עבודה זו נתמכה על ידי מענק מהמכון הלאומי לבריאות, R01CA142928.

1. הזרקה תוך ורידית של אוונס הכחול בוריד זנב העכבר לרוחב <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 0.5% תמיסה סטרילית של אוונס הכחול ב PBS. במידת צורך, מסנן-לעקר את הפתרון כדי להסיר כל חומר חלקיקים שאינו מומס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב פתרון 200 μl אוונס הכחול לתוך מזרק. הימנע מכל בועות האוויר שאולי נמלטו לתוך המזרק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עכברי מקום שהם ישנים 8-12 שבועות לתוך מכשיר איפוק כדי שבעל החיים אינם חופשי ניידים אבל זנבו ניתן לטפל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את מכשיר איפוק העכבר על צידו כך וריד הזנב לרוחב הוא נראה בקלות והם פונים כלפי מעלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להחזיק את הזנב עם היד הלא הדומיננטית בין האגודל לאצבע המורה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס את המחט (מד קטן, 27-30) בזווית של 10-15 מעלות, שיפוע למעלה, מראש לתוך וריד הזנב לרוחב לכיוונו של הראש. שמור מקביל מחט מזרק ועד הזנב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Do לא תחול שוב לחץ לאישור המיקום נכון שכן דבר עלול לכווץ את הווריד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאט לאט להזריק פתרון 200 μl אוונס הכחול בוריד הזנב של העכבר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקפד על קלות שבה התקדמות הבוכנה, כמו זה היא ההוכחה למיקום נכון של המחט בווריד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים את העכבר בחזרה לכלוב שלו ולבחון אותו למשך 30 דקות. </li></ol> 2. אוסף איברים והפקת אוונס הכחול מהאיברים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקריב את העכברים דרך נקע בצוואר רחם. למטרות assay מיילס נקע צוואר רחם מומלץ משום שהוא מגביל את התערבות משמעותית בחדירות כלי דם. להקריב את כל העכברים באותו הזמן, מהר ככל האפשר. עבודה עם קבוצות של 6 עכברים או פחות, משום שזמן קצר לאחר שכלי הדם של מוות נעשים חדירים יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקם את העכברים על גבם ולהצמיד את רגליהם על לוח לבן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את חלל הבטן ובית החזה כדי לחשוף Thorאיברי acic ובטן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח תמונות מייצגות כדי להראות הבדלים בextravasation הכחול אוונס. כלול את כל העכברים באותו השדה כדי שתהיה לי תנאי תאורה זהות לכל העכברים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף איברים של עניין ולשים אותם בצינורות 1.5 מ&quot;ל </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוקל צינור ריק ולהביא את ערך האיזון לאפס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת דגימת הרקמה ומשקלו. חזור על פעולה עבור כל דגימות הרקמה. רקמות יכולות להיות אוויר יבש כדי לחסל את שונות תכולת המים בין איברים שונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> . הוסף פוראמיד μl 500 לכל צינור דגימת רקמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר את כל הצינורות לאמבטית 55 ° C מים או בלוק חום. דגירה במשך 24-48 שעות כדי לחלץ אוונס הכחול מרקמות. </li></ol> 3. כימות של אוונס הכחול Extravasated ברקמות ביניים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה פוראמיד / התערובת הכחולה אוונס לגלולה כל ברי רקמה נותרות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד ספיגה ב610ננומטר. השתמש פוראמיד μl 500 כריקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חישוב ng אוונס הכחול extravasated לרקמת מ&quot;ג. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עלילה כל הנתונים בגרף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביצוע ניתוח סטטיסטי כדי לקבוע הבדלים משמעותיים. </li></ol>

<ol>
	<li>Beck, K. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+NO+synthase:+role+in+cellular+signaling.">Inducible NO synthase: role in cellular signaling.</a> J. Exp. Biol. 202, 645-653 (1999).</li><li>Bertglia, S., Giusti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+nitric+oxide+in+capillary+perfusion+and+oxygen+delivery+regulation+during+systemic+hypoxia.">Role of nitric oxide in capillary perfusion and oxygen delivery regulation during systemic hypoxia.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 288, H525-H531 (2005).</li><li>Miles, A. A., Miles, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+reactions+to+histamine,+histamine-liberator+and+leutaxine+in+the+skin+of+guinea+pigs.">Vascular reactions to histamine, histamine-liberator and leutaxine in the skin of guinea pigs.</a> J. Physiol. (London). 118, 228-257 (1952).</li><li>Weis, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+permeability+in+cardiovascular+disease+and+cancer.">Vascular permeability in cardiovascular disease and cancer.</a> Curr. Opin. Hematol. 15, 243-249 (2008).</li><li>Kumar, P., Shen, Q., Pivetii, C. D., Lee, E. S., We, M. H., Yuan, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+endothelial+hyperpermeability:+implications+in+inflammation.">Molecular mechanisms of endothelial hyperpermeability: implications in inflammation.</a> Expert Rev. Mol. Med. 30, 11-19 (2009).</li><li>Viazzi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+permeability,+blood+pressure,+and+organ+damage+in+primary+hypertension.">Vascular permeability, blood pressure, and organ damage in primary hypertension.</a> Hypertens. Res. 31, 873-879 (2008).</li><li>Scheppke, ., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+vascular+permeability+suppression+by+topical+application+of+a+novel+VEGFR2/Src+kinase+inhibitor+in+mice+and+rabbits.">Retinal vascular permeability suppression by topical application of a novel VEGFR2/Src kinase inhibitor in mice and rabbits.</a> J. Clin. Invest. 118, 2337-2346 (2008).</li><li>Blanchet, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+CD34+Leads+To+Exacerbated+Autoimmune+Arthritis+through+Increased+Vascular+Permeability.">Loss of CD34 Leads To Exacerbated Autoimmune Arthritis through Increased Vascular Permeability.</a> J. Immunol. 184, 1292-1299 (2010).</li><li>Dvorak, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mast+cell-derived+mediators+of+enhanced+microvascular+permeability,+vascular+permeability+factor/vascular+endothelial+growth+factor,+histamine,+and+serotonin,+cause+leakage+of+macromolecules+through+a+new+endothelial+cell+permeability+organelle,+the+vesiculo-vacuolar+organelle.">Mast cell-derived mediators of enhanced microvascular permeability, vascular permeability factor/vascular endothelial growth factor, histamine, and serotonin, cause leakage of macromolecules through a new endothelial cell permeability organelle, the vesiculo-vacuolar organelle.</a> Chem. Immunol. Allergy. 85, 185-204 (2005).</li><li>Le Guelte, A., Gavard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+endothelial+cell-cell+junctions+in+endothelial+permeability.">Role of endothelial cell-cell junctions in endothelial permeability.</a> Methods Mol. Biol. 763, 265-279 (2011).</li><li>Martins-Green, M., Petreaca, M., Yao, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+assay+system+for+in+vitro+detection+of+permeability+in+human+"endothelium".">An assay system for in vitro detection of permeability in human "endothelium".</a> Methods Enzymol. 443, 137-153 (2008).</li></ol>

המחברים אין סכסוך או אינטרסים כלכליים מתחרים.

חדירות כלי דם היא סמן קריטי למצב כלי דם. חדירות כלי דם מוגבר הוכחה להיות נוכח בכמה מחלות מערכתיות, כולל סוכרת, יתר לחץ דם, ומחלות אוטואימוניות 6,7,8. חדירות כלי דם מוגבר הוכחה להיות מתווכות על ידי מאמץ גזירה, גורמי גדילת כלי דם האנדותל כמו גורם גדילה ופקטור גדילה פי?...

גיבוש ותחזוקה של מחסומים חדירים סלקטיבית הם חיוניים להתפתחות איבר תקין ו1,2 ביצועים. תאי האנדותל קו לום כלי הדם ויוצרים מחסום חדיר למחצה כי הוא חיוני בהובלה סלקטיבית בין הדם למרחב ביניים של כל האיברים. מחסום חדירות נאותות נשמר באמצעות צומת תא לתא צפופים הנשלטים בקפידה על ידי גורמי גדילה, ציטוקינים ומולקולות הקשורות מתח אחרות 3. שיבוש של מכשול התא האנדותל יכול לגרום לחדירות מוגברות ודליפה של כלי דם. תופעות אלו נצפות במצבי מחלה שונים וההבנה של האיתות המולקולרית הקו התחתונה דורשת שיטות רבות תחומיות 4,5. במאמר זה, אנו מתארים בשיטת vivo למדוד חדירות כולים תוך שימוש במודל עכבר. הבדיקה שאנחנו מתארים, הידוע גם כassay מיילס, היא-establ גםished שיטה לבדיקת חדירות כלי דם בגוף חי. הבדיקה מתבססת על העובדה שבתנאים פיסיולוגיים בסיסיים, אלבומין אינו חוצה את מחסום אנדותל. אוונס הכחול, צבע אזו עם זיקה חזקה לאלבומין, מוזרק לזרם הדם של בעלי חיים הניסיונות, ובתנאים פיסיולוגיים, אך הוא צפוי להיות מוגבל בתוך כלי דם. כאשר גירוי חדירות כלי דם נוסף, או topically או מערכתי, כלי דם מתחילים לדלוף חלבון ובכך, גם הכחול אוונס שהוא חייב אלבומין. התוצאה היא גוון כחלחל מהיר של רקמות שיש להם כולים חדירים. זריקה מוצלחת של הצבע בוריד זנב העכבר לרוחב היא קריטית לתוצאות הטובות של הניסוי. טכניקת הזרקת וריד זנב דורשת תרגול רב וצריכה להיות שולטת לפני תחילת הניסוי. חדירות כלי תלויות מאוד בגיל ובמשקל שלimal, ולכן כאשר משווים זנים שונים של עכברים הוא הכרחי כי העכברים או נושאים אחרים יש מבחן קרוב לתאריכי לידה זהים ומשקל. גורמים אחרים המשפיעים על החדירות של מחסום אנדותל הם תנאים סביבתיים כגון טמפרטורה, לחות, ומאוד חשוב, מתח הטיפול בעכבר. בשל ריבוי גורמים שיכולים להשפיע על התוצאה של הניסוי זה תמיד רצוי שהניסוי חוזר על עצמו לפחות שלוש פעמים וניתוחים סטטיסטיים בוצעו. בדיקה זו יכולה לשמש או להשוואת חדירות כלי של עכברים שעברו שינוי גנטי, כמו גם עכברים עם רקע גנטי שונה. חדירות ניתן להעריך בנוכחותו או היעדריו של גירוי, בהתאם לפונקציה של הגן שהוא מווסת. assay זה יכול לשמש גם או כדי לבדוק את ההשפעה של תרכובות שונות בחדירות כלי דם.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td> מגיב </td></tr><tr><td> אוונס כחול </td><td> SIGMA </td><td> E2129 </td><td></td></tr><tr><td> פוראמיד </td><td> Invitrogen </td><td> 15515-026 </td><td></td></tr><tr><td> PBS </td><td></td><td></td><td> פוספט 0.2m 1.5M NaCl pH 7.4 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> ציוד </td></tr><tr><td> ספקטרופוטומטרים </td><td> אפנדורף </td><td> 952000006 </td><td></td></tr><tr><td> התקן ריסון MOUSE </td><td> הרווארד מכשיר </td><td> 340012 </td><td></td></tr><tr><td> מזרק </td><td> BD </td><td> 309659 </td><td></td></tr><tr><td> מחטים </td><td> BD </td><td> 305106 </td><td> המד של המחט תלוי בגודלו של בעל החיים. </td></tr><tr><td> מאזן </td><td> מכשיר דנבר </td><td> TP-64 </td><td></td></tr></tbody></table>

an in vivo assay to test blood vessel permeability

שיטה זו מבוססת על הזרקה תוך ורידית של אוונס הכחול בעכברים כמודל חית המבחן. אוונס הכחול הוא צבע שנקשר אלבומין. בתנאים פיסיולוגיים האנדותל בלתי חדיר לאלבומין, כך שרידי אלבומין כריכה כחולה אוונס מוגבל בתוך כלי דם. בתנאים פתולוגיים שמקדמים חדירות תאי אנדותל כלי דם מוגבר באופן חלקי לאבד הקשר הקרוב שלהם והאנדותל הופך חדיר לחלבונים קטנים כגון אלבומין. מצב זה מאפשר לextravasation של אוונס הכחול ברקמות. האנדותל בריא מונע extravasation של הצבע ברקמות כלי הדם הסמוכות. איברים עם חדירות מוגברות יציגו צבע כחול גדל באופן משמעותי בהשוואה לאיברים עם האנדותל בשלמותה. רמת חדירות כלי דם יכולה להיות מוערכת על ידי הדמיה פשוטה או על ידי מדידת כמותית של הצבע המשולבת למיליגרם של רקמה של שליטה מול חיים / רקמות ניסיוניות. שני poweהיבטי rful של assay זה הם הפשטות שלו ומאפייני כמותיים. אוונס הכחול צבע ניתן לחלץ מרקמות על ידי דוגר כמות מסוימת של רקמה בפוראמיד. מרבית הספיגה הכחולה אוונס הוא בעמ &#39;620 ננומטר וספיגה מינימאלית היא ב740 ננומטר. באמצעות עקומת סטנדרט עבור אוונס הכחול, מדידות צפיפות אופטיות ניתן להמיר את צבע מיליגרם כבש למיליגרם של רקמה. ניתוח סטטיסטי יש להשתמש כדי להעריך הבדלים משמעותיים בחדירות כלי דם.

<html> אנחנו השתמשנו בבדיקת חדירות vivo לבדוק זליגת כלי בעכברים 8-12 שבועות ישנים. בדיקה זו היא שימושית בהשוואת חדירות כלי דם היחסיות בין בעלי חיים של רקע גנטי שונה או בזן אחד של עכברים הנתונים לטיפולים המשפיעים על מערכת כלי הדם. התוצאות שלנו מראות כי זן של עכברים מ...

Watch this Scientific Journal Video about An in vivo Assay to Test Blood Vessel Permeability at JoVE.com

An in vivo Assay to Test Blood Vessel Permeability

אנו מציגים<em&gt; In vivo</em&gt; בדיקה לבדיקת חדירות כלי דם. בדיקה זו מבוססת על הזרקה תוך ורידית של הדמיה לצבוע ולאחר מכן של דיפוזיה שלו למרחבי ביניים.

<em&gt; In vivo</em&gt; Assay לבדיקת חדירות כלי דם

This method is based on the intravenous injection of Evans Blue in mice as the test animal model. Evans blue is a dye that binds albumin. Under ...

an-in-vivo-assay-to-test-blood-vessel-permeability

Research

JoVE Journal

Medicine

An in vivo Assay to Test Blood Vessel Permeability

64.3K Views.  Fox Chase Cancer Center. אנו מציגים In vivo בדיקה לבדיקת חדירות כלי דם. בדיקה זו מבוססת על הזרקה תוך ורידית של הדמיה לצבוע ולאחר מכן של דיפוזיה שלו למרחבי ביניים.

Video: An in vivo Assay to Test Blood Vessel Permeability

In Vitro Assays to Assess Blood-brain Barrier Mesh-like Vessel Formation and Disruption

Blood-brain barrier (BBB) coverage plays a central role in the homeostasis of the central nervous system (CNS). The BBB is dynamically maintained by astrocytes, pericytes and brain endothelial cells (BECs). Here, we detail methods to assess BBB coverage using single cultures of immortalized human BECs, single cultures of primary mouse BECs, and a humanized triple culture model (BECs, astrocytes and pericytes) of the BBB. To highlight the applicability of the assays to disease states, we describe the effect of oligomeric amyloid-&#946; (oA&#946;), which is an important contributor to Alzheimer&#39;s disease (AD) progression, on BBB coverage. Further, we utilize the epidermal growth factor (EGF) to illuminate the drug screening potential of the techniques. Our results show that single and triple cultured BECs form meshwork-like structures under basal conditions, and that oA&#946; disrupts this cell meshwork formation and degenerates the preformed mesh structures, but EGF blocks this disruption. Thus, the techniques described are important for dissecting fundamental and disease-relevant processes that modulate BBB coverage.

In Vitro Assays to Assess Blood-brain Barrier Mesh-like Vessel Formation and Disruption

Maintaining blood-brain barrier coverage is key for the homeostasis of the central nervous system. This protocol describes in vitro techniques to delineate the fundamental and pathological processes that modulate blood-brain barrier coverage.

ב מבחני מבחנה כדי להעריך דם מוח מחסום כמו רשת כלי שיטפון ושיבוש

Blood-brain barrier (BBB) coverage plays a central role in the homeostasis of the central nervous system (CNS). The BBB is dynamically maintained by ...

An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers

Blood-brain barrier (BBB) is a specialized barrier that protects the brain microenvironment from toxins and pathogens in the circulation and maintains brain homeostasis. The principal sites of the barrier are endothelial cells of the brain capillaries whose barrier function results from tight intercellular junctions and efflux transporters expressed on the plasma membrane. This function is regulated by pericytes and astrocytes that together form the neurovascular unit (NVU). Several neurological diseases such as stroke, Alzheimer&#39;s disease (AD), brain tumors are associated with an impaired BBB function. Assessment of the BBB permeability is therefore crucial in evaluating the severity of the neurological disease and the success of the treatment strategies employed.
We present here a simple yet robust permeability assay that have been successfully applied to several mouse models both, genetic and experimental. The method is highly quantitative and objective in comparison to the tracer fluorescence analysis by microscopy that is commonly applied. In this method, mice are injected intraperitoneally with a mix of aqueous inert fluorescent tracers followed by anesthetizing the mice. Cardiac perfusion of the animals is performed prior to harvesting brain, kidneys or other organs. Organs are homogenized and centrifuged followed by fluorescence measurement from the supernatant. Blood drawn from the cardiac puncture just before perfusion serves for normalization purpose to the vascular compartment. The tissue fluorescence is normalized to the wet weight and serum fluorescence to obtain a quantitative tracer permeability index. For additional confirmation, the contralateral hemi-brain preserved for immunohistochemistry can be utilized for tracer fluorescence visualization purposes.

An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers

Here we present a mouse brain vascular permeability assay using intraperitoneal injection of fluorescent tracers followed by perfusion that is applicable to animal models of blood-brain barrier dysfunction. One hemi-brain is used for assessing permeability quantitatively and the other for tracer visualization/immunostaining. The procedure takes 5 - 6 h for 10 mice.

In Vivo מחסום הדם - מוח חדירות Assay בעכברים באמצעות Fluorescently עם התווית המשדרים

Blood-brain barrier (BBB) is a specialized barrier that protects the brain microenvironment from toxins and pathogens in the circulation and maintains ...

Neuroscience

An In Vivo Method for Evaluating the Gut-Blood Barrier and Liver Metabolism of Microbiota Products

The gut-blood barrier (GBB) controls the passage of nutrients, bacterial metabolites and drugs from intestinal lumen to the bloodstream. The GBB integrity is disturbed in gastrointestinal, cardiovascular and metabolic diseases, which may result in easier access of biologically active compounds, such as gut bacterial metabolites, to the bloodstream. Thus, the permeability of the GBB may be a marker of both intestinal and extraintestinal diseases. Furthermore, the increased penetration of bacterial metabolites may affect the functioning of the entire organism.
Commonly used methods for studying the GBB permeability are performed ex vivo. The accuracy of those methods is limited, because the functioning of the GBB depends on intestinal blood flow. On the other hand, commonly used in vivo methods may be biased by liver and kidney performance, as those methods are based on evaluation of urine or/and peripheral blood concentrations of exogenous markers. Here, we present a direct measurement of GBB permeability in rats using an in vivo method based on portal blood sampling, which preserves intestinal blood flow and is virtually not affected by the liver and kidney function. 
Polyurethane catheters are inserted into the portal vein and inferior vena cava just above the hepatic veins confluence. Blood is sampled at baseline and after administration of a selected marker into a desired part of the gastrointestinal tract. Here, we present several applications of the method including (1) evaluation of the colon permeability to TMA, a gut bacterial metabolite, (2) evaluation of liver clearance of TMA, and (3) evaluation of a gut-portal blood-liver-peripheral blood pathway of gut bacteria-derived short-chain fatty acids. Furthermore, the protocol may also be used for tracking intestinal absorption and liver metabolism of drugs or for measurements of portal blood pressure.

An In Vivo Method for Evaluating the Gut-Blood Barrier and Liver Metabolism of Microbiota Products

The access of nutrients, microbiota metabolites and medicines to the circulation is controlled by the gut-blood barrier (GBB). We describe a direct method for measuring the GBB permeability in vivo, which, in contrast to commonly used indirect methods, is virtually not affected by liver and kidney functions.

שיטת In Vivo להערכת את מחסום הדם-הבטן ואת חילוף החומרים בכבד של מוצרים Microbiota

The gut-blood barrier (GBB) controls the passage of nutrients, bacterial metabolites and drugs from intestinal lumen to the bloodstream. The GBB integrity ...

Quantifying Single Microvessel Permeability in Isolated Blood-perfused Rat Lung Preparation

The isolated blood-perfused lung preparation is widely used to visualize and define signaling in single microvessels. By coupling this preparation with real time imaging, it becomes feasible to determine permeability changes in individual pulmonary microvessels. Herein we describe steps to isolate rat lungs and perfuse them with autologous blood. Then, we outline steps to infuse fluorophores or agents via a microcatheter into a small lung region. Using these procedures described, we determined permeability increases in rat lung microvessels in response to infusions of bacterial lipopolysaccharide. The data revealed that lipopolysaccharide increased fluid leak across both venular and capillary microvessel segments. Thus, this method makes it possible to compare permeability responses among vascular segments and thus, define any heterogeneity in the response. While commonly used methods to define lung permeability require postprocessing of lung tissue samples, the use of real time imaging obviates this requirement as evident from the present method. Thus, the isolated lung preparation combined with real time imaging offers several advantages over traditional methods to determine lung microvascular permeability, yet is a straightforward method to develop and implement.

The isolated blood-perfused lung preparation makes it feasible to visualize microvessel networks on the lung surface. Here we describe an approach to quantify permeability of single microvessels in isolated lungs using real time fluorescence imaging.

כימות יחיד כלי דם קטנים בחדירות מבודדת-perfused דם עכברוש ריאות הכנה

The isolated blood-perfused lung preparation is widely used to visualize and define signaling in single microvessels. By coupling this preparation with ...

Biology

Microperfusion Technique to Investigate Regulation of Microvessel Permeability in Rat Mesentery

Experiments to measure the permeability properties of individually perfused microvessels provide a bridge between investigation of molecular and cellular mechanisms regulating vascular permeability in cultured endothelial cell monolayers and the functional exchange properties of whole microvascular beds. A method to cannulate and perfuse venular microvessels of rat mesentery and measure the hydraulic conductivity of the microvessel wall is described. The main equipment needed includes an intravital microscope with a large modified stage that supports micromanipulators to position three different microtools: (1) a beveled glass micropipette to cannulate and perfuse the microvessel; (2) a glass micro-occluder to transiently block perfusion and enable measurement of transvascular water flow movement at a measured hydrostatic pressure, and (3) a blunt glass rod to stabilize the mesenteric tissue at the site of cannulation. The modified Landis micro-occlusion technique uses red cells suspended in the artificial perfusate as markers of transvascular fluid movement, and also enables repeated measurements of these flows as experimental conditions are changed and hydrostatic and colloid osmotic pressure difference across the microvessels are carefully controlled. Measurements of hydraulic conductivity first using a control perfusate, then after re-cannulation of the same microvessel with the test perfusates enable paired comparisons of the microvessel response under these well-controlled conditions. Attempts to extend the method to microvessels in the mesentery of mice with genetic modifications expected to modify vascular permeability were severely limited because of the absence of long straight and unbranched microvessels in the mouse mesentery, but the recent availability of the rats with similar genetic modifications using the CRISPR/Cas9 technology is expected to open new areas of investigation where the methods described herein can be applied.

The modified Landis technique enables paired measurement of the hydraulic conductivity of individual microvessels in the mesentery of normal and genetically modified rats under control and test conditions using microperfusion techniques. It provides a convenient method to evaluate mechanisms that regulate microvessel permeability and transvascular exchange under physiological conditions.

Microperfusion טכניקה לחקירת הסדרת כלי דם קטן חדירות בחולדה לפדר

Experiments to measure the permeability properties of individually perfused microvessels provide a bridge between investigation of molecular and cellular ...

In Vivo Study of Human Endothelial-Pericyte Interaction Using the Matrix Gel Plug Assay in Mouse

Angiogenesis is the process by which new blood vessels are formed from existing vessels. New vessel growth requires coordinated endothelial cell proliferation, migration, and alignment to form tubular structures followed by recruitment of pericytes to provide mural support and facilitate vessel maturation. Current in vitro cell culture approaches cannot fully reproduce the complex biological environment where endothelial cells and pericytes interact to produce functional vessels. We present a novel application of the in vivo matrix gel plug assay to study endothelial-pericyte interactions and formation of functional blood vessels using severe combined immune deficiency mutation (SCID) mice. Briefly, matrix gel is mixed with a solution containing endothelial cells with or without pericytes followed by injection into the back of anesthetized SCID mice. After 14 days, the matrix gel plugs are removed, fixed and sectioned for histological analysis. The length, number, size and extent of pericyte coverage of mature vessels (defined by the presence of red blood cells in the lumen) can be quantified and compared between experimental groups using commercial statistical platforms. Beyond its use as an angiogenesis assay, this matrix gel plug assay can be used to conduct genetic studies and as a platform for drug discovery. In conclusion, this protocol will allow researchers to complement available in vitro assays for the study of endothelial-pericyte interactions and their relevance to either systemic or pulmonary angiogenesis.

In Vivo Study of Human Endothelial-Pericyte Interaction Using the Matrix Gel Plug Assay in Mouse

We present a protocol to study human endothelial-pericyte interactions in mouse using a variation of the matrix gel plug angiogenesis assay.

In vivo לחקר האדם האנדותל-pericyte אינטראקציה באמצעות assay Plug מטריקס ג&#39;ל עכבר

Angiogenesis is the process by which new blood vessels are formed from existing vessels. New vessel growth requires coordinated endothelial cell ...

Endothelial Cell Transcytosis Assay as an In Vitro Model to Evaluate Inner Blood-Retinal Barrier Permeability

Dysfunction of the blood-retinal barrier (BRB) contributes to the pathophysiology of several vascular eye diseases, often resulting in retinal edema and subsequent vision loss. The inner blood-retinal barrier (iBRB) is mainly composed of retinal vascular endothelium with low permeability under physiological conditions. This feature of low permeability is tightly regulated and maintained by low rates of paracellular transport between adjacent retinal microvascular endothelial cells, as well as transcellular transport (transcytosis) through them. The assessment of retinal transcellular barrier permeability may provide fundamental insights into iBRB integrity in health and disease. In this study, we describe an endothelial cell (EC) transcytosis assay, as an in vitro model for evaluating iBRB permeability, using human retinal microvascular endothelial cells (HRMECs). This assay assesses the ability of HRMECs to transport transferrin and horseradish peroxidase (HRP) in receptor- and caveolae-mediated transcellular transport processes, respectively. Fully confluent HRMECs cultured on porous membrane were incubated with fluorescent-tagged transferrin (clathrin-dependent transcytosis) or HRP (caveolae-mediated transcytosis) to measure the levels of transferrin or HRP transferred to the bottom chamber, indicative of transcytosis levels across the EC monolayer. Wnt signaling, a known pathway regulating iBRB, was modulated to demonstrate the caveolae-mediated HRP-based transcytosis assay method. The EC transcytosis assay described here may provide a useful tool for investigating the molecular regulators of EC permeability and iBRB integrity in vascular pathologies and for screening drug delivery systems.

Endothelial Cell Transcytosis Assay as an In Vitro Model to Evaluate Inner Blood-Retinal Barrier Permeability

This protocol illustrates an in vitro endothelial cell transcytosis assay as a model to evaluate inner blood-retinal barrier permeability by measuring the ability of human retinal microvascular endothelial cells to transport horseradish peroxidase across cells in caveolae-mediated transcellular transport processes.

בדיקת טרנסציטוזה של תאי אנדותל כמודל In vitro להערכת חדירות מחסום הרשתית הפנימית בדם

Dysfunction of the blood-retinal barrier (BRB) contributes to the pathophysiology of several vascular eye diseases, often resulting in retinal edema and ...

Evaluating Vascular Hyperpermeability-inducing Agents in the Skin with the Miles Assay

The primary function of the vascular endothelium in vertebrate organisms is to serve as a barrier between the blood and each tissue of the body, whereby the permeability of the endothelium to blood cells, plasma macromolecules, and water can be adapted according to the physiological need. In certain diseases, cytokines and growth factors are released that target the endothelial barrier to transiently increase vascular permeability; however, their prolonged presence may cause chronic vascular hyperpermeability and thereby tissue-damaging edema. The Miles assay is an in vivo technique that allows researchers to study vascular hyperpermeability through the proxy measurement of vascular leakage. Here, we provide a detailed protocol on how to perform this procedure in the mouse, which is the most widely used model organism to study mammalian physiology and pathology. The procedure involves the intravenous injection of Evans blue dye to label the circulating albumin followed by multiple intradermal injections of permeability-inducing agents and vehicle control solutions into opposing flanks of the mouse. Consequently, Evans blue dye gradually leaks into the dermis, where it accumulates and can be extracted for quantification as leakage induced by the permeability-inducing agent relative to the vehicle. The Miles assay can be performed in wild type or genetically modified mouse models and may be combined with drug administration to study molecular mechanisms that regulate vascular permeability and identify agents/targets capable of inducing or blocking hyperpermeability.

Here, we present a protocol to measure the vascular leakage induced by intradermal administration of permeability promoting agents into the murine skin. This technique can be used to determine the ability of molecules to promote or inhibit vascular leakage or to study the molecular mechanisms that regulate vascular permeability.

הערכת סוכנים בתדר Hyperpermeability כלי דם בעור עם וזמינותו Miles

The primary function of the vascular endothelium in vertebrate organisms is to serve as a barrier between the blood and each tissue of the body, whereby ...

In Vivo Vascular Permeability Detection in Mouse Submandibular Gland

Saliva plays an important role in oral and overall health. The intact endothelial barrier function of blood vessels enables saliva secretion, whereas the endothelial barrier dysfunction is related to many salivary gland secretory disorders. The present protocol describes an in vivo paracellular permeability detection method to evaluate the function of endothelial tight junctions (TJs) in mouse submandibular glands (SMG). First, fluorescence-labeled dextrans with different molecular weights (4 kDa, 40 kDa, or 70 kDa) were injected into the angular veins of mice. Afterward, the unilateral SMG was dissected and fixed in the customized holder under a two-photon laser-scanning microscope, and then images were captured for blood vessels, acini, and ducts. Utilizing this method, the real-time dynamic leakage of the different-sized tracers from blood vessels into the basal sides of the acini and even across the acinar epithelia into the ducts was monitored to evaluate the alteration of the endothelial barrier function under physiological or pathophysiological conditions.

In Vivo Vascular Permeability Detection in Mouse Submandibular Gland

In the present protocol, the endothelial barrier function of the submandibular gland (SMG) was evaluated by injecting different molecular weighted fluorescent tracers into the angular veins of test animal models in vivo under a two-photon laser-scanning microscope.

אין ויוו זיהוי חדירות כלי דם בבלוטה תת-מנדיבולרית של עכבר

Saliva plays an important role in oral and overall health. The intact endothelial barrier function of blood vessels enables saliva secretion, whereas the ...

פישוט מחקרי אנגיוגנזה עם בדיקת תקע ג'ל מטריצה שונה

Modified In Vivo Matrix Gel Plug Assay for Angiogenesis Studies

Several models have been developed to investigate angiogenesis in vivo. However, most of these models are complex and expensive, require specialized equipment, or are hard to perform for subsequent quantitative analysis. Here we present a modified matrix gel plug assay to evaluate angiogenesis in vivo. In this protocol, vascular cells were mixed with matrix gel in the presence or absence of pro-angiogenic or anti-angiogenic reagents, and then subcutaneously injected into the back of recipient mice. After 7 days, phosphate buffer saline containing dextran-FITC is injected via the tail vein and circulated in vessels for 30 min. Matrix gel plugs are collected and embedded with tissue embedding gel, then 12 &#181;m sections are cut for fluorescence detection without staining. In this assay, dextran-FITC with high molecular weight (~150,000 Da) can be used to indicate functional vessels for detecting their length, while dextran-FITC with low molecular weight (~4,400 Da) can be used to indicate the permeability of neo-vessels. In conclusion, this protocol can provide a reliable and convenient method for the quantitative study of angiogenesis in vivo.

מחבר זרקור: חקירת אנגיוגנזה וחדירות כלי דם באמצעות בדיקת תקע ג'ל מטריצה שונה

The method presented here can evaluate the effect of reagents on angiogenesis or vascular permeability in vivo without staining. The method uses dextran-FITC injection via the tail vein to visualize neo-vessels or vascular leakage.

שונה בבדיקת תקע ג'ל מטריצת Vivo למחקרי אנגיוגנזה

Several models have been developed to investigate angiogenesis in vivo. However, most of these models are complex and expensive, require specialized ...

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video