Los animales transgénicos son fundamentales para la investigación biomédica moderna, ya que permiten estudios de la función génica en organismos vivos. Se han aplicado varios métodos de modificaciones genéticas en estudios con animales. Aquí, presentamos una técnica ampliamente accesible y eficaz que utiliza vectores lentivirales como herramienta para la incorporación de transgén en el genoma de un embrión de rata.
Después de la administración de gonadotropina coriónica humana, mate cinco semanas de edad Ratas hembra Wistar uno a uno con machos Wistar sexualmente fértiles de tres a 10 meses de edad. A las ocho a las 10 a.m. de la mañana siguiente, revise a las hembras para detectar la presencia de un tapón vaginal y cosecha los oviductos de las hembras con un tapón de apareamiento a más tardar 10 a.m.
en un plato de colección que contenga un medio M2 precalentó. Una vez recogidos todos los oviductos, transfiera los tejidos a un plato de 35 milímetros que contenga un medio M2 precalentado complementado con 0,5 miligramos por mililitro de hialuronidasa de los testículos bovinos y coloque el plato bajo un microscopio estéreo. Utilice fórceps finos para abrir las paredes del oviducto y presione la ampolla hasta que los embriones se liberen.
Para facilitar la liberación de los embriones de las células cúmulos, utilice una pipeta de transferencia de vidrio conectada a un tubo de aspirador accionado por la boca para pipetear suavemente los embriones hacia arriba y hacia abajo. Cuando todos los embriones hayan sido liberados, lave las células varias veces en medio M2 fresco para eliminar la hialuronidasa y los desechos celulares. Transfiera los embriones a 50 microlitros individuales de medio M16 preequilibrio cubierto por aceite mineral en un plato de 60 milímetros.
A continuación, coloque el plato en una incubadora humidificada de 37 grados Celsius con una atmósfera de dióxido de carbono del 5% hasta su inyección. Para la microinyección de vectores lentivirales bajo la zona pellucida de los embriones de una etapa de una célula, utilice un tirador de pipetas para preparar capilares de vidrio borosilicato de microinyección con un filamento. Después de cada vez que se cambia el filamento o se utiliza un nuevo capilar de vidrio, ejecute una prueba de rampa para establecer los parámetros óptimos.
A continuación, utilice una punta de microcargador para cargar aproximadamente dos microlitros de solución lentiviral recién descongelada por pipeta de microinyección bajo una campana de flujo laminar de bioseguridad. Agregue una caída de 100 microlitros de medio M2 al centro de la tapa de una placa Petri de 60 milímetros. Cubra el medio con aceite mineral y monte la pipeta de sujeción y el capilar de microinyección cargado por el virus en un micromaniprógrafo.
Coloque el plato de microinyección bajo un microscopio invertido y transfiera de 15 a 20 embriones de una célula en la gota M2 en el plato de microinyección. Capturar un embrión con la pipeta de retención y utilizar el aumento 400 veces y el capilar de vidrio para inyectar la solución lentiviral bajo la zona pellucida en el espacio de perivitellina que sostiene el capilar bajo la zona pellucida por un momento después de la entrega del virus. Cuando se hayan inyectado todos los embriones, utilice una pipeta fina para devolver las células inyectadas al plato de cultivo y devolver el plato a la incubadora de cultivo celular hasta su implantación.
Para preparar a las madres adoptivas para la transferencia de embriones, apareja a las hembras de Sprague-Dawley maduras sexualmente con machos vasectomizados y revise a las hembras a la mañana siguiente para un tapón vaginal. Después de confirmar la falta de respuesta al reflejo del pedal en las hembras anestesiadas con un tapón viable, aplicar ung ón en los ojos del animal y afeitar el pelaje de la parte posterior de cada animal. Coloque la primera rata en la posición propensa sobre una superficie limpia sobre una almohadilla de calentamiento bajo un microscopio quirúrgico.
Cubra a la rata con una cortina estéril con un pequeño agujero cortado sobre la parte inferior de la espalda y haga una incisión cutánea de aproximadamente dos centímetros paralela a la columna vertebral lumbar. Usa tijeras afiladas para hacer un corte en la pared abdominal y usa fórceps para agarrar una almohadilla de grasa ovárica. Tire del ovario y del oviducto de la cavidad abdominal sobre un trozo de gasa empapada de cloruro de sodio al 0,9%.
Cargue el medio M2, tres burbujas de aire y los embriones en un capilar de transferencia. Utilice microscisores para hacer una pequeña incisión en el oviducto entre el infundibulum y la ampolla e inserte la punta de la pipeta de transferencia en la incisión. Expulsa suavemente los embriones y las burbujas de aire en el oviducto, luego usa fórceps contundentes para colocar el tracto reproductivo de nuevo en la cavidad abdominal.
Suturar la pared abdominal con suturas absorbibles de ácido poliglicólico y cerrar la incisión de la piel con clips de la herida y colocar al animal en una jaula limpia en una placa de calentamiento con monitoreo hasta la recumbencia completa. Para vasectomizar a las parejas potenciales, después de preparar la rata macho para la cirugía como se demostró, utilice 70%etanol y un exfoliante quirúrgico para desinfectar la piel sobre los testículos. Presione suavemente el abdomen para exponer los testículos en el saco escrotal y cubra a la rata con una cortina estéril con un pequeño agujero sobre el sitio quirúrgico y use tijeras escrotales para hacer una incisión de 0,5 centímetros en el centro del saco.
Empuje cuidadosamente los testículos hacia la izquierda y localice los vasos deferens entre los testículos y la línea media como un conducto blanco con un solo vaso sanguíneo. Utilice fórceps del relojero para sacar suavemente el vaso del saco escrotal y sostener el recipiente con fórceps, utilice tijeras finas para eliminar un fragmento de un centímetro del conducto. Repita el procedimiento para el segundo testis como acaba de demostrar y cerrar la piel con suturas absorbibles de ácido poliglicólico.
A continuación, coloque la rata en una jaula limpia en una placa de calentamiento con monitoreo hasta la recumbencia completa. En este experimento representativo en el que se inyectaron embriones individuales varias veces, ocho ratas nacieron de embriones que se inyectaron dos veces, tres de las cuales fueron confirmadas para transportar el transgén. Uno de los fundadores no transfirió el transgén a la descendencia y se utilizaron tres hembras de crianza para cada configuración experimental.
El enfoque elegido permitió la generación de líneas de ratas transgénicas estables que expresaron la proteína de fusión TDP-43-eGFP bajo el control de la sinapsis neuronal en un promotor en todo el sistema nervioso central. La transgénesis basada en lentivirus dio lugar a una sola inserción de copia del transgén, como lo demuestra la PCR cuantitativa. Cuando este método se utilizó para otros vectores lentivirales, se observó una tasa de supervivencia de aproximadamente el 90%.
El porcentaje de embriones que sobrevivieron a las inyecciones pronucleares fue significativamente menor. En general, estos resultados sugieren que las ratas hembras embarazadas se pueden utilizar como madres adoptivas con una eficiencia comparable. En particular, los datos numéricos que se analizaron para rondas individuales de microinyección indicaban que la eficacia de la implantación dependía directamente del número de inyecciones en un embrión e indirectamente de la carga viral.
El uso de vectores lentivirales garantiza la integración genómica y la transmisión del transgén y facilita una alta tasa de supervivencia de los embriones micromanipulados incluso cuando se realizan múltiples inyecciones subdérmicas. Este procedimiento puede aplicarse eficazmente a otras especies y puede considerarse una alternativa para la transgénesis convencional.
