparan diferentes cepas de ratón, es imperativo que los ratones u otros sujetos de prueba tienen cerca de las fechas de nacimiento y el peso idénticas. Otros factores que influyen en la permeabilidad de la barrera endotelial son las condiciones ambientales tales como temperatura, humedad, y muy importante, el estrés del manejo del ratón. Debido a la multitud de factores que pueden influir en el resultado del experimento es siempre aconsejable que el experimento se repitió al menos tres veces y el análisis estadístico realizado. Este ensayo puede ser utilizado para comparar o permeabilidad de los vasos de ratones que han sido modificadas genéticamente, así como los ratones con diferentes fondos genéticos. La permeabilidad puede ser evaluada en presencia o ausencia de un estímulo, dependiendo de la función del gen que se modula. Este ensayo también se puede usar o para probar el efecto de diferentes compuestos sobre la permeabilidad de los vasos.

<table border="1"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td> REACTIVO </td></tr><tr><td> EVANS BLUE </td><td> SIGMA </td><td> E2129 </td><td></td></tr><tr><td> FORMAMIDA </td><td> INVITROGEN </td><td> 15515-026 </td><td></td></tr><tr><td> PBS </td><td></td><td></td><td> Fosfato 0,2 M 1,5 M NaCl pH 7,4 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> EQUIPO </td></tr><tr><td> ESPECTROFOTÓMETRO </td><td> EPPENDORF </td><td> 952000006 </td><td></td></tr><tr><td> RATÓN dispositivo de sujeción </td><td> Harvard Apparatus </td><td> 340012 </td><td></td></tr><tr><td> JERINGA </td><td> BD </td><td> 309659 </td><td></td></tr><tr><td> AGUJAS </td><td> BD </td><td> 305106 </td><td> El calibre de la aguja depende del tamaño del animal. </td></tr><tr><td> BALANCE </td><td> DENVER INSTRUMENT </td><td> TP-64 </td><td></td></tr></tbody></table>

an in vivo assay to test blood vessel permeability

Este método se basa en la inyección intravenosa de azul de Evans en ratones como modelo animal de ensayo. El azul de Evans es un colorante que se une a la albúmina. En condiciones fisiológicas el endotelio es impermeable a la albúmina, por lo azul de Evans albúmina permanece unido restringidos dentro de los vasos sanguíneos. En condiciones patológicas que promueven el aumento de la permeabilidad células endoteliales vasculares pierden parcialmente sus contactos estrechos y el endotelio se vuelve permeable a pequeñas proteínas tales como albúmina. Esta condición permite la extravasación de azul de Evans en los tejidos. Un endotelio sano previene la extravasación del colorante en los tejidos vascularizados vecinos. Los órganos con aumento de la permeabilidad mostrará coloración azul aumentó significativamente en comparación con los órganos con endotelio intacto. El nivel de permeabilidad vascular se puede evaluar por simple visualización o por medición cuantitativa del colorante incorporado por miligramo de tejido de control versus animal experimental / tejido. Dos Powerful aspectos de este ensayo son su simplicidad y características cuantitativas. Colorante azul de Evans se puede extraer de los tejidos mediante la incubación de una cantidad específica de tejido en formamida. Evans Blue es el máximo de absorción a 620 nm y la absorbancia es mínimo a 740 nm. Mediante el uso de una curva estándar para el azul de Evans, medidas de densidad óptica se puede convertir en colorante capturado miligramo por miligramo de tejido. El análisis estadístico se debe utilizar para evaluar las diferencias significativas en la permeabilidad vascular.

Hemos utilizado un ensayo de permeabilidad in vivo para probar las fugas buque en ratones 8-12 semanas de edad. Esta prueba es útil para comparar la permeabilidad relativa vascular entre los animales del fondo genético diferente o en una sola cepa de ratones sometidos a tratamientos que afectan a la vasculatura. Nuestros resultados muestran que una cepa de ratones genéticamente modificados que hemos creado en nuestro laboratorio cuenta con un endotelio más permeable en comparación con ratones de tipo salvaje. Estos cambios son evidentes a nivel macroscópico en muchos órganos (Figura 1). Hemos sido capaces de cuantificar la diferencia en la permeabilidad de los vasos por la medición de la spectophotometricaly azul de Evans que fue capturado por gramo de tejido en diferentes órganos. Como se observa en la figura 2 diferentes órganos muestran una respuesta diferente a las señales inductoras de permeabilidad y así mostrar acumulación tinte diferente. Esta es también una función de los niveles de vascularización en diferentes tejidos. <p class= &quot;Jove_content&quot; fo: keep-together.within-page = &quot;always&quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/50062/50062fig1.jpg" alt="Figura 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50062/50062fig1highres.jpg"/> Figura 1. Evans extravasación de azul en los tejidos. 30 minutos después de inyección de azul de Evans ratones fueron sacrificados por dislocación cervical. Imágenes representativas de los órganos de interés fueron tomadas. <img src="/files/ftp_upload/50062/50062fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Figura 2. La cuantificación de la extravasación de azul de Evans en diferentes tejidos. 50-100 mg de tejido se incubaron con 500 l de formamida para extraer el azul de Evans extravasado. La densidad óptica se midió a 610 nm y las mediciones transformar en colorante extravasado ng por mg de tejido. El experimento se repitió tres veces.

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An in vivo Assay to Test Blood Vessel Permeability

Estamos presentando un<em&gt; In vivo</em&gt; Ensayo para probar la permeabilidad de los vasos sanguíneos. Este ensayo se basa en la inyección intravenosa de un colorante y la posterior visualización de su difusión en espacios intersticiales.

Un<em&gt; In vivo</em&gt; Ensayo de prueba de permeabilidad Vasos Sanguíneos

This method is based on the intravenous injection of Evans Blue in mice as the test animal model. Evans blue is a dye that binds albumin. Under ...

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Universidad Científica del Sur

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Medicine

An in vivo Assay to Test Blood Vessel Permeability

64.4K vistas.  Fox Chase Cancer Center. Estamos presentando un In vivo Ensayo para probar la permeabilidad de los vasos sanguíneos. Este ensayo se basa en la inyección intravenosa de un colorante y la posterior visualización de su difusión en espacios intersticiales.

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In Vitro Assays to Assess Blood-brain Barrier Mesh-like Vessel Formation and Disruption

Blood-brain barrier (BBB) coverage plays a central role in the homeostasis of the central nervous system (CNS). The BBB is dynamically maintained by astrocytes, pericytes and brain endothelial cells (BECs). Here, we detail methods to assess BBB coverage using single cultures of immortalized human BECs, single cultures of primary mouse BECs, and a humanized triple culture model (BECs, astrocytes and pericytes) of the BBB. To highlight the applicability of the assays to disease states, we describe the effect of oligomeric amyloid-&#946; (oA&#946;), which is an important contributor to Alzheimer&#39;s disease (AD) progression, on BBB coverage. Further, we utilize the epidermal growth factor (EGF) to illuminate the drug screening potential of the techniques. Our results show that single and triple cultured BECs form meshwork-like structures under basal conditions, and that oA&#946; disrupts this cell meshwork formation and degenerates the preformed mesh structures, but EGF blocks this disruption. Thus, the techniques described are important for dissecting fundamental and disease-relevant processes that modulate BBB coverage.

In Vitro Assays to Assess Blood-brain Barrier Mesh-like Vessel Formation and Disruption

Maintaining blood-brain barrier coverage is key for the homeostasis of the central nervous system. This protocol describes in vitro techniques to delineate the fundamental and pathological processes that modulate blood-brain barrier coverage.

Ensayos in vitro para evaluar la formación y la interrupción de los vasos sanguíneos de barrera hematoencefálica

Blood-brain barrier (BBB) coverage plays a central role in the homeostasis of the central nervous system (CNS). The BBB is dynamically maintained by ...

Investigación

Medicina

An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers

Blood-brain barrier (BBB) is a specialized barrier that protects the brain microenvironment from toxins and pathogens in the circulation and maintains brain homeostasis. The principal sites of the barrier are endothelial cells of the brain capillaries whose barrier function results from tight intercellular junctions and efflux transporters expressed on the plasma membrane. This function is regulated by pericytes and astrocytes that together form the neurovascular unit (NVU). Several neurological diseases such as stroke, Alzheimer&#39;s disease (AD), brain tumors are associated with an impaired BBB function. Assessment of the BBB permeability is therefore crucial in evaluating the severity of the neurological disease and the success of the treatment strategies employed.
We present here a simple yet robust permeability assay that have been successfully applied to several mouse models both, genetic and experimental. The method is highly quantitative and objective in comparison to the tracer fluorescence analysis by microscopy that is commonly applied. In this method, mice are injected intraperitoneally with a mix of aqueous inert fluorescent tracers followed by anesthetizing the mice. Cardiac perfusion of the animals is performed prior to harvesting brain, kidneys or other organs. Organs are homogenized and centrifuged followed by fluorescence measurement from the supernatant. Blood drawn from the cardiac puncture just before perfusion serves for normalization purpose to the vascular compartment. The tissue fluorescence is normalized to the wet weight and serum fluorescence to obtain a quantitative tracer permeability index. For additional confirmation, the contralateral hemi-brain preserved for immunohistochemistry can be utilized for tracer fluorescence visualization purposes.

An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers

Here we present a mouse brain vascular permeability assay using intraperitoneal injection of fluorescent tracers followed by perfusion that is applicable to animal models of blood-brain barrier dysfunction. One hemi-brain is used for assessing permeability quantitatively and the other for tracer visualization/immunostaining. The procedure takes 5 - 6 h for 10 mice.

Un en Vivo Barrera Blood - brain permeabilidad ensayo en ratones usando fluorescencia etiquetada trazadores

Blood-brain barrier (BBB) is a specialized barrier that protects the brain microenvironment from toxins and pathogens in the circulation and maintains ...

Neurociencias

An In Vivo Method for Evaluating the Gut-Blood Barrier and Liver Metabolism of Microbiota Products

The gut-blood barrier (GBB) controls the passage of nutrients, bacterial metabolites and drugs from intestinal lumen to the bloodstream. The GBB integrity is disturbed in gastrointestinal, cardiovascular and metabolic diseases, which may result in easier access of biologically active compounds, such as gut bacterial metabolites, to the bloodstream. Thus, the permeability of the GBB may be a marker of both intestinal and extraintestinal diseases. Furthermore, the increased penetration of bacterial metabolites may affect the functioning of the entire organism.
Commonly used methods for studying the GBB permeability are performed ex vivo. The accuracy of those methods is limited, because the functioning of the GBB depends on intestinal blood flow. On the other hand, commonly used in vivo methods may be biased by liver and kidney performance, as those methods are based on evaluation of urine or/and peripheral blood concentrations of exogenous markers. Here, we present a direct measurement of GBB permeability in rats using an in vivo method based on portal blood sampling, which preserves intestinal blood flow and is virtually not affected by the liver and kidney function. 
Polyurethane catheters are inserted into the portal vein and inferior vena cava just above the hepatic veins confluence. Blood is sampled at baseline and after administration of a selected marker into a desired part of the gastrointestinal tract. Here, we present several applications of the method including (1) evaluation of the colon permeability to TMA, a gut bacterial metabolite, (2) evaluation of liver clearance of TMA, and (3) evaluation of a gut-portal blood-liver-peripheral blood pathway of gut bacteria-derived short-chain fatty acids. Furthermore, the protocol may also be used for tracking intestinal absorption and liver metabolism of drugs or for measurements of portal blood pressure.

An In Vivo Method for Evaluating the Gut-Blood Barrier and Liver Metabolism of Microbiota Products

The access of nutrients, microbiota metabolites and medicines to the circulation is controlled by the gut-blood barrier (GBB). We describe a direct method for measuring the GBB permeability in vivo, which, in contrast to commonly used indirect methods, is virtually not affected by liver and kidney functions.

Un método In Vivo para evaluar la barrera intestinal-sangre y hígado metabolismo de la Microbiota de productos

The gut-blood barrier (GBB) controls the passage of nutrients, bacterial metabolites and drugs from intestinal lumen to the bloodstream. The GBB integrity ...

Quantifying Single Microvessel Permeability in Isolated Blood-perfused Rat Lung Preparation

The isolated blood-perfused lung preparation is widely used to visualize and define signaling in single microvessels. By coupling this preparation with real time imaging, it becomes feasible to determine permeability changes in individual pulmonary microvessels. Herein we describe steps to isolate rat lungs and perfuse them with autologous blood. Then, we outline steps to infuse fluorophores or agents via a microcatheter into a small lung region. Using these procedures described, we determined permeability increases in rat lung microvessels in response to infusions of bacterial lipopolysaccharide. The data revealed that lipopolysaccharide increased fluid leak across both venular and capillary microvessel segments. Thus, this method makes it possible to compare permeability responses among vascular segments and thus, define any heterogeneity in the response. While commonly used methods to define lung permeability require postprocessing of lung tissue samples, the use of real time imaging obviates this requirement as evident from the present method. Thus, the isolated lung preparation combined with real time imaging offers several advantages over traditional methods to determine lung microvascular permeability, yet is a straightforward method to develop and implement.

The isolated blood-perfused lung preparation makes it feasible to visualize microvessel networks on the lung surface. Here we describe an approach to quantify permeability of single microvessels in isolated lungs using real time fluorescence imaging.

La cuantificación individual Microvessel Permeabilidad en aislado de rata Blood-perfundido Preparación de pulmón

The isolated blood-perfused lung preparation is widely used to visualize and define signaling in single microvessels. By coupling this preparation with ...

Biología

Microperfusion Technique to Investigate Regulation of Microvessel Permeability in Rat Mesentery

Experiments to measure the permeability properties of individually perfused microvessels provide a bridge between investigation of molecular and cellular mechanisms regulating vascular permeability in cultured endothelial cell monolayers and the functional exchange properties of whole microvascular beds. A method to cannulate and perfuse venular microvessels of rat mesentery and measure the hydraulic conductivity of the microvessel wall is described. The main equipment needed includes an intravital microscope with a large modified stage that supports micromanipulators to position three different microtools: (1) a beveled glass micropipette to cannulate and perfuse the microvessel; (2) a glass micro-occluder to transiently block perfusion and enable measurement of transvascular water flow movement at a measured hydrostatic pressure, and (3) a blunt glass rod to stabilize the mesenteric tissue at the site of cannulation. The modified Landis micro-occlusion technique uses red cells suspended in the artificial perfusate as markers of transvascular fluid movement, and also enables repeated measurements of these flows as experimental conditions are changed and hydrostatic and colloid osmotic pressure difference across the microvessels are carefully controlled. Measurements of hydraulic conductivity first using a control perfusate, then after re-cannulation of the same microvessel with the test perfusates enable paired comparisons of the microvessel response under these well-controlled conditions. Attempts to extend the method to microvessels in the mesentery of mice with genetic modifications expected to modify vascular permeability were severely limited because of the absence of long straight and unbranched microvessels in the mouse mesentery, but the recent availability of the rats with similar genetic modifications using the CRISPR/Cas9 technology is expected to open new areas of investigation where the methods described herein can be applied.

The modified Landis technique enables paired measurement of the hydraulic conductivity of individual microvessels in the mesentery of normal and genetically modified rats under control and test conditions using microperfusion techniques. It provides a convenient method to evaluate mechanisms that regulate microvessel permeability and transvascular exchange under physiological conditions.

Microperfusión Técnica de investigar Reglamento de Microvessel Permeabilidad en Rata Mesenterio

Experiments to measure the permeability properties of individually perfused microvessels provide a bridge between investigation of molecular and cellular ...

In Vivo Study of Human Endothelial-Pericyte Interaction Using the Matrix Gel Plug Assay in Mouse

Angiogenesis is the process by which new blood vessels are formed from existing vessels. New vessel growth requires coordinated endothelial cell proliferation, migration, and alignment to form tubular structures followed by recruitment of pericytes to provide mural support and facilitate vessel maturation. Current in vitro cell culture approaches cannot fully reproduce the complex biological environment where endothelial cells and pericytes interact to produce functional vessels. We present a novel application of the in vivo matrix gel plug assay to study endothelial-pericyte interactions and formation of functional blood vessels using severe combined immune deficiency mutation (SCID) mice. Briefly, matrix gel is mixed with a solution containing endothelial cells with or without pericytes followed by injection into the back of anesthetized SCID mice. After 14 days, the matrix gel plugs are removed, fixed and sectioned for histological analysis. The length, number, size and extent of pericyte coverage of mature vessels (defined by the presence of red blood cells in the lumen) can be quantified and compared between experimental groups using commercial statistical platforms. Beyond its use as an angiogenesis assay, this matrix gel plug assay can be used to conduct genetic studies and as a platform for drug discovery. In conclusion, this protocol will allow researchers to complement available in vitro assays for the study of endothelial-pericyte interactions and their relevance to either systemic or pulmonary angiogenesis.

In Vivo Study of Human Endothelial-Pericyte Interaction Using the Matrix Gel Plug Assay in Mouse

We present a protocol to study human endothelial-pericyte interactions in mouse using a variation of the matrix gel plug angiogenesis assay.

Estudio in vivo de Interacción Humano-endotelial de pericitos Utilización de Plug Ensayo matriz de gel en el ratón

Angiogenesis is the process by which new blood vessels are formed from existing vessels. New vessel growth requires coordinated endothelial cell ...

Endothelial Cell Transcytosis Assay as an In Vitro Model to Evaluate Inner Blood-Retinal Barrier Permeability

Dysfunction of the blood-retinal barrier (BRB) contributes to the pathophysiology of several vascular eye diseases, often resulting in retinal edema and subsequent vision loss. The inner blood-retinal barrier (iBRB) is mainly composed of retinal vascular endothelium with low permeability under physiological conditions. This feature of low permeability is tightly regulated and maintained by low rates of paracellular transport between adjacent retinal microvascular endothelial cells, as well as transcellular transport (transcytosis) through them. The assessment of retinal transcellular barrier permeability may provide fundamental insights into iBRB integrity in health and disease. In this study, we describe an endothelial cell (EC) transcytosis assay, as an in vitro model for evaluating iBRB permeability, using human retinal microvascular endothelial cells (HRMECs). This assay assesses the ability of HRMECs to transport transferrin and horseradish peroxidase (HRP) in receptor- and caveolae-mediated transcellular transport processes, respectively. Fully confluent HRMECs cultured on porous membrane were incubated with fluorescent-tagged transferrin (clathrin-dependent transcytosis) or HRP (caveolae-mediated transcytosis) to measure the levels of transferrin or HRP transferred to the bottom chamber, indicative of transcytosis levels across the EC monolayer. Wnt signaling, a known pathway regulating iBRB, was modulated to demonstrate the caveolae-mediated HRP-based transcytosis assay method. The EC transcytosis assay described here may provide a useful tool for investigating the molecular regulators of EC permeability and iBRB integrity in vascular pathologies and for screening drug delivery systems.

Endothelial Cell Transcytosis Assay as an In Vitro Model to Evaluate Inner Blood-Retinal Barrier Permeability

This protocol illustrates an in vitro endothelial cell transcytosis assay as a model to evaluate inner blood-retinal barrier permeability by measuring the ability of human retinal microvascular endothelial cells to transport horseradish peroxidase across cells in caveolae-mediated transcellular transport processes.

Ensayo de transcitosis de células endoteliales como modelo in vitro para evaluar la permeabilidad de la barrera interna sangre-retina

Dysfunction of the blood-retinal barrier (BRB) contributes to the pathophysiology of several vascular eye diseases, often resulting in retinal edema and ...

Evaluating Vascular Hyperpermeability-inducing Agents in the Skin with the Miles Assay

The primary function of the vascular endothelium in vertebrate organisms is to serve as a barrier between the blood and each tissue of the body, whereby the permeability of the endothelium to blood cells, plasma macromolecules, and water can be adapted according to the physiological need. In certain diseases, cytokines and growth factors are released that target the endothelial barrier to transiently increase vascular permeability; however, their prolonged presence may cause chronic vascular hyperpermeability and thereby tissue-damaging edema. The Miles assay is an in vivo technique that allows researchers to study vascular hyperpermeability through the proxy measurement of vascular leakage. Here, we provide a detailed protocol on how to perform this procedure in the mouse, which is the most widely used model organism to study mammalian physiology and pathology. The procedure involves the intravenous injection of Evans blue dye to label the circulating albumin followed by multiple intradermal injections of permeability-inducing agents and vehicle control solutions into opposing flanks of the mouse. Consequently, Evans blue dye gradually leaks into the dermis, where it accumulates and can be extracted for quantification as leakage induced by the permeability-inducing agent relative to the vehicle. The Miles assay can be performed in wild type or genetically modified mouse models and may be combined with drug administration to study molecular mechanisms that regulate vascular permeability and identify agents/targets capable of inducing or blocking hyperpermeability.

Here, we present a protocol to measure the vascular leakage induced by intradermal administration of permeability promoting agents into the murine skin. This technique can be used to determine the ability of molecules to promote or inhibit vascular leakage or to study the molecular mechanisms that regulate vascular permeability.

Evaluación de agentes inductores de la hiperpermeabilidad Vascular en la piel con el ensayo de millas

The primary function of the vascular endothelium in vertebrate organisms is to serve as a barrier between the blood and each tissue of the body, whereby ...

In Vivo Vascular Permeability Detection in Mouse Submandibular Gland

Saliva plays an important role in oral and overall health. The intact endothelial barrier function of blood vessels enables saliva secretion, whereas the endothelial barrier dysfunction is related to many salivary gland secretory disorders. The present protocol describes an in vivo paracellular permeability detection method to evaluate the function of endothelial tight junctions (TJs) in mouse submandibular glands (SMG). First, fluorescence-labeled dextrans with different molecular weights (4 kDa, 40 kDa, or 70 kDa) were injected into the angular veins of mice. Afterward, the unilateral SMG was dissected and fixed in the customized holder under a two-photon laser-scanning microscope, and then images were captured for blood vessels, acini, and ducts. Utilizing this method, the real-time dynamic leakage of the different-sized tracers from blood vessels into the basal sides of the acini and even across the acinar epithelia into the ducts was monitored to evaluate the alteration of the endothelial barrier function under physiological or pathophysiological conditions.

In Vivo Vascular Permeability Detection in Mouse Submandibular Gland

In the present protocol, the endothelial barrier function of the submandibular gland (SMG) was evaluated by injecting different molecular weighted fluorescent tracers into the angular veins of test animal models in vivo under a two-photon laser-scanning microscope.

In vivo Detección de permeabilidad vascular en glándula submandibular de ratón

Saliva plays an important role in oral and overall health. The intact endothelial barrier function of blood vessels enables saliva secretion, whereas the ...

Simplificación de los estudios de angiogénesis con un ensayo de tapón de gel de matriz modificada

Modified In Vivo Matrix Gel Plug Assay for Angiogenesis Studies

Several models have been developed to investigate angiogenesis in vivo. However, most of these models are complex and expensive, require specialized equipment, or are hard to perform for subsequent quantitative analysis. Here we present a modified matrix gel plug assay to evaluate angiogenesis in vivo. In this protocol, vascular cells were mixed with matrix gel in the presence or absence of pro-angiogenic or anti-angiogenic reagents, and then subcutaneously injected into the back of recipient mice. After 7 days, phosphate buffer saline containing dextran-FITC is injected via the tail vein and circulated in vessels for 30 min. Matrix gel plugs are collected and embedded with tissue embedding gel, then 12 &#181;m sections are cut for fluorescence detection without staining. In this assay, dextran-FITC with high molecular weight (~150,000 Da) can be used to indicate functional vessels for detecting their length, while dextran-FITC with low molecular weight (~4,400 Da) can be used to indicate the permeability of neo-vessels. In conclusion, this protocol can provide a reliable and convenient method for the quantitative study of angiogenesis in vivo.

Autor destacado: Investigación de la angiogénesis y la permeabilidad de los vasos a través de un ensayo de tapón de gel de matriz modificada

The method presented here can evaluate the effect of reagents on angiogenesis or vascular permeability in vivo without staining. The method uses dextran-FITC injection via the tail vein to visualize neo-vessels or vascular leakage.

Ensayo de tapón de gel de matriz in vivo modificado para estudios de angiogénesis

Several models have been developed to investigate angiogenesis in vivo. However, most of these models are complex and expensive, require specialized ...

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