Name: c. elegans chemotaxis assay
Uploaded: 2013-04-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 28 s
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우리는 생명 과학이 작업에 자금을위한 여왕의 대학에서 예술과 과학의 학부 감사합니다. 뿐만 아니라, 우리는 필요한 시약, 장비 및 기술 지원을 제공하기 위해 턱 상 실험실을 감사드립니다. 우리는 또한 토론에 대한 그의 공헌 그는 특히 토니, QGEM 2011 감사합니다.

1. 벌레를 준비 / 세척 <ol><li> 젊은 성인 11 벌레를 동기화 할 수 있습니다. </li><li> 의 5 센티미터 주 화성의 접시에 S의 기초의 피펫 2 ㎖은 OP50 E.의 잔디를 취소 한 벌레를 개최 대장균. 웜이 버퍼에 플레이트 표면 세척하기 위해 필요한 접시를 기울이십시오. </li><li> microcentrifuge 관에 벌레-S 기초 솔루션의 피펫 1 ML. </li><li> 10 초는 6,600 rpm에서 PicoFuge를 사용하는 원심 분리기. </li><li> 그대로 벌레의 펠렛을 남겨 S의 기초를 대기음. </li><li> 벌레를 씻어 몇 번 반전, microcentrifuge 관에 1 ML S 기초 솔루션을 추가합니다. </li><li> 단계 1.4-1.6 다른 세 번 반복합니다. </li><li> 10 초 다섯 번째, 캘리포니아의 최종 볼륨에 상층 액을 흡입이 시간을 원심 분리기. 100 μL. </li><li> 각 2 μL 샘플 50 ~ 250 벌레가 보장 NGM 접시에 벌레의 피펫 2 μL. 조정S의 기초의 작은 또는 더 큰 볼륨 벌레를 현탁하여 필요에 따라 S의 기초에있는 벌레의 농도. </li><li> 즉시 1 시간에 대한 웜 세척 후 분석에 웜을 사용합니다. </li></ol> 2. 테스트 플레이트를 준비 <ol><li> 5cm 플레이트의 아래쪽에 표시 4 같은 사분면에 요리를 나눕니다. 화성 한천 또는 NGM를 사용할 수 있습니다. 3 시험의 최소 시험되는 유전자 변형 당 필요합니다. </li><li> 원점을 반경 0.5 cm (그림 1)의 원을 표시합니다. </li><li> &quot;테스트&quot;또는 사이트 기원과 서로 등거리 있는지 확인하는 &quot;C&quot; &quot;컨트롤&quot;에 대한 하나 &quot;T&quot;각 사분면에있는 점을 표시합니다. 포인트 cm 이상 떨어져 원점에서해야합니다. 테스트 사분면과 오른쪽 상단 컨트롤 등 왼쪽 아래 사분면 (그림 1)과 같이 왼쪽 상단과 오른쪽 하단 사분면을 표시합니다. </li></ol> 3. 분석을 실행 </P&gt; <ol><li> 시험 화합물 및 0.5 M 지드 (마취 사분면에 도달시 벌레를 체포하는 데 사용)의 동일한 볼륨을 결합하여 테스트 솔루션을 섞는다. 0.5 M 지드와 시험 화합물을 희석하는 데 사용되는 용매를 결합하여 제어 솔루션을 섞는다. </li><li> 원래 위에 펠렛에서 웜 용액 (1.8에서 준비) (두 선이 교차)의 피펫 2 μL. </li><li> 두 개의 &quot;T&quot;사이트 상 시험 용액의 직후, 피펫 2 μL. 마찬가지로, 두 개의 &quot;C&quot;사이트에 제어 솔루션의 동일한 금액을 피펫. </li><li> 웜 및 악취 물질 방울 한천에 흡수되고 나면, 뚜껑을 교체하고 번호판을 반전. </li><li> 60 분 후 4 ° C 배양기에서 벌레를 배치합니다. 이 계산 될 수있는 경우에만 인큐베이터에서 접시를 제거합니다. 실온에서 벌레를두면 그들을 다시 동원 할 수 있습니다. </li><li> 완전히 내부 CIRC를 넘어 각 사분면에있는 벌레의 수를 기록르. </li><li> 테스트 및 제어 사분면 모두에서 제어 솔루션을 사용하여 단계 3.2-3.6를 반복합니다. 이 컨트롤 플레이트 될 것입니다. 이러한 세 판을 제작하고 적절한 제어 역할을 실행해야합니다. </li></ol> 4. 점수 해석 / 주 화성 지수를 결정 <ol><li> 식 1을 사용하여 화성 인덱스를 계산합니다. 이 -1.0과 +1.0 사이의 화학 주성 인덱스를 얻을 것입니다. </li></ol> (1) 화성 지수 = (테스트 사분면 둘 중 웜 - 모두 제어 사분면에있는 # 웜) / (득점 웜 # 총) +1.0 점수는 대상을 향해 최대한의 매력을 나타내며 화학 대상을 포함하는 사분면에 도착 웜의 100 %를 나타냅니다. -1.0의 인덱스는 최대 반발의 증거입니다. 유사한 분석 방법은 이미 3 (표 1)을 채택하고 있습니다. <ol start="2"><li> 평균 Chemotaxi 신고의 지수 (CI)와 표준 오차 (SEM) 의미합니다. 학생의 T-테스트는 테스트 및 컨트롤 플레이트에서 데이터를 비교 수행합니다. </li></ol>

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	<li>Bargmann, C. I., Hartwieg, E., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Odorant-selective+genes+and+neurons+mediate+olfaction+in+C.+elegans.">Odorant-selective genes and neurons mediate olfaction in C. elegans.</a> Cell. 74, 515-527 (1993).</li><li>Bargmann, C. I., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemosensory+neurons+with+overlapping+functions+direct+chemotaxis+to+multiple+chemicals+in+C.+elegans.">Chemosensory neurons with overlapping functions direct chemotaxis to multiple chemicals in C. elegans.</a> Neuron. 7, 729-742 (1991).</li><li>Lee, J., Jee, C., McIntire, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ethanol+preference+in+C.+elegans.">Ethanol preference in C. elegans.</a> Genes Brain Behav. 8, 578-585 (2009).</li><li>Swierczek, N. A., Giles, A. C., Rankin, C. H., Kerr, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+behavioral+analysis+in+C.+elegans.">High-throughput behavioral analysis in C. elegans.</a> Nat. Methods. 8, 592-598 (2011).</li><li>Ward, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotaxis+by+the+nematode+Caenorhabditis+elegans:+identification+of+attractants+and+analysis+of+the+response+by+use+of+mutants.">Chemotaxis by the nematode Caenorhabditis elegans: identification of attractants and analysis of the response by use of mutants.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 70, 817-821 (1973).</li><li>Colbert, H. A., Bargmann, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Odorant-specific+adaptation+pathways+generate+olfactory+plasticity+in+C.+elegans.">Odorant-specific adaptation pathways generate olfactory plasticity in C. elegans.</a> Neuron. 14, 803-812 (1995).</li><li>Kauffman, A., Parsons, L., Stein, G., Wills, A., Kaletsky, R., Murphy, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C.+elegans+Positive+Butanone+Learning,+Short-term,+and+Long-term+Associative+Memory+Assays.">C. elegans Positive Butanone Learning, Short-term, and Long-term Associative Memory Assays.</a> J. Vis. Exp. (49), e2490 (2011).</li><li>Troemel, E. R., Kimmel, B. E., Bargmann, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+chemotaxis+responses:+sensory+neurons+define+olfactory+preferences+in+C.+elegans.">Reprogramming chemotaxis responses: sensory neurons define olfactory preferences in C. elegans.</a> Cell. 91, 161-169 (1997).</li><li>Pierce-Shimomura, J. T., Morse, T. M., Lockery, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fundamental+role+of+pirouettes+in+Caenorhabditis+elegans+chemotaxis.">The fundamental role of pirouettes in Caenorhabditis elegans chemotaxis.</a> J Neurosci. 19, 9557-9569 (1999).</li><li>Frokjaer-Jensen, C., Ailion, M., Lockery, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ammonium-acetate+is+sensed+by+gustatory+and+olfactory+neurons+in+Caenorhabditis+elegans.">Ammonium-acetate is sensed by gustatory and olfactory neurons in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS One. 3, e2467 (2008).</li><li>Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cer&#243;n, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+Caenorhabditis+elegans+Methods:+Synchronization+and+Observation.">Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation.</a> J. Vis. Exp. (64), e4019 (2012).</li><li>Sengupta, P., Bargmann, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+fate+specification+and+differentiation+in+the+nervous+system+of+Caenorhabditis+elegans.">Cell fate specification and differentiation in the nervous system of Caenorhabditis elegans.</a> Dev. Genet. 18, 73-80 (1996).</li><li>Hart, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavior.">Behavior.</a> WormBook. , (1895).</li></ol>

우리는 공개 아무것도 없어.

화성은 신경 및 세포 메커니즘의 복잡한 집합에 의해 제어하지만, 쉽게 객관적으로 화성 분석을 사용하여 정량화 할 수있다. 분석에서 최상의 결과를 얻으려면, 중요한 특정 단계를 수행해야합니다. 첫째, 벌레를 준비하는 것은 일관성있는 실험 결과를 산출 필수적이다. 서로 다른 삶의 단계에서 웜 다르게 13 동작, 그래서 혼합 단계 웜 왜곡 될 실험 결과. 둘째, 모든 E. 보장 잔류 ?...

워드는 첫 번째 1973 5 화성 분석을 개발하고, 그 이후 지금까지 도달하는 응용 프로그램을 가지고 있습니다. 신경 생물학은 화성 분석의 다양한 사용의 혜택을있는 하나의 필드입니다. 후각 적응, 학습과 기억의 간단한 형태는 C로 입증되었습니다 화성 분석하기 6을 사용 엘레 간스. 그들은 또한 표시하는 데 사용되었는지 C. 엘레 에탄올 벌레의 행동 가소성을 보여줍니다뿐만 아니라 허용 오차 결과를 개발할 수 있지만, 또한 벌레가 인간 3 알코올 의존의 연구에 매우 유용 할 수 있음을 보여줍니다. 분석 심지어 C의 능력을 입증하기 위해 개발되었습니다 엘레은 협회가 chemoattractants과 음식 (OP50) 7 사이의 웜에 의해 만들어진 것을 보여 단기 및 장기 기억 저장합니다. 또한 C.에 대한 현재 사용 가능한 광범위한 정보를 제공 elegans의 게놈 chemotaxiC. s의 동작 엘레은 돌연변이에게 1,8를 유도하여 여러 번 변경되었습니다. 여기에는 C의 개발과 같은 많은 흥미로운 기술의 가능성에 대한 수 생물학적 도구로 엘레 간스. 따라서, 1973 년 화성 분석의 초기 개발 이후, 그것은 자주 변경하고 다양한 분야의 신비를 해명하는 데 사용되었습니다. 일부 분석은 목표를 향해 웜에 의해 수행되는 특정 경로를 발견하는 것을 목표. 이런 종류의 원형 분석은 구청 5에 의해 개발되었다. 세 가지 웜은 15 분 동안 녹인 한천에 배치했다. 그들의 움직임들은 판의 중앙에 유인에 그라데이션까지 접시의 주변에서 여행으로 그들이 떠난 인장으로 추적했다. 접시에 모든 벌레는 각 재판의 끝에서 클로로포름을 사용하여 체포되었다. 이 방법의 한 자손은 유인하고 컨트롤과 접시의 중간에 하나 벌레를 배치기원 2에서 t 같고 반대 거리. 피어스 - 시모무라 하였다. 화성 9에 관련된 운동의 정확한 특성을 관찰하는 분석을 개발했다. 개별 웜은 유인의 소스에 culminating, 9cm 페트리 접시 유인 또는 방사형 모양의 그라데이션의 균일 한 농도를 포함하는 하나에 배치되었다. 벌레를 인식하는 컴퓨터 소프트웨어 프로그램은 관찰 된 행동을 기록하는 데 사용되었다. 현미경에 부착 된 비디오 카메라는 분석이 웜이 시야에 남아 보장하기 위해 실행 자동으로 페트리 접시를 조정하는 단계와 함께했다. 이것으로부터,보다 자세한 정보는 C.에 의해 표시되는 피 루엣의 원인에 관한 발견 엘레 간스. 여기에 설명 된 하나 이상의 유사한 다른 분석은 시험 물질에 웜의 큰 인구의 응답을 테스트했습니다. 두 사분면 화성 분석 실험했습니다다양한 신경, 수용체 및 신호 전달 분자가 때 C를 연주하는 역할을 탐구하는 데 사용 엘레은 다양한 화합물의 1에 노출되었다. 20-50 사이의 세척 웜 마취, 나트륨 아 지드 (NaN의 3)과 함께 극 끝에서 유인 및 제어 플레이트의 중앙 근처에 배치되었다. 60 분 후, -1.0에서 +1.0 사이의 값을 가진 화성 인덱스 유인 나 컨트롤에 부착 된 얼마나 많은 벌레의 차이에 따라 생성되었습니다. 이전의 분석은 엄격하게 비 운동성이 웜을 평가하는 데 실패하더라도 유사한 화학 주성 인덱스는이 문서에서보고 된 분석에 사용되었다. 이 분석은 다음 추가 화성에 신경 절제의 효과를 시험에 적용되었다. 100-200 벌레는 네 개의 사분면 3를 포함하는 접시의 중앙에 배치 된 위치를 앞서 언급 한 분석의 또 다른 변형이 수행되었다. 인접 사분면은 하나 또는 시험을 포함물질을 제어 할 수 있습니다. 이전 분석에서와 같이, 웜 득점되기 전에 지드 화 나트륨의 작용에 의해 고정되었다. 유사한 방법은 C.의 반응을 평가하는 방법으로 여기에 설명되어 있습니다 다양한 화합물 엘레 간스. 그러나 아래의 방법은 움직 웜 휴대 분리 임계 거리를 통과 한 웜을 평가 이점이 있습니다. 다른 분석은 움직 벌레를 무시 유사 지침을 통합했다. Frøkjær-젠슨 하였다. 휘발성과 물을 모두 수용성 화합물이 10을 테스트하는 데 사용할 수있는 다양한 분석을 개발했다. 페트리 접시는 네 개의 사분면으로 분할되었다. 상단과 하단 사분면 용제를 포함하지 않았다. 왼쪽 사분면 물을 포함하고, 오른쪽 유인이 포함되어 있습니다. 수용성 화합물은 AGA에 직접 배치 된 반면, 휘발성 악취를 테스트 할 때, 분석이 적절한 사분면을 통해, 접시의 뚜껑에 배치 된R. C.의 화학 주성 반응을 평가하기위한 현재 존재 방법 엘레은 지속적으로 사용, 효율성 및 정확성의 용이성을 최적화하기 위해 세련되고있다. 여기에 설명 된 분석이 웜의 가장 큰 수 (. 최대 처리량 : 250 웜 / 판 시간당, Lee 등 3에 의해 입증 처리량보다 약간 큰) 평가의 기능을 가지고있는 동안 따라서,이 방법의 진짜 힘은 이전 분석 (표 1)의 여러 속성의 간결한 절정.

<table><tbody><tr><td>S Basal (- cholesterol) [5.8 g NaCl; 1 M K phosphate buffer, pH 6.0; dH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O to 1 liter.] Autoclave</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PicoFuge</td><td>Stratagene</td><td>400552</td><td></td></tr><tr><td>Microscopes</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dissecting</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>P1000 Pipette</td><td>Gilson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>P10 Pipette</td><td>Gilson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.5 M Sodium Azide</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chemotaxis Agar [1.6% BBL-agar (Benton-Dickinson) or 2% Difco-agar. Autoclave. Add 5 mM potassium phosphate, pH 6.0; 1 mM CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, 1 mM MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;]</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ethanol/Distilled Water</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Test Compounds (eg. 0.5% diacetyl)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Bio-Rad</td><td>166-0600</td><td></td></tr><tr><td>NH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;Cl</td><td>Amresco</td><td>CA97062-046</td><td></td></tr><tr><td>MOPS</td><td>VWR</td><td>CA12001-120</td><td></td></tr><tr><td>NH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;OH</td><td>BDH</td><td>CABDH8641-2</td><td></td></tr><tr><td>0.25% Tween 20</td><td>Bio-Rad</td><td>170-6531</td><td></td></tr></tbody></table>

c. elegans chemotaxis assay

많은 생물 화성은 음식 근원을 추구 유해 물질을 피하고, 짝을 찾기 위해 사용합니다. Caenorhabditis의 엘레 인상적 화성 동작이 있습니다. 악취 물질에 웜의 반응을 테스트 뒤에 전제는 지역에 배치하고 악취 물질에 대한 응답으로 유발의 움직임을 관찰하는 것입니다. 도 사용할 수있는 많은 분석과 함께, 중요한 샘플 크기를 유지하면서 서로 웜의 상호 작용을 최소화하면서, 제어 및 시험 영역 모두에 상대적인 시작 위치 웜 최적화가 진행 1-10 작업 남아있다. 여기에 설명 된 방법은 Bargmann 등 1.에 의해 개발 된 분석을 수정하여 이러한 문제를 해결하는 것을 목표로하고있다. 페트리 접시는 네 개의 사분면으로 나누어 져 있습니다, &quot;테스트&quot;두 표시된 두 개의 반대 사분면은 &quot;컨트롤&quot;을 지정합니다. 마취는 모든 테스트 및 제어 장소에 배치됩니다. 웜 circl와 접시의 중앙에 배치됩니다E는 비 운동성이 웜은 무시 될 수 있도록하기 위해 원점을 표시했다. 4 - 쿼드런트 시스템을 활용하여보다 한 2 개의 1에 관계없이 시작 원산지 어느 쪽의, 그들은 테스트 및 컨트롤 샘플에서 등거리로 웜의 움직임에 편견을 제거합니다. 이 웜을 지연 시키거나 그들의 의도 된 경로의 잘못된 해석을 항복, 더 우회 길을하도록 할 수 있습니다 악취 물질에 응답하기 위해 다른 웜의 클러스터를 통해 여행 강제 웜의 문제를 우회. 또한이 방법은 큰 샘플 크기를 가지고 있으며 연구원 무인 분석을 실행하고 할당 된 시간이 만료되면 웜 점수를함으로써 실질적인 이점을 보여줍니다.

야생형 (N2) C. 비교 ODR-10 (KY10) 돌연변이로 엘레 간스. 우리는 알려진 C를 디 아세틸 사용 엘레은 화학 주성, 디 아세틸 1,12에 대한 수용체를 부족 돌연변이의에 야생형 벌레를 비교. 야생형 (N2) 웜에 대한 화학 주성 지수는 에탄올 및 0.839-0.100 ± 0.066이었다 ± 0.031-0.5 % 디 아세틸. 예상대로, 디 아세틸은 야생 형 웜 (P &lt;0.003)에서 유의 한 ch...

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C. elegans Chemotaxis Assay

정량의 화학 주성 반응을 평가하는 방법<em&gt; Caenorhabditis의 엘레</em&gt;이 설명되어 있습니다. 화성 지수 (CI)가 정확하게 특정 대상에 웜의 반응을 평가하고, 균주 및 그 화합물의 비교의 플랫폼으로 제공하는 방법으로 사용 하였다.

C. elegans의 주 화성 분석

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates.  Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis ...

Research

JoVE Journal

Biology

C. elegans Chemotaxis Assay

45.6K 조회수.  Queen's University. 정량의 화학 주성 반응을 평가하는 방법 Caenorhabditis의 엘레이 설명되어 있습니다. 화성 지수 (CI)가 정확하게 특정 대상에 웜의 반응을 평가하고, 균주 및 그 화합물의 비교의 플랫폼으로 제공하는 방법으로 사용 하였다.

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C. elegans Positive Butanone Learning, Short-term, and Long-term Associative Memory Assays

The memory of experiences and learned information is critical for organisms to make choices that aid their survival. C. elegans navigates its environment through neuron-specific detection of food and chemical odors1, 2, and can associate nutritive states with chemical odors3, temperature4, and the pathogenicity of a food source5.
Here, we describe assays of C. elegans associative learning and short- and long-term associative memory. We modified an aversive olfactory learning paradigm6 to instead produce a positive response; the assay involves starving ~400 worms, then feeding the worms in the presence of the AWC neuron-sensed volatile chemoattractant butanone at a concentration that elicits a low chemotactic index (similar to Toroyama et al.7). A standard population chemotaxis assay1 tests the worms' attraction to the odorant immediately or minutes to hours after conditioning.
After conditioning, wild-type animals' chemotaxis to butanone increases ~0.6 Chemotaxis Index units, its "Learning Index". Associative learning is dependent on the presence of both food and butanone during training. Pairing food and butanone for a single conditioning period ("massed training") produces short-term associative memory that lasts ~2 hours. Multiple conditioning periods with rest periods between ("spaced training") yields long-term associative memory (&lt;40 hours), and is dependent on the cAMP Response Element Binding protein (CREB),6 a transcription factor required for long-term memory across species.8
Our protocol also includes image analysis methods for quick and accurate determination of chemotaxis indices. High-contrast images of animals on chemotaxis assay plates are captured and analyzed by worm counting software in MatLab. The software corrects for uneven background using a morphological tophat transformation.9 Otsu's method is then used to determine a threshold to separate worms from the background.10 Very small particles are removed automatically and larger non-worm regions (plate edges or agar punches) are removed by manual selection. The software then estimates the size of single worm by ignoring regions that are above a specified maximum size and taking the median size of the remaining regions. The number of worms is then estimated by dividing the total area identified as occupied by worms by the estimated size of a single worm.
We have found that learning and short- and long-term memory can be distinguished, and that these processes share similar key molecules with higher organisms.6,8 Our assays can quickly test novel candidate genes or molecules that affect learning and short- or long-term memory in C. elegans that are relevant across species.

C. elegans Positive Butanone Learning, Short-term, and Long-term Associative Memory Assays

Here we describe methods to test C. elegans associative learning and short- and long-term associative memory. These population assays employ the worms abilities to chemotax toward volatile odorants, and form positive associations upon pairing food with the chemoattractant butanone. Increasing the number of conditioning periods induces long-term memory.

C. 엘레간스 긍정적인 Butanone 학습, 단기 및 장기 연관 메모리 Assays

The memory of experiences and learned information is critical for organisms to make choices that aid their survival. C. elegans navigates its environment ...

연구

신경과학

Microfluidic-based Electrotaxis for On-demand Quantitative Analysis of Caenorhabditis elegans' Locomotion

The nematode Caenorhabditis elegans is a versatile model organism for biomedical research because of its conservation of disease-related genes and pathways as well as its ease of cultivation. Several C. elegans disease models have been reported, including neurodegenerative disorders such as Parkinson's disease (PD), which involves the degeneration of dopaminergic (DA) neurons 1. Both transgenes and neurotoxic chemicals have been used to induce DA neurodegeneration and consequent movement defects in worms, allowing for investigations into the basis of neurodegeneration and screens for neuroprotective genes and compounds 2,3.
Screens in lower eukaryotes like C. elegans provide an efficient and economical means to identify compounds and genes affecting neuronal signaling. Conventional screens are typically performed manually and scored by visual inspection; consequently, they are time-consuming and prone to human errors. Additionally, most focus on cellular level analysis while ignoring locomotion, which is an especially important parameter for movement disorders.
We have developed a novel microfluidic screening system (Figure 1) that controls and quantifies C. elegans' locomotion using electric field stimuli inside microchannels. We have shown that a Direct Current (DC) field can robustly induce on-demand locomotion towards the cathode ("electrotaxis") 4. Reversing the field's polarity causes the worm to quickly reverse its direction as well. We have also shown that defects in dopaminergic and other sensory neurons alter the swimming response 5. Therefore, abnormalities in neuronal signaling can be determined using locomotion as a read-out. The movement response can be accurately quantified using a range of parameters such as swimming speed, body bending frequency and reversal time.
Our work has revealed that the electrotactic response varies with age. Specifically, young adults respond to a lower range of electric fields and move faster compared to larvae 4. These findings led us to design a new microfluidic device to passively sort worms by age and phenotype 6.
We have also tested the response of worms to pulsed DC and Alternating Current (AC) electric fields. Pulsed DC fields of various duty cycles effectively generated electrotaxis in both C. elegans and its cousin C. briggsae 7. In another experiment, symmetrical AC fields with frequencies ranging from 1 Hz to 3 KHz immobilized worms inside the channel 8.
Implementation of the electric field in a microfluidic environment enables rapid and automated execution of the electrotaxis assay. This approach promises to facilitate high-throughput genetic and chemical screens for factors affecting neuronal function and viability.

Microfluidic-based Electrotaxis for On-demand Quantitative Analysis of Caenorhabditis elegans' Locomotion

A semi-automated micro-electro-fluidic method to induce on-demand locomotion in Caenorhabditis elegans is described. This method is based on the neurophysiologic phenomenon of worms responding to mild electric fields (&#x201C;electrotaxis&#x201D;) inside microfluidic channels. Microfluidic electrotaxis serves as a rapid, sensitive, low-cost, and scalable technique to screen for factors affecting neuronal health.

의 주문형 정량 분석​​을위한 미세 유체 기반 Electrotaxis<em&gt; Caenorhabditis의 엘레</em&gt; &#39;로코

The nematode Caenorhabditis elegans is a versatile model organism for biomedical research because of its conservation of disease-related genes and ...

생체공학

Automated Analysis of a Nematode Population-based Chemosensory Preference Assay

The nematode, Caenorhabditis elegans' compact nervous system of only 302 neurons underlies a diverse repertoire of behaviors. To facilitate the dissection of the neural circuits underlying these behaviors, the development of robust and reproducible behavioral assays is necessary. Previous C. elegans behavioral studies have used variations of a "drop test", a "chemotaxis assay", and a "retention assay" to investigate the response of C. elegans to soluble compounds. The method described in this article seeks to combine the complementary strengths of the three aforementioned assays. Briefly, a small circle in the middle of each assay plate is divided into four quadrants with the control and experimental solutions alternately placed. After the addition of the worms, the assay plates are loaded into a behavior chamber where microscope cameras record the worms' encounters with the treated regions. Automated video analysis is then performed and a preference index (PI) value for each video is generated. The video acquisition and automated analysis features of this method minimizes the experimenter's involvement and any associated errors. Furthermore, minute amounts of the experimental compound are used per assay and the behavior chamber's multi-camera setup increases experimental throughput. This method is particularly useful for conducting behavioral screens of genetic mutants and novel chemical compounds. However, this method is not appropriate for studying stimulus gradient navigation due to the close proximity of the control and experimental solution regions. It should also not be used when only a small population of worms is available. While suitable for assaying responses only to soluble compounds in its current form, this method can be easily modified to accommodate multimodal sensory interaction and optogenetic studies. This method can also be adapted to assay the chemosensory responses of other nematode species.

We present a behavior recording setup and protocol that enables automated analysis of the nematode, Caenorhabditis elegans' preference for soluble compounds in a population-based assay. This article describes the construction of a behavior chamber, the behavioral assay protocol, and video analysis software usage.

선충 집단에 기반한 화학 감응도 선호 분석의 자동화 된 분석

The nematode, Caenorhabditis elegans' compact nervous system of only 302 neurons underlies a diverse repertoire of behaviors. To facilitate the dissection ...

행동분석학

<meta charset="utf8"></head><body>예쁜꼬마선충(C. elegans)의 휘발성 성 페로몬 반응의 추출 및 정량화

Volatile Sex Pheromone Extraction and Chemoattraction Assay in Caenorhabditis elegans

Chemical communication is vital in organismal health, reproduction, and overall well-being. Understanding the molecular pathways, neural processes, and computations governing these signals remains an active area of research. The nematode Caenorhabditis elegans provides a powerful model for studying these processes as it produces a volatile sex pheromone. This pheromone is synthesized by virgin females or sperm-depleted hermaphrodites and serves as an attractant for males.
This protocol describes a detailed method for isolating the volatile sex pheromone from several C. elegans strains (WT strain N2, daf-22, and fog-2) and C. remanei. We also provide a protocol for quantifying the male chemotaxis response to the volatile sex pheromone. Our analysis utilizes measurements such as chemotaxis index (C.I.), arrival time (A.T.), and a trajectory plot to compare male responses under various conditions accurately. This method allows for robust comparisons between males of different genetic backgrounds or developmental stages. Furthermore, the experimental setup outlined here is adaptable to investigating other chemoattraction chemicals.

<meta charset="utf8"></head><body>저자 스포트라이트: 수컷 예쁜꼬마선 충 행동에 대한 휘발성 성 페로몬 영향 조사

This protocol establishes methods for extracting and quantifying responses to the volatile sex pheromone in C. elegans, providing tools to study chemical communication and navigation trajectory.

Volatile Sex Pheromone Extraction and Chemoattraction Assay in Caenorhabditis elegans(예쁜꼬마선충의 휘발성 성 페로몬 추출 및 화학매력 분석)

Chemical communication is vital in organismal health, reproduction, and overall well-being. Understanding the molecular pathways, neural processes, and ...

Measurement of Cellular Chemotaxis with ECIS/Taxis

Cellular movement in response to external stimuli is fundamental to many cellular processes including wound healing, inflammation and the response to infection. A common method to measure chemotaxis is the Boyden chamber assay, in which cells and chemoattractant are separated by a porous membrane. As cells migrate through the membrane toward the chemoattractant, they adhere to the underside of the membrane, or fall into the underlying media, and are subsequently stained and visually counted 1. In this method, cells are exposed to a steep and transient chemoattractant gradient, which is thought to be a poor representation of gradients found in tissues 2.
Another assay system, the under-agarose chemotaxis assay, 3, 4 measures cell movement across a solid substrate in a thin aqueous film that forms under the agarose layer. The gradient that develops in the agarose is shallow and is thought to be an appropriate representation of naturally occurring gradients. Chemotaxis can be evaluated by microscopic imaging of the distance traveled. Both the Boyden chamber assay and the under-agarose assay are usually configured as endpoint assays.
The automated ECIS/Taxis system combines the under-agarose approach with Electric Cell-substrate Impedance Sensing (ECIS) 5, 6. In this assay, target electrodes are located in each of 8 chambers. A large counter-electrode runs through each of the 8 chambers (Figure 2). Each chamber is filled with agarose and two small wells are the cut in the agarose on either side of the target electrode. One well is filled with the test cell population, while the other holds the sources of diffusing chemoattractant (Figure 3). Current passed through the system can be used to determine the change in resistance that occurs as cells pass over the target electrode. Cells on the target electrode increase the resistance of the system 6. In addition, rapid fluctuations in the resistance represent changes in the interactions of cells with the electrode surface and are indicative of ongoing cellular shape changes. The ECIS/Taxis system can measure movement of the cell population in real-time over extended periods of time, but is also sensitive enough to detect the arrival of a single cell at the target electrode. 
Dictyostelium discoidium is known to migrate in the presence of a folate gradient 7, 8 and its chemotactic response can be accurately measured by ECIS/Taxis 9. Leukocyte chemotaxis, in response to SDF1&alpha; and to chemotaxis antagonists has also been measured with ECIS/Taxis 10, 11. An example of the leukocyte response to SDF1&alpha; is shown in Figure 1.

The ECIS/Taxis system is an automated, real-time assay that measures cellular chemotaxis. In this assay, cells move beneath a layer of agarose to arrive at a target electrode. Cellular movement is measured by the onset of resistance to AC current 0.

ECIS / 택시와 셀룰러 Chemotaxis 측정

Cellular movement in response to external stimuli is fundamental to many cellular processes including wound healing, inflammation and the response to ...

생물학

Aversive Associative Learning and Memory Formation by Pairing Two Chemicals in Caenorhabditis elegans

The nematode Caenorhabditis elegans is an attractive model organism to study learning and memory at molecular and cellular levels because of the simplicity of its nervous system, whose chemical and electrical wiring diagrams were completely reconstructed from serial electron micrographs of thin sections. Here, we describe detailed protocols for the conditioning of C. elegans by massed and spaced training for the formation of short-term memory (STM) and long-term memory (LTM), respectively. By pairing 1-propanol and hydrochloric acid as conditioned and unconditioned stimuli, respectively, C. elegans was successfully trained to form aversive associative STM and LTM. While na&#239;ve animals were attracted to 1-propanol, the trained animals were no longer or very weakly attracted to 1-propanol. Like in other organisms such as Aplysia and Drosophila, "learning and memory genes" play essential roles in memory formation. Particularly, NMDA-type glutamate receptors, expressed in only six pairs of interneurons in C. elegans, are required for the formation of both STM and LTM, possibly as a coincidence factor. Therefore, the memory trace may reside among the interneurons.

Aversive Associative Learning and Memory Formation by Pairing Two Chemicals in Caenorhabditis elegans

We have previously developed protocols for Caenorhabditis elegans to form short- and long-term associative memories by massed and spaced training, respectively. Here, detailed protocols are described for the conditioning of C. elegans by pairing 1-propanol and hydrochloric acid as conditioned and unconditioned stimuli, respectively, to form aversive associative memory.

Caenorhabditis elegans에서 두 가지 화학 물질을 짝을 지어 혐오스러운 연관 학습 및 기억 형성

The nematode Caenorhabditis elegans is an attractive model organism to study learning and memory at molecular and cellular levels because of the ...

Chemotaxis is a process in which cells or organisms move in response to a chemical stimulus. In nature, chemotaxis is important for organisms to sense and move toward food sources and move away from stimuli that may be toxic or harmful. Chemotaxis is also important at the cellular level. For example, chemotaxis is required for the movement of sperm toward an egg prior to fertilization. In the lab, chemotaxis is frequently examined in the nematode, C. elegans, which is known to migrate towards food sources in soil, but away from toxins such as heavy metals, substances with a low pH, and detergents. This video demonstrates how to perform a chemotaxis assay, which includes preparing the chemotaxis plates and the worms, running the assay, and analyzing the data. Then, we discuss examples of how chemotaxis assays can be used in C. elegans as a tool to understand learning and memory, olfactory adaptation, and neurological disease such as Alzheimer&quot;s disease. Chemotaxis experiments in C. elegans have near-limitless possibilities for learning more about the cellular and genetic mechanisms of many biological processes, and may lead to a greater understanding of human biology, development, and disease.

Chemotaxis Assay in Caenorhabditis elegans

예쁜 꼬마 선충 주화성 분석

Chemotaxis is a process in which cells or organisms move in response to a chemical stimulus. In nature, chemotaxis is important for organisms to sense and ...

교육

JoVE Science Education

기초 생물학

생물학 I : 효모, 초파리, 예쁜 꼬마 선충

C. elegans Survival Assay: A Short-Term Toxicity Test

Source: Possik, E. and Pause, A. <a href="https://www.jove.com/video/2496/measuring-caenorhabditis-elegans-life-span-96-well-microtiter">Measuring Oxidative Stress Resistance of&#160;Caenorhabditis elegans&#160;in 96-well Microtiter Plates.</a>&#160;J. Vis. Exp. (2015).
This video introduces a short-term survival assay that tests a treatment for acute toxicity or tests a genetic strain for resistance to a toxic condition.&#160; The example protocol shows an example survival assay in which worms are tested for their ability to&#160; resist oxidative stress induced by paraquat (PQ).

C. 예쁜꼬마선충 생존 분석: 단기 독성 테스트

Source: Possik, E. and Pause, A. Measuring Oxidative Stress Resistance of&#160;Caenorhabditis elegans&#160;in 96-well Microtiter Plates.&#160;J. Vis. Exp. ...

C. elegans의 주 화성 분석

요약

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