Este trabajo fue apoyado por becas de los Institutos Nacionales de Salud (ES07408 y EB00208).

1. ECIS / taxis Preparación de electrodos <ol><li> La superficie de oro de la matriz de electrodos ECIS / taxis (que consta de 8 cámaras por diapositiva) se estabiliza por primera pre-tratamiento con cisteína estéril 10 mM en agua desionizada (dH 2 O) durante 15 min a temperatura ambiente bajo condiciones estériles. </li><li> Aspirar la solución de cisteína de cada cámara de electrodo, enjuagar 3 veces con agua estéril O dH 2, y reemplazar con 250 l de medio completo (RPMI 1640, FBS al 10%, 25 mM de tampón HEPES). </li><li> Conecte el conjunto de electrodos en contacto con alfileres en tenedor del instrumento matriz para realizar la comprobación de los electrodos. </li><li> Cámaras que estén debidamente conectadas se resaltan en verde en la pantalla del ordenador. Si las cámaras se resaltan en rojo, no están conectados y los electrodos se deben volver a colocar en el titular de la matriz para establecer contactos para todas las cámaras. </li><li> Una vez que todas las cámaras están conectadas, haga clic en el botón &quot;Check&quot; en el controlador de software para disuadir a losminar la resistencia inicial y los valores de capacitancia para cada cámara. Los valores de resistencia debe ser de entre 1600 y 2000 ohmios, y los valores de capacitancia debe ser de entre 5 y 6 nanofaradios para una matriz de la cámara 8. Si una cámara no está dentro de estos parámetros aceptables, la cámara individual no debe ser utilizado para recoger datos. </li><li> Desconecte el electrodo de soporte de serie para preparar las cámaras individuales de agarosa. Aspirar el medio de las cámaras y lave cada cámara de 3 veces con agua estéril dH 2 O. </li></ol> 2. Preparar agarosa Cámaras <ol><li> En un tubo de polipropileno estéril de 15 ml cónico, medida de 0,03 g de Seakem GTG agarosa y se añade 1 ml de PBS estéril. Colocar la tapa del tubo sin apretar, y fundir la agarosa en autoclave durante un ciclo de 2 minutos líquido (punto de fusión en un horno de microondas no es eficaz para este ensayo). Este breve periodo de tiempo no se derrita el tubo cónico. Para las células menos exigentes que no requieren suero para el cultivo, (por ejemplo Dictyostelium discoideum) 0,5%agarosa se puede hacer en el medio apropiado y se fundió en un horno de microondas. El autoclave es necesario para las células que requieren suero, ya que esto se desnaturalizó si fundió en horno de microondas. </li><li> Añadir 5 ml de medio RPMI completo calentó en un baño de agua (55 ° -60 ° C) directamente a la agarosa caliente, a una concentración final de 0,5% de agarosa y pipeta hacia arriba y hacia abajo suavemente para mezclar. </li><li> Pipetear 300 l de medio de agarosa derretida en cada cámara, vuelva a colocar los ECIS / cobertura amplia taxis y permita que el gel a la temperatura ambiente. </li><li> Pipetee restante de agarosa en la tapa del tubo de 15 ml para evaluar gelificante agarosa. Este exceso de agarosa se utilizará también en la parte 4: Cortar en los pozos de agarosa. </li></ol> 3. La construcción y afilado de la cánula de herramientas de corte bien <ol><li> Afilar dos cánulas de calibre 14 extremo romo, utilizando un 5/64 &quot;bits. Girar la punta de la broca en cada abertura de la cánula con un taladro de velocidad lenta, asegurándose de que la broca corta borde entero interior de cada op cánuladatorio formar un borde de corte afilado (Figura 4A). </li><li> Haga dos agujeros a través de 1 &quot;x 2&quot; x ¼ &quot;de plexiglás (Figura 4B-D) con un 5/64&quot; en una prensa de taladro. Inserte cada afilado cánula de calibre 14 por lo que sobresale a la misma distancia a través de cada agujero de plexiglás. </li></ol> 4. Corte de Wells en agarosa <ol><li> Esterilizar las cánulas de calibre 14 por la ligera llama de la punta. Antes de cortar los pozos en la cámara de ECIS, permitir que la cánula se enfríe a temperatura ambiente, o enfriar las cánulas tocando la agarosa en el tapón del tubo de 15 ml. Si la temperatura de la cánula es demasiado alta, la agarosa se derretirá como los pozos de cámara se cortan, haciendo que los pozos deforme y defectuoso. </li><li> Alinear el par cánula por encima de los dos puntos de oro que rodean el electrodo de destino en cada cámara (Figura 2c y 5). Insertar la cánula verticalmente, sin ningún tipo de movimiento horizontal, deteniéndose en contacto suave entre la cánula yla superficie del electrodo. Retire con cuidado la cánula, de nuevo sin ningún tipo de movimiento horizontal. La colocación de pozos adicionales para oponerse a gradientes también es posible con una reconfiguración de la plantilla cánula. </li><li> Suavemente aspirar el tapón de agarosa dejado por la cánula, utilizando un estéril 9 &quot;pipeta Pasteur, conectado a presión bajo vacío, con una trampa de vacío atrapar los residuos de agarosa. </li><li> Añadir 300 l de medio RPMI completo a la superficie de cada cámara a 37 ° C, durante 2 minutos para saturar la agarosa, y luego suavemente aspirar los medios de comunicación desde la superficie y los pozos sin perturbar la agarosa. </li></ol> 5. Carga de la Wells <ol><li> Cada bien es capaz de contener un volumen de 7 l. Para un pozo en cada cámara, añadir 7 l de suspensión de células. Para células Jurkat T, use 2 x 10 7 células / ml. Estas células responden a 7 l de 200 ng / ml SDF-1α diluida en RPMI incompleto, que carece de suero. Utilice los medios de comunicación completos solo como un cont negativorol. </li><li> Después de que los pozos se cargan, ver cada cámara de la matriz con un microscopio invertido para asegurar que todos los pocillos se cortaron y se llena apropiadamente. Las células deben estar en dentro de los confines de los límites del pozo. Si se ven tanto en los pozos, o se están extendiendo más allá del borde de la celda y, a continuación, una brecha se ha formado bajo la agarosa. Tenga en cuenta los pozos mal configurada, ya que los datos no pueden ser interpretados de forma fiable a partir de esas cámaras. </li></ol> 6. Recopilación de datos <ol><li> Coloque el electrodo en el soporte de la matriz y volver a conectar los electrodos de oro en la matriz de electrodos a los pines pogo resorte del titular y haga clic en &quot;Configuración&quot;. Los pozos que estén debidamente conectadas se resaltan en color verde. Si los pozos son de color rojo, que no están conectados y el electrodo debe ser recolocado en el soporte de matriz. </li><li> Seleccione &quot;8WE1&quot; (8 y 1 electrodo) desde el menú desplegable en el panel de software para indicar la configuración de la matriz. </li><li> Seleccione &quot;Buscar&quot; en el software de contrPanel ol para determinar la resistencia inicial y los valores de capacitancia para cada pocillo. Los valores de resistencia debe estar entre 1600 y 2000 ohmios, mientras que los valores de capacidad debe ser de entre 5 y 6 nanofarads. </li><li> Seleccione múltiples frecuencias para medir la resistencia a distintas frecuencias. Hay una opción de personalización de frecuencias, o utilizando un conjunto de frecuencias recomendadas. Los valores estándar de múltiples frecuencias de adquisición de la captura de datos en 11 frecuencias preestablecidas (52.5, 125, 250, 500, 1.000, 2.000, 4.000, 8.000, 16.000, 32.000 y 64.000 Hz) a una velocidad de 8 pozos por minuto. El intervalo de tiempo entre las mediciones también se pueden personalizar. La recopilación de datos de múltiples frecuencias permite el análisis de la capacitancia, impedancia y resistencia. Recopilación de los valores de resistencia a 4.000 Hz suele ser suficiente para los estudios de células de mamíferos quimiotaxis, pero las frecuencias adicionales puede proporcionar información en otros contextos 12,13. </li><li> Duración de la prueba total se puede establecer, en la mano derechapanel, o el experimento se puede detener manualmente, haciendo clic en &quot;Finalizar&quot; una vez que las células han desarrollado cierta resistencia que son indicativos de la llegada al electrodo. El tiempo que tarda para que las células llegan a la electrodo depende del tipo de célula utilizado. </li><li> Haga clic en &quot;Inicio&quot; para iniciar la recolección de datos. </li></ol> 7. Gestión de Datos <ol><li> Aunque los datos pueden ser exportados a Excel, el software de ECIS 1600R, que acompaña al sistema de ECISθ es el método más eficiente para analizar los datos de ECIS / taxis. </li><li> Los datos de software de análisis de barra de herramientas contiene los botones de radio Z, R y C. Se trata de determinar si la impedancia, la resistencia o capacitancia, respectivamente, se representa en el eje vertical contra el eje x (tiempo transcurrido). </li><li> ECIS / taxis de datos es más eficiente se demuestra como resistencia en el tiempo a 4.000 Hz. Las fluctuaciones rápidas de la resistencia, o microtransients (Figura 1), son una muestra del movimiento celular sobre el electrodo. Compilar, ohurgar en la basura r los puntos de datos a fin de que no todos los puntos se grafican, no se recomienda para ECIS / taxis, ya que microtransients promedio de los datos. </li><li> Una vez que el gráfico ha sido realizado con el software ECIS1600R, que pueden ser exportados por la elección de &quot;gráfico de exportación&quot; en el menú archivo, y se guarda como un archivo. Tif o. Jpg. </li></ol> 8. Los resultados representativos Cellular quimiotaxis es indicado por un aumento en la resistencia a 4.000 Hz. La llegada de las células en el electrodo de destino también está indicada por la aparición de fluctuaciones rápidas en la resistencia llamados microtransients o micromovimiento como se describe en Opp et. al., 2009 (Figura 1) 14. Un resultado negativo se indica por coherente, o un ligero descenso, en la resistencia a 4.000 Hz, como se ve en rojo en la Figura 1. La ausencia de microtransients es también un signo de una ausencia de movimiento de las células hacia el electrodo. El aumento de la resistencia es directamenteproporcional al número de las células que atraviesan el electrodo 10. La adición de anticuerpo monoclonal específico para un quimioatrayente o toxinas conocidas para interferir con los receptores acoplados a proteínas G pueden bloquear la quimiotaxis 11. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3840/3840fig1.jpg" /> Figura 1. La quimiotaxis de células Jurkat T humanos en respuesta a SDF1α. Las células Jurkat T (2.0x10 6 células / ml) fueron expuestos a un gradiente de SDF-1α (a partir de la concentración de 100 ng / ml) o medio RPMI 1640 como un control negativo. La resistencia normalizada a 4000 Hz se graficó. Humanos células Jurkat T movido en respuesta a SDF-1α, como lo demuestra el aumento de la resistencia y microtransients, mientras que ningún movimiento se observó con la exposición a RPMI 1640. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3840/3840fig2.jpg" /> Figura 2. Vista superior de un electrodo ECIS / taxis without agarosa. Cada electrodo ECIS / taxis está formado por 8 cámaras individuales. Cada cámara comparte un electrodo grande (una), y contiene un electrodo objetivo individual (b). Cada cámara también cuenta con 2 círculos de oro (c), que se utilizan como guía para cortar los pozos de la agarosa con las cánulas. Los cuadrados de oro (d) son las superficies de contacto que se conectan a los pasadores pogo con el fin de aplicar la corriente alterna al electrodo. Los electrodos objetivo individuales son cada uno en circuito con el electrodo contador mayor (e). <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3840/3840fig3.jpg" /> Figura 3. Dos pocillos se corta en cada cámara de agarosa-llenado. Cuando el quimioatrayente se añade a un bien se difunde para crear un gradiente en la agarosa, con la mayor concentración de chemoattract más cercano al quimioatrayente bien. Las células se desplazan por debajo de la agarosa hacia mayores concentraciones de quimioatrayente y puede pasar sobre el electrodo de destino. Comolas células cruzar el electrodo de destino, un aumento de la resistencia es registrado por el software ECIS 1600R. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3840/3840fig4.jpg" /> Figura 4. La inserción de dos cánulas de calibre 14 en plexiglás. A) A, B 5/64 &quot;broca se utiliza para afilar la punta de la cánula.) Dos agujeros deben ser perforados en metacrilato para dar cabida a las cánulas de calibre 14 de acuerdo con el disparo de diseño. C) Use un taladro para asegurar que los agujeros son perpendiculares a la superficie pleixglass. D) Dos cánulas afilado se insertan a través de ¼ &quot;de plexiglás, 2 mm de distancia (medida desde el borde interior). Estas cánulas afilado son cuidadosamente insertado en agarosa para cortar los pozos. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/3840/3840fig5.jpg" /> Figura 5. Alineación de cánulas con puntos de oro en el ECIS / taxis de la cámara. Para cortar los pozos, la cánula debe afiladoestar alineados con los puntos de oro que flanquean el electrodo de destino en el fondo de la cámara ECIS / taxis. La cánula se debe insertar verticalmente, sin ningún tipo de movimiento horizontal, y se retira de la misma manera.

<ol>
	<li>Boyden, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemotactic+effect+of+mixtures+of+antibody+and+antigen+on+polymorphonuclear+leucocytes.">The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes.</a> J. Exp. Med. 115, 453-466 (1962).</li><li>Lauffenburger, D. A., Tranquillo, R. T., Zigmond, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concentration+gradients+of+chemotactic+factors+in+chemotaxis+assays.">Concentration gradients of chemotactic factors in chemotaxis assays.</a> Methods Enzymol. 162, 85-101 (1988).</li><li>Nelson, R. D., Quie, P. G., Simmons, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotaxis+under+agarose:+a+new+and+simple+method+for+measuring+chemotaxis+and+spontaneous+migration+of+human+polymorphonuclear+leukocytes+and+monocytes.">Chemotaxis under agarose: a new and simple method for measuring chemotaxis and spontaneous migration of human polymorphonuclear leukocytes and monocytes.</a> J. Immunol. 115, 1650-1650 (1975).</li><li>Newton-Nash, D. K., Tonellato, P., Swiersz, M., Abramoff, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+chemokinetic+behavior+of+inflammatory+lung+macrophages+in+a+linear+under-agarose+assay.">Assessment of chemokinetic behavior of inflammatory lung macrophages in a linear under-agarose assay.</a> J. Leukoc. Biol. 48, 297-305 (1990).</li><li>Giaever, I., Keese, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+fibroblast+behavior+in+tissue+culture+with+an+applied+electric+field.">Monitoring fibroblast behavior in tissue culture with an applied electric field.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81, 3761-374 (1984).</li><li>Keese, C. G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Whole+Cell+Biosensor+bsed+on+Cell-Substrate+Interactions.">A Whole Cell Biosensor bsed on Cell-Substrate Interactions.</a> IEEE Engineering in Medicine and Biology Society. 12, 500-501 (1990).</li><li>Laevsky, G., Knecht, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-linking+of+actin+filaments+by+myosin+II+is+a+major+contributor+to+cortical+integrity+and+cell+motility+in+restrictive+environments.">Cross-linking of actin filaments by myosin II is a major contributor to cortical integrity and cell motility in restrictive environments.</a> J. Cell. Sci. 116, 3761-3770 (2003).</li><li>Condeelis, J., Bresnick, A., Demma, M., Dharmawardhane, S., Eddy, R., Hall, A. L., Sauterer, R., Warren, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+amoeboid+chemotaxis:+an+evaluation+of+the+cortical+expansion.">Mechanisms of amoeboid chemotaxis: an evaluation of the cortical expansion.</a> 11, 5-6 (1990).</li><li>Hadjout, N., Laevsky, G., Knecht, D. A., Lynes, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+real-time+measurement+of+chemotactic+cell+motility.">Automated real-time measurement of chemotactic cell motility.</a> Biotechniques. 31, 1130-1138 (2001).</li><li>Hadjout, N., Yin, X., Knecht, D. A., Lynes, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+real-time+measurements+of+leukocyte+chemotaxis.">Automated real-time measurements of leukocyte chemotaxis.</a> J. Immunol. Methods. 320, 70-80 (2007).</li><li>Yin, X., Knecht, D. A., Lynes, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metallothionein+mediates+leukocyte+chemotaxis.">Metallothionein mediates leukocyte chemotaxis.</a> BMC Immunol. 6, 21-21 (2005).</li><li>Lundien, M. C., Mohammed, K. A., Nasreen, N., Tepper, R. S., Hardwick, J. A., Sanders, K. L., Van Horn, R. D., Antony, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+MCP-1+expression+in+airway+epithelial+cells:+role+of+CCR2+receptor+in+airway+epithelial+injury.">Induction of MCP-1 expression in airway epithelial cells: role of CCR2 receptor in airway epithelial injury.</a> J. Clin. Immunol. 22, 144-152 (2002).</li><li>Zudaire, E., Cuesta, N., Murty, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+aryl+hydrocarbon+receptor+repressor+is+a+putative+tumor+suppressor+gene+in+multiple+human+cancers.">The aryl hydrocarbon receptor repressor is a putative tumor suppressor gene in multiple human cancers.</a> J. Clin. Invest. 118, 640-650 (2008).</li><li>Opp, D., Wafula, B., Lim, J., Huang, E., Lo, J. C., Lo, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+electric+cell-substrate+impedance+sensing+to+assess+in+vitro+cytotoxicity.">Use of electric cell-substrate impedance sensing to assess in vitro cytotoxicity.</a> Biosens. Bioelectron. 24, 2625-269 (2009).</li><li>Foxman, E. F., Kunkel, E. J., Butcher, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrating+conflicting+chemotactic+signals.+The+role+of+memory+in+leukocyte+navigation.">Integrating conflicting chemotactic signals. The role of memory in leukocyte navigation.</a> J. Cell. Biol. 147, 577-588 (1999).</li><li>Heit, B., Tavener, S., Raharjo, E., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+intracellular+signaling+hierarchy+determines+direction+of+migration+in+opposing+chemotactic+gradients.">An intracellular signaling hierarchy determines direction of migration in opposing chemotactic gradients.</a> J. Cell. Biol. 159, 91-102 (1999).</li></ol>

David A Knecht y Michael A Lynes tienen una patente concedida por la tecnología ECIS / taxis, la cual ha sido licenciada por la Universidad de Connecticut para Biofísica Aplicada, Inc.

Nuevas características de la prueba de ECIS / taxis incluyen su capacidad de automatizar la recopilación de datos en tiempo real, como las células responden a quimioatrayente. Aunque la aplicación más común de esta tecnología consiste en medir la respuesta celular a los gradientes quimiotácticos individuales, o de los gradientes de compuestos de mezclas de agonistas y antagonistas de la quimiotaxis, el enfoque de ECIS / taxis también es susceptible a las modificaciones de estas configuraciones que pueden ser mu...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre de Reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> ECIS Zθ </td><td> Biofísica Aplicada </td><td></td><td> <a href="http://www.biophysics.com/prodducts_Ecisz0.php">http://www.biophysics.com/prodducts_Ecisz0.php</a> </td></tr><tr><td> ECIS conjunto de electrodos </td><td> Biofísica Aplicada </td><td> 8W quimiotaxis </td><td> <a href="http://www.biophysics.com/cultureware.php">http://www.biophysics.com/cultureware.php</a> </td></tr><tr><td> Seakem GTG agarosa </td><td> BioWhittaker Molecular de aplicaciones </td><td> 50070 </td><td></td></tr><tr><td> RPMI1640 </td><td> Cellgro </td><td> 10-040 </td><td></td></tr><tr><td> HyClone de suero fetal bovino </td><td> Thermo Scientific </td><td> SH300703 </td><td></td></tr><tr><td> Penicillin / estreptomicina </td><td> MP Biomedicals </td><td> 1670049 </td><td> La penicilina 5.000 UI / ml; estreptomicina 5 mg / ml </td></tr><tr><td> Tampón HEPES </td><td> MP Biomedicals </td><td> 1688449 </td><td> Solución 1 M, célula grado cultura </td></tr><tr><td> 14 Gauge cánula de acero inoxidable (2) 4 pulgadas </td><td> Laboratorio General de Abastecimiento </td><td> 5-8365-1 </td><td> Punta roma </td></tr></tbody></table>

measurement of cellular chemotaxis with ecis/taxis

El movimiento celular en respuesta a los estímulos externos es fundamental para muchos procesos celulares, incluyendo la cicatrización de heridas, la inflamación y la respuesta a la infección. Un método común para medir la quimiotaxis es el ensayo de la cámara de Boyden, en el cual las células y quimioatrayentes están separados por una membrana porosa. Como las células migran a través de la membrana hacia el quimioatrayente, se adhieren a la parte inferior de la membrana, o una caída en los medios de comunicación subyacentes, y posteriormente se tiñeron y visualmente contado 1. En este método, las células se exponen a un gradiente quimioatrayente empinada y transitorios, que se piensa que es una representación pobre de gradientes encontrados en tejidos 2. Otro sistema de ensayo, el bajo-agarosa quimiotaxis ensayo, 3, 4 movimiento de las células medidas a través de un sustrato sólido en una delgada película acuosa que forma bajo la capa de agarosa. El gradiente que se desarrolla en la agarosa es poco profunda y se piensa que es una aplicaciónropriate representación de origen natural gradientes. La quimiotaxis puede ser evaluada por la imagen microscópica de la distancia recorrida. Tanto el ensayo de la cámara de Boyden y el ensayo de bajo-agarosa se suelen configurar como ensayos de punto final. El sistema automatizado de ECIS / taxis sistema combina el enfoque de menores de agarosa con detección de impedancia eléctrica de la célula-sustrato (ECIS) 5, 6. En este ensayo, los electrodos de destino se encuentra en cada una de 8 cámaras. Una gran contra-electrodo se ejecuta a través de cada una de las cámaras 8 (Figura 2). Cada cámara está llena de agarosa y dos pozos pequeños son el corte en la agarosa a cada lado del electrodo de destino. Uno así se llena con la población de células de prueba, mientras que el otro tiene las fuentes de quimioatrayente difusora (Figura 3). Actual pasa a través del sistema se puede utilizar para determinar el cambio en la resistencia que se produce como células pasan sobre el electrodo de destino. Las células en el objetivo electrode incrementar la resistencia del sistema 6. Además, las rápidas fluctuaciones en la resistencia representan cambios en las interacciones de las células con la superficie del electrodo y son indicativos de cambios en la forma en curso celulares. El sistema ECIS / taxis pueden medir el movimiento de la población celular en tiempo real durante períodos prolongados de tiempo, pero también es lo suficientemente sensible para detectar la llegada de una sola célula en el electrodo de destino. Dictyostelium discoidium se sabe que migran en presencia de un gradiente de folato 7, 8 y su respuesta quimiotáctica puede medir con precisión por ECIS / taxis 9. Quimiotaxis de los leucocitos, en respuesta a SDF1α y antagonistas de quimiotaxis También se ha medido con ECIS / taxis 10, 11. Un ejemplo de la respuesta de leucocitos a SDF1α se muestra en la Figura 1.

Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Cellular Chemotaxis with ECIS/Taxis at JoVE.com

Measurement of Cellular Chemotaxis with ECIS/Taxis

El sistema de ECIS / taxis es un sistema automatizado en tiempo real, análisis que mide la quimiotaxis celular. En este ensayo, las células se mueven por debajo de una capa de agarosa para llegar a un electrodo de destino. Movimiento celular se mide por la aparición de resistencia a 0 corriente alterna.

La medición de la quimiotaxis celular con ECIS / taxis

Cellular movement in response to external stimuli is fundamental to many cellular processes including wound healing, inflammation and the response to ...

measurement-of-cellular-chemotaxis-with-ecistaxis

Research

JoVE Journal

Biology

14.7K vistas.  University of Connecticut. El sistema de ECIS / taxis es un sistema automatizado en tiempo real, análisis que mide la quimiotaxis celular. En este ensayo, las células se mueven por debajo de una capa de agarosa para llegar a un electrodo de destino. Movimiento celular se mide por la aparición de resistencia a 0 corriente alterna.

Video: Measurement of Cellular Chemotaxis with ECIS/Taxis

Studies of Bacterial Chemotaxis Using Microfluidics - Interview

Los estudios de quimiotaxis bacteriana utilizando microfluídica - Entrevista

Investigación

Biología

A Microfluidic Device with Groove Patterns for Studying Cellular Behavior

We describe a microfluidic device with microgrooved patterns for studying cellular behavior. This microfluidic platform consists of a top fluidic channel and a bottom microgrooved substrate. To fabricate the microgrooved channels, a top poly(dimethylsiloxane) (PDMS) mold containing the impression of the microfluidic channels was aligned and bonded to a microgrooved substrate. Using this device, mouse fibroblast cells were immobilized and patterned within microgrooved substrates (25, 50, 75, and 100 &mu;m wide). To study apoptosis in a microfluidic device, media containing hydrogen peroxide, Annexin V, and propidium iodide was perfused into the fluidic channel for 2 hours. We found that cells exposed to the oxidative stress became apoptotic. These apoptotic cells were confirmed by Annexin V that bound to phosphatidylserine at the outer leaflet of the plasma membrane during the apoptosis process. Using this microfluidic device with microgrooved patterns, the apoptosis process was observed in real-time and analyzed by using an inverted microscope containing an incubation chamber (37&deg;C, 5% CO2). Therefore, this microfluidic device incorporated with microgrooved substrates could be useful for studying the cellular behavior and performing high-throughput drug screening.

We describe a protocol for the fabrication of microfluidic devices that can enable cell capture and culture. In this approach patterned microstructures such as grooves within microfluidic channels are used to create low shear stress regions within which cell can dock.

Un dispositivo de microfluidos con los patrones de Surco para el estudio del comportamiento celular

We describe a microfluidic device with microgrooved patterns for studying cellular behavior.  This microfluidic platform consists of a top fluidic channel ...

Making Patch-pipettes and Sharp Electrodes with a Programmable Puller

Glass microelectrodes (also called pipettes) have been a workhorse of electrophysiology for decades. Today, such pipettes are made from glass capillaries using a programmable puller. Such instruments heat the capillary using either a metal filament or a laser and draw out the glass using gravity, a motor or both. Pipettes for patch-clamp recording are formed using only heat and gravity, while sharp electrodes for intracellular recording use a combination of heat, gravity, and a motor. The procedure used to make intracellular recording pipettes is similar to that used to make injection needles for a variety of applications, including cRNA injection into Xenopus oocytes. In general, capillary glass &lt;1.2 mm in diameter is used to make pipettes for patch clamp recording, while narrower glass is used for intracellular recording (outer diameter = 1.0 mm). For each tool, the puller is programmed slightly differently. This video shows how to make both kinds of recording pipettes using pre-established puller programs.

This video shows how to use a programmable puller to make patch pipettes and sharp electrodes for electrophysiology. The same procedure can be used to make a variety of glass tools, including injection needles.

Hacer patch pipetas y electrodos de Sharp con un extractor programable

Glass microelectrodes (also called pipettes) have been a workhorse of electrophysiology for decades.  Today, such pipettes are made from glass capillaries ...

Identification of protein complexes with quantitative proteomics in S. cerevisiae

Lipids are the building blocks of cellular membranes that function as barriers and in compartmentalization of cellular processes, and recently, as important intracellular signalling molecules. However, unlike proteins, lipids are small hydrophobic molecules that traffic primarily by poorly described nonvesicular routes, which are hypothesized to occur at membrane contact sites (MCSs). MCSs are regions where the endoplasmic reticulum (ER) makes direct physical contact with a partnering organelle, e.g., plasma membrane (PM). The ER portion of ER-PM MCSs is enriched in lipid-synthesizing enzymes, suggesting that lipid synthesis is directed to these sites and implying that MCSs are important for lipid traffic. Yeast is an ideal model to study ER-PM MCSs because of their abundance, with over 1000 contacts per cell, and their conserved nature in all eukaryotes. Uncovering the proteins that constitute MCSs is critical to understanding how lipids traffic is accomplished in cells, and how they act as signaling molecules. We have found that an ER called Scs2p localize to ER-PM MCSs and is important for their formation. We are focused on uncovering the molecular partners of Scs2p. Identification of protein complexes traditionally relies on first resolving purified protein samples by gel electrophoresis, followed by in-gel digestion of protein bands and analysis of peptides by mass spectrometry. This often limits the study to a small subset of proteins. Also, protein complexes are exposed to denaturing or non-physiological conditions during the procedure. To circumvent these problems, we have implemented a large-scale quantitative proteomics technique to extract unbiased and quantified data. We use stable isotope labeling with amino acids in cell culture (SILAC) to incorporate staple isotope nuclei in proteins in an untagged control strain. Equal volumes of tagged culture and untagged, SILAC-labeled culture are mixed together and lysed by grinding in liquid nitrogen. We then carry out an affinity purification procedure to pull down protein complexes. Finally, we precipitate the protein sample, which is ready for analysis by high-performance liquid chromatography/ tandem mass spectrometry. Most importantly, proteins in the control strain are labeled by the heavy isotope and will produce a mass/ charge shift that can be quantified against the unlabeled proteins in the bait strain. Therefore, contaminants, or unspecific binding can be easily eliminated. By using this approach, we have identified several novel proteins that localize to ER-PM MCSs. Here we present a detailed description of our approach. 

Here we describe a new quantitative proteomics technique for identifying protein complexes in Saccharomyces cerevisiae. In this study, we have used the SILAC method together with affinity purification followed by tandem mass spectrometry to identify with high specificity the binding partners of an ER protein, Scs2p.

Identificación de los complejos de proteínas con la proteómica cuantitativa en S. cerevisiae

Lipids are the building blocks of cellular membranes that function as barriers and in compartmentalization of cellular processes, and recently, as ...

Imaging Exocytosis in Retinal Bipolar Cells with TIRF Microscopy

Total internal reflectance fluorescence (TIRF) microscopy is a technique that allows the study of events happening at the cell membrane, by selective imaging of fluorescent molecules that are closest to a high refractive index substance such as glass1. In this article, we apply this technique to image exocytosis of synaptic vesicles in retinal bipolar cells isolated from the goldfish retina. These neurons are very suitable for this kind of study due to their large axon terminals. By simultaneously patch clamping the bipolar cells, it is possible to investigate the relationship between pre-synaptic voltage and synaptic release2,3. Synaptic vesicles inside the bipolar cell terminals are loaded with a fluorescent dye (FM 1-43&reg;) by co-puffing the dye and a ringer solution containing a high K+ concentration onto the synaptic terminals. This depolarizes the cells and stimulates endocytosis and consequent dye uptake into the glutamatergic vesicles. After washing the excess dye away for around 30 minutes, cells are ready for being patch clamped and imaged simultaneously with a 488 nm laser. The patch pipette solution contains a rhodamine-based peptide that binds selectively to the synaptic ribbon protein RIBEYE4, thereby labeling ribbons specifically when terminals are imaged with a 561 nm laser. This allows the precise localization of active zones and the separation of synaptic from extra-synaptic events.

In this video, we demonstrate how to label and visualize single synaptic vesicle exocytosis and trafficking in goldfish retinal bipolar cells using total internal reflectance fluorescence (TIRF) microscopy.

Imágenes de exocitosis en las células bipolares de retina con microscopía TIRF

Total internal reflectance fluorescence (TIRF) microscopy is a technique that allows the study of events happening at the cell membrane, by selective ...

A Microfluidic Device for Quantifying Bacterial Chemotaxis in Stable Concentration Gradients

Chemotaxis allows bacteria to approach sources of attractant chemicals or to avoid sources of repellent chemicals. Bacteria constantly monitor the concentration of specific chemoeffectors by comparing the current concentration to the concentration detected a few seconds earlier. This comparison determines the net direction of movement. Although multiple, competing gradients often coexist in nature, conventional approaches for investigating bacterial chemotaxis are suboptimal for quantifying migration in response to concentration gradients of attractants and repellents. Here, we describe the development of a microfluidic chemotaxis model for presenting precise and stable concentration gradients of chemoeffectors to bacteria and quantitatively investigating their response to the applied gradient. The device is versatile in that concentration gradients of any desired absolute concentration and gradient strength can be easily generated by diffusive mixing. The device is demonstrated using the response of Escherichia coli RP437 to gradients of amino acids and nickel ions.

This protocol describes the development of a microfluidic device for investigating bacterial chemotaxis in stable concentration gradients of chemoeffectors.

Un dispositivo de microfluidos para la cuantificación de la quimiotaxis bacteriana en gradientes de concentración estable

Chemotaxis allows bacteria to approach sources of attractant chemicals or to avoid sources of repellent chemicals. Bacteria constantly monitor the ...

Imaging G-protein Coupled Receptor (GPCR)-mediated Signaling Events that Control Chemotaxis of Dictyostelium Discoideum

Many eukaryotic cells can detect gradients of chemical signals in their environments and migrate accordingly 1. This guided cell migration is referred as chemotaxis, which is essential for various cells to carry out their functions such as trafficking of immune cells and patterning of neuronal cells 2, 3. A large family of G-protein coupled receptors (GPCRs) detects variable small peptides, known as chemokines, to direct cell migration in vivo 4. The final goal of chemotaxis research is to understand how a GPCR machinery senses chemokine gradients and controls signaling events leading to chemotaxis. To this end, we use imaging techniques to monitor, in real time, spatiotemporal concentrations of chemoattractants, cell movement in a gradient of chemoattractant, GPCR mediated activation of heterotrimeric G-protein, and intracellular signaling events involved in chemotaxis of eukaryotic cells 5-8. The simple eukaryotic organism, Dictyostelium discoideum, displays chemotaxic behaviors that are similar to those of leukocytes, and D. discoideum is a key model system for studying eukaryotic chemotaxis. As free-living amoebae, D. discoideum cells divide in rich medium. Upon starvation, cells enter a developmental program in which they aggregate through cAMP-mediated chemotaxis to form multicullular structures. Many components involved in chemotaxis to cAMP have been identified in D. discoideum. The binding of cAMP to a GPCR (cAR1) induces dissociation of heterotrimeric G-proteins into G&gamma; and G&beta;&gamma; subunits 7, 9, 10. G&beta;&gamma; subunits activate Ras, which in turn activates PI3K, converting PIP2 into PIP3 on the cell membrane 11-13. PIP3 serve as binding sites for proteins with pleckstrin Homology (PH) domains, thus recruiting these proteins to the membrane 14, 15. Activation of cAR1 receptors also controls the membrane associations of PTEN, which dephosphorylates PIP3 to PIP2 16, 17. The molecular mechanisms are evolutionarily conserved in chemokine GPCR-mediated chemotaxis of human cells such as neutrophils 18. We present following methods for studying chemotaxis of D. discoideum cells. 1. Preparation of chemotactic component cells. 2. Imaging chemotaxis of cells in a cAMP gradient. 3. Monitoring a GPCR induced activation of heterotrimeric G-protein in single live cells. 4. Imaging chemoattractant-triggered dynamic PIP3 responses in single live cells in real time. Our developed imaging methods can be applied to study chemotaxis of human leukocytes.

Imaging G-protein Coupled Receptor GPCR-mediated Signaling Events that Control Chemotaxis of Dictyostelium Discoideum

Here, we describe detailed live cell imaging methods for investigating chemotaxis. We present fluorescence microscopic methods to monitor spatiotemporal dynamics of signaling events in migrating cells. Measurement of signaling events permits us to further understand how a GPCR-signaling network achieves gradient sensing of chemoattractants and controls directional migration of eukaryotic cells.

Receptor de imagen acoplados a proteína G (GPCR) mediada por eventos de señalización que la quimiotaxis de control de Dictyostelium discoideum</em

Many eukaryotic cells can detect gradients of chemical signals in their environments and migrate accordingly 1.  This guided cell migration is referred as ...

Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster

Aging is a phenomenon that results in steady physiological deterioration in nearly all organisms in which it has been examined, leading to reduced physical performance and increased risk of disease. Individual aging is manifest at the population level as an increase in age-dependent mortality, which is often measured in the laboratory by observing lifespan in large cohorts of age-matched individuals. Experiments that seek to quantify the extent to which genetic or environmental manipulations impact lifespan in simple model organisms have been remarkably successful for understanding the aspects of aging that are conserved across taxa and for inspiring new strategies for extending lifespan and preventing age-associated disease in mammals.
The vinegar fly, Drosophila melanogaster, is an attractive model organism for studying the mechanisms of aging due to its relatively short lifespan, convenient husbandry, and facile genetics. However, demographic measures of aging, including age-specific survival and mortality, are extraordinarily susceptible to even minor variations in experimental design and environment, and the maintenance of strict laboratory practices for the duration of aging experiments is required. These considerations, together with the need to practice careful control of genetic background, are essential for generating robust measurements. Indeed, there are many notable controversies surrounding inference from longevity experiments in yeast, worms, flies and mice that have been traced to environmental or genetic artifacts1-4. In this protocol, we describe a set of procedures that have been optimized over many years of measuring longevity in Drosophila using laboratory vials. We also describe the use of the dLife software, which was developed by our laboratory and is available for download (<a href="http://sitemaker.umich.edu/pletcherlab/software">http://sitemaker.umich.edu/pletcherlab/software</a>). dLife accelerates throughput and promotes good practices by incorporating optimal experimental design, simplifying fly handling and data collection, and standardizing data analysis. We will also discuss the many potential pitfalls in the design, collection, and interpretation of lifespan data, and we provide steps to avoid these dangers.

Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster is a powerful model organism for exploring the molecular basis of longevity regulation. This protocol will discuss the steps involved in generating a reproducible, population-based measurement of longevity as well as potential pitfalls and how to avoid them.

Medición de la esperanza de vida en<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Aging is a phenomenon that results in steady physiological deterioration in nearly all organisms in which it has been examined, leading to reduced ...

C. elegans Chemotaxis Assay

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates. Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis behavior.
 The premise behind testing the response of the worms to an odorant is to place them in an area and observe the movement evoked in response to an odorant. Even with the many available assays, optimizing worm starting location relative to both the control and test areas, while minimizing the interaction of worms with each other, while maintaining a significant sample size remains a work in progress 1-10. The method described here aims to address these issues by modifying the assay developed by Bargmann et al.1. A Petri dish is divided into four quadrants, two opposite quadrants marked "Test" and two are designated "Control". Anesthetic is placed in all test and control sites. The worms are placed in the center of the plate with a circle marked around the origin to ensure that non-motile worms will be ignored. Utilizing a four-quadrant system rather than one 2 or two 1 eliminates bias in the movement of the worms, as they are equidistant from test and control samples, regardless of which side of the origin they began. This circumvents the problem of worms being forced to travel through a cluster of other worms to respond to an odorant, which can delay worms or force them to take a more circuitous route, yielding an incorrect interpretation of their intended path. This method also shows practical advantages by having a larger sample size and allowing the researcher to run the assay unattended and score the worms once the allotted time has expired.

C. elegans Chemotaxis Assay

A method of quantitatively evaluating the chemotactic response of Caenorhabditis elegans is described. A chemotactic index (CI) was employed as a way to precisely evaluate the response of worms to certain targets, and serve as a platform of comparison between strains and compounds of interest.

C. elegans Ensayo de quimiotaxis

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates.  Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis ...

Imaging G Protein-coupled Receptor-mediated Chemotaxis and its Signaling Events in Neutrophil-like HL60 Cells

Eukaryotic cells sense and move towards a chemoattractant gradient, a cellular process referred as chemotaxis. Chemotaxis plays critical roles in many physiological processes, such as embryogenesis, neuron patterning, metastasis of cancer cells, recruitment of neutrophils to sites of inflammation, and the development of the model organism Dictyostelium discoideum. Eukaryotic cells sense chemo-attractants using G protein-coupled receptors. Visual chemotaxis assays are essential for a better understanding of how eukaryotic cells control chemoattractant-mediated directional cell migration. Here, we describe detailed methods for: 1) real-time, high-resolution monitoring of multiple chemotaxis assays, and 2) simultaneously visualizing the chemoattractant gradient and the spatiotemporal dynamics of signaling events in neutrophil-like HL60 cells.

Visual chemotaxis assays are essential for a better understanding of how eukaryotic cells control chemoattractant-mediated directional cell migration. Here, we describe detailed methods for: 1) real-time, high-resolution monitoring of multiple chemotaxis assays, and 2) simultaneously visualizing the chemoattractant gradient and the spatiotemporal dynamics of signaling events in neutrophil-like HL60 cells.

Imaging G acoplados a proteínas mediada por el receptor de quimiotaxis y sus eventos de señalización en células HL60 neutrófilos como

Eukaryotic cells sense and move towards a chemoattractant gradient, a cellular process referred as chemotaxis. Chemotaxis plays critical roles in many ...