Los autores agradecen a Linda Turner para obtener ayuda con la preparación microbiológica. RZ y LGW fueron financiados por el Instituto Rowland en Harvard y CGB fue financiado como estudioso de la Fundación CAPES, Ciencia Sin Fronteras Programa, Brasil (Proceso # 7340-11-7)

1. Configuración y Adquisición de Datos <ol><li> Haga crecer una cultura de la cepa de Streptococcus células (natación suave) en medio KTY V4051-197 desde el almacén congelado 22. Incubar en un agitador rotatorio durante la noche a 35 ° C y 150 rpm, a la saturación. </li><li> Inocular 10 ml de medio KTY fresco con 500 l de la cultura saturada. Incubar durante una 3,5 h más a 35 ° C y 150 rpm hasta que las células alcanzan una densidad óptica de aproximadamente 1,0 en λ = 600 nm (aproximadamente 5 x 10 8 células / ml). </li><li> Diluir 1:400 en medio fresco para obtener la concentración final de células móviles. </li><li> En un portaobjetos de microscopio, hacer un anillo de grasa (por ejemplo, de una jeringa llena de vaselina) alrededor de 1 mm de altura y colocar una gota de la solución de la muestra en el centro. Coloque una cubierta de vidrio en la parte superior y presione ligeramente en los bordes para sellar, lo que garantiza que el líquido está en contacto tanto con portaobjetos y cubreobjetos. La cámara de muestra resultante debe ser Arouº 100-200 micras de profundidad. </li><li> Coloque la cámara de muestra en el microscopio con el vidrio de cubierta hacia abajo, y con cuidado, para evitar la formación de burbujas de aire, en el aceite de entre el vidrio y la lente. </li><li> Enfocar el microscopio en la superficie inferior de la cámara de muestra, y llevar el condensador para enfocar. </li><li> Apague la iluminación estándar y coloque el cabezal del LED detrás de la apertura del condensador del microscopio. Establezca la fuente de alimentación del LED para la salida máxima. </li><li> Cierre la apertura del condensador en toda su extensión, y si es necesario, empujar el LED en su montura hasta que la iluminación se centra en la abertura de la lente objetivo. </li><li> Encienda el ordenador y la cámara, y reorientar toda la luz al puerto de la cámara del microscopio. Ajuste la velocidad de fotogramas y el tamaño de la imagen en el software de adquisición de imágenes. </li><li> Hacer que el tiempo de exposición marco lo más corto posible mientras que todavía conserva un buen contraste. Echa una intensidad histograma de la imagen para que la imagen no es la saturaciónted o subexpuesta. </li><li> Si es necesario, vuelva a enfocar el microscopio para que objeto de interés es ligeramente desenfocado (típicamente un 10-30 micras). El objeto y el plano focal debe estar en el mismo medio (es decir el plano focal debe estar dentro de la cámara de muestra). </li></ol> 2. Reconstrucción El primer paso de procesamiento de datos es volver a centrar numéricamente un fotograma de vídeo en una serie de diferentes profundidades, la producción de una pila de imágenes. Software de fácil uso para hacer esto se puede encontrar aquí: <a href="http://www.rowland.harvard.edu/rjf/wilson/Downloads.html">http://www.rowland.harvard.edu/rjf/wilson/Downloads.html</a> junto con imágenes de ejemplo (adquiridos usando un microscopio invertido, y una inmersión en aceite lente objetivo de 60X) y un archivo de escena para ray remontar renderizado. <ol><li> Ingrese el marco de su interés y su respectivo fondo como archivos de imagen independientes, en las casillas correspondientes en la interfaz. Una imagen de fondo es una trama que fAirly representa el fondo de la de vídeo, en ausencia del holograma, y ​​se puede usar para suprimir el ruido de patrón fijo que podrían interferir con la localización holograma y análisis. </li><li> Introduzca valores en los cuadros de configuración global en el lado izquierdo de la pantalla antes de ejecutar el programa. Los tres primeros son parámetros de chimenea de salida: Posición axial del primer cuadro (&#39;Iniciar enfoque&#39;); número de cortes en la pila reconstruido (&quot;Número de pasos&quot;), la distancia axial entre cada rebanada en la pila (&quot;Tamaño del paso &#39;) . </li><li> Con el fin de reconstruir los objetos con las proporciones correctas, el tamaño de paso debe ser del mismo tamaño que la separación de píxeles lateral. Introduzca la frecuencia de muestreo lateral de la cámara (el espaciado 1/pixel) en el cuadro de &quot;pixel / micron &#39;, la longitud de onda de la iluminación y el índice de refracción medio en las dos últimas cajas. Valores predeterminados del programa son apropiados para la reconstrucción de los datos de ejemplo. </li><li> Pulse el botón &#39;Flip Z-pendiente&#39; si el centro de la object es oscuro en el holograma (véase el ejemplo del marco de 2005 y la sección de discusión para más detalles). </li><li> Revise el filtro de paso de banda en estado / apagado (por defecto es activado). Este filtro de paso de banda opcional, situado en una caja debajo del interruptor de gradiente-flip, es responsable de la supresión de la contribución del ruido píxeles. El filtro de paso de banda se aplica a cada corte de imagen inmediatamente después de la generación. </li><li> Compruebe el interruptor de salida intermedia estados activado / desactivado (por defecto está activado). Pasos de análisis intermedio se escriben en dos videos de salida, como sin comprimir archivos AVI:. La primera es la pila reorientado (nombre de archivo que termina en &#39;_stack.avi&#39;), la segunda es la pila después de la operación de gradiente axial (nombre de archivo con extensión &#39; _gradient.avi &#39;). Idealmente, esta segunda pila contendrá el objeto de interés destacó como un objeto brillante contra un fondo oscuro. </li><li> Después de configurar todos los parámetros, presione &quot;Ejecutar&quot; en la ventana principal. El marco seleccionado aparecerá en el cuadro principal del software. </li><li> Utilice elmagnificar herramienta vidrio que se encuentra en la barra de herramientas a la izquierda de la imagen para ampliarla (clic izquierdo) y alejar (shift + clic izquierdo). Utilice la herramienta de rectángulo en la barra de herramientas para seleccionar una región de interés (ROI). Capturar la mayor cantidad de franjas de holograma como sea posible dentro del rectángulo, ya que esto optimizar la reconstrucción. </li><li> Pulse el botón de &quot;Proceso&quot; para generar las dos pilas de imágenes. Inspeccione las pilas resultantes utilizando ImageJ (que se puede obtener de forma gratuita en <a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/">http://rsb.info.nih.gov/ij/</a> ). Si el objeto de interés se puede ver claramente en la pila de imagen de gradiente, continúe con el siguiente paso para extraer las coordenadas del objeto. </li></ol> 3. Representación <ol><li> Además de la reorientación marco, este programa puede localizar el x, y, z las coordenadas para cada voxel en el objeto de interés. Pulse el botón &#39;Extracción de características &quot;para activar esta función. </li><li> Escriba una ruta, incluyendo la extensión (por ejemplo: c: home output.inc), para lasalida coordina archivo. Seleccione &#39;estilo POV-Ray &quot;en la caja&quot; de coordenadas de salida estilo&#39;. Esto hace que el programa para escribir un archivo de objeto que puede ser visualizado utilizando el paquete de software libre raytracing del POV-Ray (que se puede obtener de <a href="http://www.povray.org/">http://www.povray.org/</a> ). </li><li> Vuelva a procesar las imágenes como en el apartado 2 anterior. El programa ofrecerá una serie de (x, y, z) las coordenadas en el ROI seleccionada, escrito al nombre del archivo en el cuadro de &#39;Salida de coordenadas &quot;. La extracción de coordenadas del objeto tarda mucho más que la generación de pila. </li><li> Asegúrese de que el archivo de POV-Ray muestra (se entrega con el código de la reconstrucción) se encuentra en la misma carpeta que el archivo de coordenadas sólo generan. Edite el archivo pov muestra. Y reemplazar el nombre de archivo entre comillas en la línea # Include &quot;MYFILE.inc&quot; con el nombre del archivo de datos generado por el código de la reconstrucción. </li><li> Haga clic en el botón &quot;Ejecutar&quot; en POV-Ray para hacer una imagen de mapa de bits. Tque la posición de la cámara, la iluminación y opciones de textura son sólo algunas de las personalizaciones posibles en POV-Ray, consulte la documentación en línea para obtener más información. </li></ol>

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Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

El paso más importante en este protocolo experimental es la captura precisa de las imágenes de un montaje experimental estable. Con los pobres datos de fondo, reconstrucción de alta fidelidad es casi imposible. También es importante evitar lentes de objetivo con un elemento de contraste de fase interna (visible como un anillo oscuro cuando se mira a través de la parte posterior del objetivo), ya que esto puede degradar la imagen reconstruida. El objeto de interés debe ser lo suficientemente lejos del plano focal q...

Línea digital microscopía holográfica (MHDL) permite rápida obtención de imágenes tridimensionales de muestras microscópicas, tales como microorganismos natación 1,2 y sistemas de materia blanda de 3,4, con una mínima modificación a una configuración de microscopio estándar. En este trabajo se ofrece una demostración pedagógica de MHDL, en torno a un software desarrollado en nuestro laboratorio. Este documento incluye una descripción de cómo configurar el microscopio, optimizar la adquisición de datos y procesar las imágenes grabadas para reconstruir los datos en tres dimensiones. El software (basado en parte en software desarrollado por la DG Grier y otros 5) y imágenes de ejemplo están disponibles gratuitamente en nuestro sitio web. Se describen los pasos necesarios para configurar el microscopio, reconstruir volúmenes tridimensionales a partir de hologramas y rendir los volúmenes resultantes de interés utilizando un rayo libre de rastreo de paquete de software. El artículo concluye con una discusión de los factores que afectan la calidad de la reconstrucción, Y una comparación de MHDL con métodos que compiten. Aunque MHDL se describió hace algún tiempo (para una revisión general de sus principios y el desarrollo, ver Kim 6), la potencia de cálculo necesaria y la experiencia de procesamiento de imágenes que hasta ahora se ha limitado en gran medida su uso a grupos de investigación especializados, con un enfoque en el desarrollo de instrumentos. Esta situación está cambiando a la luz de los últimos avances en informática y tecnología de la cámara. Computadoras de escritorio modernas pueden hacer frente fácilmente con los requisitos de almacenamiento de datos y procesamiento; cámaras CCD o CMOS están presentes en la mayoría de los laboratorios de microscopía, y el software necesario se está a libre disposición en Internet por parte de grupos que han invertido tiempo en el desarrollo de la técnica. Se han propuesto varios esquemas para obtener imágenes de la configuración de los objetos microscópicos en un volumen de muestra de tres dimensiones. Muchos de estos están escaneando técnicas 7,8, en el que una pila de imágenes es registrado por mechanically traducir el plano de la imagen a través de la muestra. Microscopía de fluorescencia confocal de barrido es quizás el ejemplo más conocido. Típicamente, se añade un colorante fluorescente a un objeto de fase con el fin de lograr un nivel aceptable de contraste de la muestra, y la disposición confocal utiliza para localizar espacialmente la emisión fluorescente. Este método ha dado lugar a avances significativos, por ejemplo en la ciencia coloidal donde se ha permitido el acceso a la dinámica en tres dimensiones de sistemas de hacinamiento 09.11. El uso del etiquetado es una diferencia importante entre la microscopía confocal de fluorescencia y MHDL, pero otras características de las dos técnicas son dignos de ser comparados. MHDL tiene una significativa ventaja de velocidad en que el aparato no tiene piezas móviles. Los espejos de barrido mecánico en los sistemas confocales ponen un límite superior en la velocidad de adquisición de datos - por lo general alrededor de 30 cuadros / seg una imagen de píxeles 512 x 512 para. Una pila de tales imágenes de diferentes planos focales se puede conseguir por físicamente translAting la etapa de la muestra o lente de objetivo entre los marcos, que conduce a una tasa de captura final de alrededor de un volumen por segundo para una pila 30 de trama. En comparación, un sistema holográfico sobre la base de una cámara CMOS moderno puede capturar 2000 cuadros / seg en el mismo tamaño y resolución de la imagen; cada trama se procesa `desconectado &#39;para dar una instantánea independiente del volumen de muestra. Para reiterar: muestras fluorescentes no son necesarios para MHDL, aunque un sistema ha sido desarrollado que realiza la reconstrucción holográfica de un sujeto fluorescente 12. Además de la información de volumen tridimensional, MHDL también puede ser utilizado para proporcionar imágenes de contraste de fase cuantitativa 13, pero que está más allá del alcance de la discusión aquí. Imágenes de datos Raw Dihm son de dos dimensiones, y en algunos aspectos se parecen a las imágenes de microscopio estándar, aunque fuera de foco. La principal diferencia entre MHDL y microscopía de campo claro estándar está en los anillos de difracción que rodean a los objetos in el campo de vista, que son debido a la naturaleza de la iluminación. MHDL requiere una fuente más coherente que en campo claro - por lo general un LED o láser. Los anillos de difracción en el holograma contienen la información necesaria para reconstruir una imagen tridimensional. Hay dos enfoques principales para la interpretación de datos; MHDL reorientación y adaptación numérica directa. El primer enfoque es aplicable en los casos en que la forma matemática de la figura de difracción se conoce de antemano 3,4; esta condición se cumple por un pequeño puñado de objetos simples como esferas, cilindros, y los obstáculos semiplano. Montaje directo también es aplicable en los casos en que se conoce posición axial del objeto, y la imagen se puede montar usando una tabla de búsqueda de plantillas de la imagen 14. El segundo enfoque (reorientación numérica) es bastante más general y se basa en el uso de los anillos de difracción en la imagen del holograma de dos dimensiones para reconstruir numéricamente el campo óptico enun número de espaciados (arbitrariamente) planos focales en todo el volumen de la muestra. Existen varios métodos relacionados para hacer esto 6; este trabajo se utiliza el Rayleigh-Sommerfeld volver técnica de propagación según lo descrito por Lee y Grier 5. El resultado de este procedimiento es una pila de imágenes que reproducen el efecto de cambiar manualmente el plano focal del microscopio (de ahí el nombre de `reorientación numérica &#39;). Una vez que una pila de imágenes ha sido generada, se debe obtener la posición del sujeto en el volumen focal. Una serie de heurísticas de análisis de imágenes, tales como la varianza intensidad local o el contenido de frecuencia espacial, se han presentado para cuantificar la agudeza de enfoque en diferentes puntos de la muestra 15. En cada caso, cuando se maximiza una métrica imagen en particular (o minimizar), el objeto se considera que está en el foco. A diferencia de otros sistemas que tratan de identificar a un plano focal particular cuando un objeto es &#39;in focus&#39;, el método en este trabajo escoge points que se encuentran en el interior del objeto de interés, que pueden extenderse a través de una amplia gama de planos focales. Este enfoque es aplicable a una amplia gama de temas y es particularmente adecuado para extendidos, muestras débilmente-dispersión (objetos) de fase, tales como coloides en forma de varilla, cadenas de bacterias o flagelos eucariota. En estas muestras el contraste de la imagen cambia cuando el objeto pasa a través del plano focal; una imagen desenfocada tiene un centro de luz si el objeto está en un lado del plano focal y un centro oscuro si está en el otro. Objetos de fase puros tienen poco o ningún contraste cuando mienten exactamente en el plano focal. Este fenómeno de inversión de contraste ha sido discutido por otros autores 16,17 y es, en última instancia debido a la fase de Gouy anomalía 18. Esto ha sido puesto sobre una base más rigurosa en el contexto de la holografía en otros lugares, donde se evalúan los límites de la técnica, la incertidumbre típica de posición es del orden de 150 nm (aproximadamente un pixel) en each Dirección 19. El método de anomalía fase Gouy es uno de los pocos esquemas Dihm bien definidos para la determinación de la estructura de los objetos extendidos en tres dimensiones, pero sin embargo algunos objetos son problemáticos para reconstruir. Los objetos que se encuentran directamente en el eje óptico (señalando a la cámara) son difíciles de reconstruir con precisión; las incertidumbres en la longitud y la posición del objeto se hacen grandes. Esta limitación se debe en parte a la profundidad de bits restringido de los píxeles de grabación del holograma (el número de niveles de gris diferentes que la cámara puede grabar). Otra configuración problemática se produce cuando el objeto de interés es muy cerca del plano focal. En este caso, las imágenes reales y virtuales del objeto son reconstruidas en estrecha proximidad, dando lugar a campos ópticos complicados que son difíciles de interpretar. Un segundo, un poco menos importante preocupación aquí es que las franjas de difracción resultantes ocupan menos del sensor de imagen, y esta inf más gruesa de granoormación conduce a una reconstrucción de peor calidad. En la práctica, un filtro de gradiente simple se aplica a los volúmenes tridimensionales reconstruidas para detectar fuertes inversiones de intensidad a lo largo de la dirección de iluminación. Regiones donde la intensidad cambia rápidamente de claro a oscuro, o viceversa, se asocian a regiones de difracción. Objetos débilmente-dispersión se describen bien como una colección que no interactúan de tales elementos 20, los cuales suma contribuciones individuales para dar al campo dispersado total que se invierte fácilmente utilizando el método de propagación hacia atrás de Rayleigh-Sommerfeld. En este trabajo, la técnica de gradiente de intensidad axial es aplicada a una cadena de células de Streptococcus. Los cuerpos celulares son objetos de fase (la especie de E. coli tiene un índice de refracción medido 21 a ser 1,384 a una λ = 589 nm longitud de onda; la cepa de Streptococcus es probable que sean similares) y aparecerá como una cadena de alta intensidad de gotas conectados en ªvolumen de muestra e después del filtro de gradiente se ha aplicado. Métodos de extracción de umbral y característica estándar aplicadas a este volumen filtrado permiten la extracción de píxeles volumétricos (voxels) corresponden a la región dentro de las células. Una ventaja particular de este método es que permite la reconstrucción no ambigua de la posición de un objeto en la dirección axial. Métodos similares (por lo menos, aquellos que registran los hologramas cerca del objeto, fotografiados a través de un objetivo de microscopio) sufren al no poderse determinar el signo de este desplazamiento. Aunque el método de reconstrucción de Rayleigh-Sommerfeld es también firme-independiente en este sentido, la operación de gradiente nos permite discriminar entre objetos de fase débiles por encima y por debajo del plano focal.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="780">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;width:180px;">Nikon Eclipse Ti-E inverted microscope</td>
			<td style="width:187px;">Nikon Corp.</td>
			<td style="width:147px;"> </td>
			<td style="width:267px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;width:180px;">LED</td>
			<td style="width:187px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:147px;">M660L3</td>
			<td style="width:267px;">emission wavelength &#955;=660 nm, linewidth approximately 20 nm </td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:180px;">LED power supply</td>
			<td style="width:187px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:147px;">LEDD1B</td>
			<td style="width:267px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:180px;">Thread Adapter</td>
			<td style="width:187px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:147px;">SM2T2</td>
			<td style="width:267px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:180px;">Thread Adapter</td>
			<td style="width:187px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:147px;">SM1A2</td>
			<td style="width:267px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:180px;">Frame Grabber board</td>
			<td style="width:187px;">EPIX </td>
			<td style="width:147px;">PIXCI E4 </td>
			<td style="width:267px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:180px;">High-Speed CMOS camera</td>
			<td style="width:187px;">Mikrotron</td>
			<td style="width:147px;">MC-1362</td>
			<td style="width:267px;"> </td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

digital inline holographic microscopy (dihm) of weakly-scattering subjects

Objetos débilmente-dispersión, tales como pequeñas partículas coloidales y la mayoría de las células biológicas, se encuentran con frecuencia en la microscopía. De hecho, una amplia gama de técnicas se han desarrollado para visualizar mejor estos objetos de fase; de ​​contraste de fases y DIC se encuentran entre los métodos más populares para mejorar el contraste. Sin embargo, la grabación de posición y la forma en la dirección fuera de la proyección de imagen del plano sigue siendo un reto. Este informe presenta un método experimental sencillo para determinar con precisión la ubicación y la geometría de los objetos en tres dimensiones, utilizando microscopía holográfica digital de línea (MHDL). En términos generales, el volumen de muestra accesible se define por el tamaño del sensor de la cámara en la dirección lateral, y la coherencia de iluminación en la dirección axial. Volúmenes de las muestras típicas oscilan entre 200 micras x 200 m x 200 m utilizando iluminación LED, para5 mm x 5 mm x 5 mm o más grande, utilizando iluminación láser. Esta luz de iluminación está configurado de manera que las ondas planas son incidente sobre la muestra. Los objetos en el volumen de la muestra y luego dispersan la luz, lo cual interfiere con la luz dispersada para formar patrones de interferencia perpendicular a la dirección de la iluminación. Esta imagen (el holograma) contiene la información de profundidad requerida para la reconstrucción en tres dimensiones, y puede ser capturado en un dispositivo estándar de formación de imágenes tal como un CMOS o una cámara CCD. El método de propagación hacia atrás de Rayleigh-Sommerfeld se emplea para reorientar numéricamente imágenes de microscopio, y un simple heurística de imagen basado en la fase de Gouy anomalía se utiliza para identificar la dispersión de objetos dentro del volumen reconstruido. Este método simple pero robusta resulta en una medición inequívoca, modelo libre de la ubicación y la forma de los objetos en muestras microscópicas.

Para demostrar las capacidades de MHDL, los experimentos se realizaron en una cadena de bacterias Streptococcus. La propia cadena mide 10,5 mm de largo, y se compone de 6-7 células esfero-cilíndrica (dos de las células en la cadena están cerca de dividiendo) con diámetros en el intervalo 0,6-1 micras. Las figuras 1a y 1b muestran la interfaz principal de la reconstrucción y el software de renderización. Ejemplos del procedimiento de reorientación numérica se ven en <st...

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Digital Inline Holographic Microscopy DIHM of Weakly-scattering Subjects

Las ubicaciones tridimensionales de objetos débilmente-dispersión puede ser identificada usando microscopía holográfica digital de línea (MHDL), que implica una modificación menor a un microscopio estándar. Nuestro software utiliza una heurística simple de formación de imágenes junto con Rayleigh-Sommerfeld de propagación hacia atrás para producir la posición en tres dimensiones y la geometría de un objeto de fase microscópica.

Digital Inline holográfica Microscopía (MHDL) de sujetos débilmente dispersión de

Weakly-scattering objects, such as small colloidal particles and most biological cells, are frequently encountered in microscopy. Indeed, a range of ...

digital-inline-holographic-microscopy-dihm-weakly-scattering

Research

JoVE Journal

Biology

Digital Inline Holographic Microscopy (DIHM) of Weakly-scattering Subjects

12.1K vistas.  Harvard University.  Las ubicaciones tridimensionales de objetos débilmente-dispersión puede ser identificada usando microscopía holográfica digital de línea (MHDL), que implica una modificación menor a un microscopio estándar. Nuestro software utiliza una heurística simple de formación de imágenes junto con Rayleigh-Sommerfeld de propagación hacia atrás para producir la posición en tres dimensiones y la geometría de un objeto de fase microscópica. 

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Determining heat and mechanical pain threshold in inflamed skin of human subjects

In a previous article in the Journal of Visualized Experiments we have demonstrated skin microdialysis techniques for the collection of tissue-specific nociceptive and inflammatory biochemicals in humans. In this article we will show pain-testing paradigms that are often used in tandem with microdialysis procedures. Combining pain tests with microdialysis provides the critical link between behavioral and biochemical data that allows identifying key biochemicals responsible for generating and propagating pain.
Two models of evoking pain in inflamed skin of human study participants are shown. The first model evokes pain with aid of heat stimuli. Heat evoked pain as described here is predominantly mediated by small, non-myelinated peripheral nociceptive nerve fibers (C-fibers). The second model evokes pain via punctuated pressure stimuli. Punctuated pressure evoked pain is predominantly mediated by small, myelinated peripheral nociceptive nerve fibers (A-delta fibers). The two models are mechanistically distinct and independently examine nociceptive processing by the two major peripheral nerve fiber populations involved in pain signaling.
Heat pain is evoked with aid of the TSA II, a commercially available thermo-sensory analyzer (Medoc Advanced Medical Systems, Durham, NC). Stimulus configuration and delivery is handled with aid of specific software. Thermodes vary in size and shape but in principle consist of a metal plate that can be heated or cooled at various rates and for different periods of time. Algorithms assessing heat-evoked pain are manifold. In the experiments shown here, study participants are asked to indicate at what point they start experiencing pain while the thermode in contact with skin is heated at a predetermined rate starting at a temperature that does not evoke pain. The thermode temperature at which a subject starts experiencing pain constitutes the heat pain threshold.
Mechanical pain is evoked with punctuated probes. Such probes are commercially available from several manufacturers (von Frey hairs). However, the accuracy of von Frey hairs has been criticized and many investigators use custom made punctuated pressure probes. In the experiments shown here eight custom-made punctuated probes of different weights are applied in consecutive order, a procedure called up-down algorithm, to identify perceptional deflection points, i.e., a change from feeling no pain to feeling pain or vice versa. The average weight causing a perceptional deflection constitutes the mechanical pain threshold.

Algorithms assessing heat and mechanical pain thresholds in experimentally inflamed skin of human study subjects are shown. The two pain testing paradigms independently examine nociceptive processing by the two major peripheral nerve fiber populations transmitting pain, i.e., non-myelinated C fibers and small myelinated A-delta fibers.

Determinar el calor y el umbral de dolor mecánico en la piel inflamada de los sujetos humanos

In a previous article in the Journal of Visualized Experiments we have demonstrated skin microdialysis techniques for the collection of tissue-specific ...

Investigación

Biología

Digital Microfluidics for Automated Proteomic Processing

Clinical proteomics has emerged as an important new discipline, promising the discovery of biomarkers that will be useful for early diagnosis and prognosis of disease. While clinical proteomic methods vary widely, a common characteristic is the need for (i) extraction of proteins from extremely heterogeneous fluids (i.e. serum, whole blood, etc.) and (ii) extensive biochemical processing prior to analysis. Here, we report a new digital microfluidics (DMF) based method integrating several processing steps used in clinical proteomics. This includes protein extraction, resolubilization, reduction, alkylation and enzymatic digestion. Digital microfluidics is a microscale fluid-handling technique in which nanoliter-microliter sized droplets are manipulated on an open surface. Droplets are positioned on top of an array of electrodes that are coated by a dielectric layer - when an electrical potential is applied to the droplet, charges accumulate on either side of the dielectric. The charges serve as electrostatic handles that can be used to control droplet position, and by biasing a sequence of electrodes in series, droplets can be made to dispense, move, merge, mix, and split on the surface. Therefore, DMF is a natural fit for carrying rapid, sequential, multistep, miniaturized automated biochemical assays. This represents a significant advance over conventional methods (relying on manual pipetting or robots), and has the potential to be a useful new tool in clinical proteomics.
Mais J. Jebrail, Vivienne N. Luk, and Steve C. C. Shih contributed equally to this work.
Sergio L. S. Freire's current address is at the University of the Sciences in Philadelphia located at 600 South 43rd Street, Philadelphia, PA 19104.

Digital Microfluidics is a technique characterized by the manipulation of discrete droplets (~nL - mL) on an array of electrodes by the application of electrical fields. It is well-suited for carrying out rapid, sequential, miniaturized automated biochemical assays. Here, we report a platform capable of automating several proteomic processing steps.

Microfluídica digitales para el procesamiento automatizado de Proteómica

Clinical proteomics has emerged as an important new discipline, promising the discovery of biomarkers that will be useful for early diagnosis and ...

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and cellular content. Hallmark events of mitosis, such as chromosome movement, can be readily tracked on an individual cell basis using time-lapse fluorescence microscopy of mammalian cell lines expressing specific GFP-tagged proteins. In combination with RNAi-based depletion, this can be a powerful method for pinpointing the stage(s) of mitosis where defects occur after levels of a particular protein have been lowered. In this protocol, we present a basic method for assessing the effect of depleting a potential mitotic regulatory protein on the timing of mitosis. Cells are transfected with siRNA, placed in a stage-top incubation chamber, and imaged using an automated fluorescence microscope. We describe how to use software to set up a time-lapse experiment, how to process the image sequences to make either still-image montages or movies, and how to quantify and analyze the timing of mitotic stages using a cell-line expressing mCherry-tagged histone H2B. Finally, we discuss important considerations for designing a time-lapse experiment. This strategy is complementary to other approaches and offers the advantages of 1) sensitivity to changes in kinetics that might not be observed when looking at cells as a population and 2) analysis of mitosis without the need to synchronize the cell cycle using drug treatments. The visual information from such imaging experiments not only allows the sub-stages of mitosis to be assessed, but can also provide unexpected insight that would not be apparent from cell cycle analysis by FACS.

Here we describe a basic protocol to image and quantify the mitotic timing of live mammalian tissue culture cells after siRNA transfection.

Time-lapse de imágenes de mitosis después de la transfección de siRNA

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and temporal resolution to study in vivo hematopoiesis using the murine bone marrow transplant experimental model. Genetic combinatorial marking using lentiviral vectors encoding fluorescent proteins (FPs) enabled cell fate mapping through advanced microscopy imaging. Vectors encoding five different FPs: Cerulean, EGFP, Venus, tdTomato, and mCherry were used to concurrently transduce HSPCs, creating a diverse palette of color marked cells. Imaging using confocal/two-photon hybrid microscopy enables simultaneous high resolution assessment of uniquely marked cells and their progeny in conjunction with structural components of the tissues. Volumetric analyses over large areas reveal that spectrally coded HSPC-derived cells can be detected non-invasively in various intact tissues, including the bone marrow (BM), for extensive periods of time following transplantation. Live studies combining video-rate multiphoton and confocal time-lapse imaging in 4D demonstrate the possibility of dynamic cellular and clonal tracking in a quantitative manner.

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

Combinatorial 5 fluorescent proteins marking of hematopoietic stem and progenitor cells allows in vivo clonal tracking via confocal and two-photon microscopy, providing insights into bone marrow hematopoietic architecture during regeneration. This method allows non-invasive fate mapping of spectrally-coded HSPCs-derived cells in intact tissues for extensive periods of time following transplantation.

En Tracking Clonal vivo de madre hematopoyéticas y células progenitoras Marcado por cinco proteínas fluorescentes utilizando confocal y Microscopía Multifotónica

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

En Vivo Tracking 4-Dimensional de madre hematopoyéticas y células progenitoras en ratones adultos de calota de Médula Ósea

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Simple Bulk Readout of Digital Nucleic Acid Quantification Assays

Digital assays are powerful methods that enable detection of rare cells and counting of individual nucleic acid molecules. However, digital assays are still not routinely applied, due to the cost and specific equipment associated with commercially available methods. Here we present a simplified method for readout of digital droplet assays using a conventional real-time PCR instrument to measure bulk fluorescence of droplet-based digital assays.
We characterize the performance of the bulk readout assay using synthetic droplet mixtures and a droplet digital multiple displacement amplification (MDA) assay. Quantitative MDA particularly benefits from a digital reaction format, but our new method&#160;applies to any digital assay. For established digital assay protocols such as digital PCR, this method serves to speed up and simplify assay readout.
Our bulk readout methodology brings the advantages of partitioned assays without the need for specialized readout instrumentation. The principal limitations of the bulk readout methodology are reduced dynamic range compared with droplet-counting platforms and the need for a standard sample, although the requirements for this standard are less demanding than for a conventional real-time experiment. Quantitative whole genome amplification (WGA) is used to test for contaminants in WGA reactions and is the most sensitive way to detect the presence of DNA fragments with unknown sequences, giving the method great promise in diverse application areas including pharmaceutical quality control and astrobiology.

We describe an endpoint digital assay for quantifying nucleic acids with a simplified (analog) readout. We measure bulk fluorescence of droplet-based digital assays using a standard qPCR machine rather than specialized instrumentation and confirm our results by microscopy.

Lectura granel simple de Digital ácidos nucleicos Cuantificación ensayos

Digital assays are powerful methods that enable detection of rare cells and counting of individual nucleic acid molecules. However, digital assays are ...

Magnetic-Activated Cell Sorting Strategies to Isolate and Purify Synovial Fluid-Derived Mesenchymal Stem Cells from a Rabbit Model

Mesenchymal stem cells (MSCs) are the main cell source for cell-based therapy. MSCs from articular cavity synovial fluid could potentially be used for cartilage tissue engineering. MSCs from synovial fluid (SF-MSCs) have been considered promising candidates for articular regeneration, and their potential therapeutic benefit has made them an important research topic of late. SF-MSCs from the knee cavity of the New Zealand white rabbit can be employed as an optimized translational model to assess human regenerative medicine. By means of CD90-based magnetic activated cell sorting (MACS) technologies, this protocol successfully obtains rabbit SF-MSCs (rbSF-MSCs) from this rabbit model and further fully demonstrates the MSC phenotype of these cells by inducing them to differentiate to osteoblasts, adipocytes, and chondrocytes. Therefore, this approach can be applied in cell biology research and tissue engineering using simple equipment and procedures.

This article presents a simple and economic protocol for the straightforward isolation and purification of mesenchymal stem cells from New Zealand white rabbit synovial fluid.

Célula activada por el magnético clasificación estrategias para aislar y purificar sinovial líquido mesenquimales células madre derivadas de un modelo de conejo

Mesenchymal stem cells (MSCs) are the main cell source for cell-based therapy. MSCs from articular cavity synovial fluid could potentially be used for ...

Micron-scale Phenotyping Techniques of Maize Vascular Bundles Based on X-ray Microcomputed Tomography

It is necessary to accurately quantify the anatomical structures of maize materials based on high-throughput image analysis techniques. Here, we provide a 'sample preparation protocol' for maize materials (i.e., stem, leaf, and root) suitable for ordinary microcomputed tomography (micro-CT) scanning. Based on high-resolution CT images of maize stem, leaf, and root, we describe two protocols for the phenotypic analysis of vascular bundles: (1) based on the CT image of maize stem and leaf, we developed a specific image analysis pipeline to automatically extract 31 and 33 phenotypic traits of vascular bundles; (2) based on the CT image series of maize root, we set up an image processing scheme for the three-dimensional (3-D) segmentation of metaxylem vessels, and extracted two-dimensional (2-D) and 3-D phenotypic traits, such as volume, surface area of metaxylem vessels, etc. Compared with traditional manual measurement of vascular bundles of maize materials, the proposed protocols significantly improve the efficiency and accuracy of micron-scale phenotypic quantification.

We provide a novel method to improve the X-ray absorption contrast of maize tissue suitable for ordinary microcomputed tomography scanning. Based on CT images, we introduce a set of image-processing workflows for different maize materials to effectively extract microscopic phenotypes of vascular bundles of maize.

Técnicas de microescala Phenotyping de maíz haces vasculares basados en tomografía de rayos x Microcomputed

It is necessary to accurately quantify the anatomical structures of maize materials based on high-throughput image analysis techniques. Here, we provide a ...

Biological Sample Preparation by High-pressure Freezing, Microwave-assisted Contrast Enhancement, and Minimal Resin Embedding for Volume Imaging

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the imaging modality in a focused ion beam scanning electron microscope (FIB-SEM), which is used to obtain stacks of sequential images for 3D reconstruction and modelling. High-pressure freezing (HPF) allows close to native structural preservation, but the subsequent freeze substitution often does not provide sufficient contrast, especially for a bigger specimen, which is needed for high-quality imaging in the SEM required for 3D reconstruction. Therefore, in this protocol, after the freeze substitution, additional contrasting steps are carried out at room temperature. Although these steps are performed in a microwave, it is also possible to follow traditional bench processing, which requires longer incubation times.The subsequent embedding in minimal amounts of resin allows for faster and more precise targeting and preparation inside the FIB-SEM. This protocol is especially useful for samples that require preparation by high-pressure freezing for a reliable ultrastructural preservation but do not gain enough contrast during the freeze substitution for volume imaging using FIB-SEM. In combination with the minimal resin embedding, this protocol provides an efficient workflow for the acquisition of high-quality volume data.

Here we present a protocol for combining two sample processing techniques, high-pressure freezing and microwave-assisted sample processing, followed by minimal resin embedding for acquiring data with a focused ion beam scanning electron microscope (FIB-SEM). This is demonstrated using a mouse tibial nerve sample and Caenorhabditis elegans.

Preparación de muestras biológicas por congelación de alta presión, realce del contraste asistida por microondas y mínima inclusión de proyección de imagen de volumen

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the ...

Cryo-Electron Microscopic Grid Preparation for Time-Resolved Studies using a Novel Robotic System, Spotiton

The capture of short-lived molecular states triggered by the early encounter of two or more interacting particles continues to be an experimental challenge of great interest to the field of cryo-electron microscopy (cryo-EM). A few methodological strategies have been developed that support these &#34;time-resolved&#34; studies, one of which, Spotiton-a novel robotic system-combines the dispensing of picoliter-sized sample droplets with precise temporal and spatial control. The time-resolved Spotiton workflow offers a uniquely efficient approach to interrogate early structural rearrangements from minimal sample volume. Fired from independently controlled piezoelectric dispensers, two samples land and rapidly mix on a nanowire EM grid as it plunges toward the cryogen. Potentially hundreds of grids can be prepared in rapid succession from only a few microliters of a sample. Here, a detailed step-by-step protocol of the operation of the Spotiton system is presented with a focus on troubleshooting specific problems that arise during grid preparation.

The protocol presented here describes the use of Spotiton, a novel robotic system, to deliver two samples of interest onto a self-wicking, nanowire grid that mix for a minimum of 90 ms prior to vitrification in liquid cryogen.