En este protocolo, demostramos el proceso de purificación para obtener canales TRP purificados y de longitud completa, que es el primer paso necesario para estudiar las propiedades electrofisiológicas, y obtener información estructural del canal TRP de Drosophila de longitud completa. Sobre la base del mecanismo de muestreo del complejo de proteínas INAD y utilizando perlas de níquel de bajo costo con una capacidad mucho mayor, se puede purificar una cantidad suficiente de canales TRP de cabezas de mosca. Demostrando el procedimiento estará Yuyang Liu, un técnico de nuestro laboratorio.
Para comenzar, transforme el plásmido pGEX 4T-1 TRP 1261-1265 en células E.coli BL21, utilizando el método de transformación de choque térmico de cloruro de calcio. Inocular una sola colonia en 10 mililitros de Luria Bertani medio, y crecer durante la noche a 37 grados centígrados. Agregue los 10 mililitros de cultivo de siembra en un litro de medio Luria Bertani e incube a 37 grados centígrados.
Después de que la densidad óptica de las células alcance 0.5, enfríe las células a 16 grados Celsius y agregue 0.1 milimolar isopropil-beta-D-1-tiogalactopyranoside. Después de la sobreexpresión, glet un litro de células cultivadas por centrifugación y resuspend en 40 mililitros de solución salina tamponada con fosfato. Cargue las células resuspendidas en un homogeneizador de alta presión, preenfriado a cuatro grados centígrados.
Aumente lentamente la presión del homogeneizador a 800 bar. Abra la pestaña de entrada y deje que las celdas resuspendidas pasen circularmente a través de una válvula con ranuras estrechas. Cargue cinco mililitros de perlas de glutatión en una columna de flujo por gravedad y lave las perlas con 50 mililitros de tampón salino tampón salino tamponado con fosfato, para un total de tres veces.
Centrifugar el lisado celular del homogeneizador de alta presión a 48, 384 veces G.Agregue alrededor de 40 mililitros del sobrenadante del lisado de células centrifugadas a las perlas de glutatión equilibradas en la columna de flujo de gravedad, e incube durante 30 minutos a 4 grados Celsius. Resuspend las cuentas de glutatión cada 10 minutos. Después de 30 minutos de incubación, abra la pestaña de salida de la columna para separar las cuentas y la fracción de flujo.
Deseche la fracción de flujo continuo y enjuague las perlas de glutatión restantes dos veces, con 50 mililitros de tampón salino tampón tampón de fosfato. Agregue 15 mililitros de tampón de elución a las cuentas de glutatión y vuelva a suspender las perlas cada 10 minutos. Eluya el fragmento TRP 1261-1275 etiquetado con GST en un tubo cónico de 50 ml y cárguelo en una columna de exclusión de tamaño.
Recolecte cinco mililitros de las proteínas eluidas por tubo y concentre los fragmentos purificados en un mililitro por centrifugación en una columna de espín de ultrafiltración en una centrífuga refrigerada. Para purificar el fragmento NORPA 863-1095 marcado con His, siga el procedimiento previamente demostrado utilizando perlas de níquel. Recoja las moscas adultas en tubos de centrífuga cónica de 50 mililitros y congélelas en nitrógeno líquido durante 10 minutos.
Agite vigorosamente los tubos congelados a mano y transfiera la mezcla a tres tamices de acero inoxidable preenfriados apilados secuencialmente. Agite los tamices y barre las cabezas de las moscas del tamiz de malla 40 con un cepillo. Transfiéralos a tubos cónicos de cinco mililitros y guárdelos a menos 80 grados centígrados.
Homogeneizar 0,5 gramos de cabezales en nitrógeno líquido utilizando un mortero y mortero preenfriados. Disuelva las cabezas homogeneizadas en cinco mililitros de tampón de lisis 10X, seguido de centrifugación a 20, 817 veces G a cuatro grados Celsius durante 20 minutos. El sobrenadante de giro hacia abajo se centrifuga aún más 100, 000 veces G a cuatro grados Celsius durante 60 minutos.
Agregue un mililitro de perlas de níquel en la columna de flujo de gravedad y lave las cuentas tres veces con 10 mililitros de agua destilada doble a cuatro grados centígrados. Equilibre las cuentas con 10 volúmenes de columna de tampón de lisis, tres veces a cuatro grados centígrados. Agregue 500 microlitros de 600 micromolares purificados con proteína NORPA 863-1095 en la columna de níquel e incube la columna.
Vuelva a suspender las cuentas cada 10 minutos. Abra el grifo de salida de la columna para separar las perlas y la fracción de flujo, y lave las perlas de níquel con 10 mililitros de tampón de lisis en frío. Luego, agregue el sobrenadante frío del homogeneizado de cabeza de Drosophila en la columna de níquel.
Después de la incubación, lave las perlas con 10 mililitros de tampón de lisis y agregue 500 microlitros de 600 micromolares de proteína TRP 1261-1275 marcada con GST en las perlas. Recoge la fracción eluida de la columna de gravedad. Lave las perlas de níquel con 10 mililitros de tampón de unión.
Luego, agregue el búfer de elución y recoja la fracción de elución de la columna de flujo de gravedad. Concentre las fracciones eluidas de la purificación del canal TRP de Drosophila, utilizando una columna de espín de ultrafiltración de cuatro mililitros. Inyecte la muestra en la columna de exclusión de tamaño y eluya las proteínas con un caudal razonable.
El fragmento TRP 1261-1275 marcado con GST se expresó en células de E. coli y se purificó utilizando perlas de glutatión y una columna de exclusión de tamaño. Del mismo modo, el fragmento NORPA 863-1095 marcado con His se expresó y purificó utilizando perlas de níquel y columna de exclusión de tamaño. El canal TRP eluido se separa del péptido TRP 1261-1275 marcado con GST excesivo, mediante cromatografía de exclusión de tamaño.
Como subproducto, los complejos INAD, ePKC, NORPA 863-1095 se obtienen después de la competencia de péptidos TRP 1261-1275. Lo más importante a recordar al intentar este protocolo, es homogeneizar las cabezas de mosca en nitrógeno líquido y resolver el homogeneizado en tampón que contiene un detergente llamado DDM. Siguiendo este procedimiento, también podemos purificar todo el complejo de proteínas INAD que se puede utilizar para estudiar sus mecanismos de ensamblaje y regulación.
Una posible aplicación futura de este método será estudiar la información estructural del canal endógeno Drosophila TRP utilizando técnicas Cryo-EM. Además, también es factible medir las propiedades electrofisiológicas de los canales endógenos purificados de Drosophila TRP en la membrana lipídica bicapa artificial.
