著者らは、微生物学的製剤による支援をリンダ·ターナーに感謝します。 RZとLGWはハーバード大学とCGBでローランド研究所によって資金を供給されたが国境プログラム、ブラジル（プロセス＃の7340-11-7）なしでCAPES財団の学者、科学として資金を供給された

1。セットアップとデータ収集<ol><li>凍結ストック22から連鎖球菌菌株V4051-197 KTY培地（スムーズな水泳）細胞の培養物を育てる。飽和するまで、35℃、150rpmで一晩、回転式シェーカーでインキュベートする。 </li><li>飽和文化500μlの新鮮なKTY培地10mlに接種。細胞はλ= 600nmで（約5×10 8個/ ml）で約1.0の光学密度に達するまで35℃、150rpmでさらに3.5時間インキュベートする。 </li><li>運動性細胞の最終濃度を得るために、新鮮な培地で1:400に希釈する。 </li><li>顕微鏡スライド上に、高さが1ミリメートルの周りに（ 例えば 、石油ゼリーで充填されたシリンジから）グリースのリングを作り、中央での試料溶液の液滴を配置します。液体は、スライドとカバーガラスの両方に接触していることを確実にシールするために縁部に上部及び軽くプレスでカバーガラスを配置します。得られた試​​料室はarouでなければなりませんND深さ100〜200程度である。 </li><li>ガラスとレンズとの間にオイル中の気泡の形成を防止するために、慎重に下向きにカバーガラスを顕微鏡で試料室を配置し、。 </li><li>試料室の底面に顕微鏡の焦点を、そして集中する凝縮をもたらす。 </li><li>標準照明の電源を切り、顕微鏡のコンデンサー絞りの後ろにLEDヘッドを配置します。最大出力につながった電源装置を設定します。 </li><li>最大限に収束絞りを閉じ、照明は、対物レンズの開口の中央に来るよう、必要であれば、そのマウントのLEDを微調整。 </li><li>パソコンとカメラの電源を入れ、そして、顕微鏡のカメラポートにすべての光の方向を変える。画像取得ソフトウェアでフレームレート及び画像サイズを調整する。 </li><li>まだ良好なコントラストを維持しながら、可能な限り短いフレーム露光時間を作る。画像がな飽和ではないことを保証するために、画像輝度ヒストグラムをチェックするテッドまたは露出不足。 </li><li>必要に応じて、関心のある対象を少し（10〜30ミクロンで、通常）デフォーカスされるように、顕微鏡に再び焦点を合わせる。オブジェクトとは、焦点面（焦点面が試料室の内部にあるべきである、すなわち、）同じ培地であるべきである。 </li></ol> 2。再建処理データの最初のステップは、数値的に画像のスタックを生成する、異なる深さの一連のビデオフレームをリフォーカスすることである。これを行うためのユーザーフレンドリーなソフトウェアは、ここで見つけることができる： <a href="http://www.rowland.harvard.edu/rjf/wilson/Downloads.html">http://www.rowland.harvard.edu/rjf/wilson/Downloads.html</a>例画像（倒立顕微鏡を用いて取得し、60X油浸対物レンズ）と一緒に光線のためのシーンファイルは、レンダリングを追跡した。 <ol><li>インターフェイス上の関連するボックスに入力着目フレームおよび個別の画像ファイルとしてのそれぞれの背景。背景イメージは、そのFフレームですエアリーホログラムの非存在下で、映像の背景を表しており、ホログラム局在化および分析を妨害する可能性の固定パターンノイズを抑制するために使用される。 </li><li>プログラムを実行する前に、画面の左側にあるグローバル設定ボックスに値を入力します。最初の3つは、出力スタックパラメータである：最初のフレームの軸方向の位置（ &#39;焦点を起動&#39;）;再構成されたスタック内のスライスの数（ &#39;ステップ数&#39;）;スタック内の各スライス間の軸方向の距離（「ステップサイズ」） 。 </li><li>正しい比率でオブジェクトを再構成するために、ステップサイズは横方向の画素間隔と同じ大きさであるべきである。 「ピクセル/ミクロン」のボックスは、最後の2ボックス内の照明波長と中屈折率で、カメラの横のサンプリング周波数（1/pixel間隔）を入力します。プログラムのデフォルト値は、例えば、データを再構成するのに適している。 </li><li> 「フリップZ傾斜」ボタンを押すと+で記述されたクラスライブラリの中心CTはホログラムに暗くなる（例えば、フレーム2005やより詳細な情報については議論のセクションを参照）。 </li><li>オン/オフ状態のバンドパスフィルタをチェックします（デフォルトはオン）。勾配フリップスイッチの下のボックスにあり、このオプションのバンドパスフィルタは、ノイズの多いピクセルからの寄与を抑制するための責任があります。バンドパスフィルタを直ちに生成した後、各画像スライスに適用される。 </li><li>オン/オフ状態（デフォルトはオン）上の中間出力スイッチをオンにします。中間解析の手順が圧縮されていないとして、2出力ビデオで書かれているAVIファイル：。 &#39;で終わる最初のリフォーカススタック（&#39; _stack.avi &#39;で終わるファイル名）であり、二つ目は、軸方向勾配操作後にスタックです（ファイル名_gradient.avi &#39;）。理想的には、この第二のスタックは、対象となる被写体が暗い背景に対して明るい被写体として強調含まれています。 </li><li>メインウィンドウですべてのパラメータを押し「ファイル名を指定して実行」を設定した後。選択したフレームは、本ソフトウェアのメイン·ボックスに表示されます。 </li><li>使用（左クリック）にズームインし、（+左クリックをシフト）ズームアウトするイメージの左にあるツールバーに虫眼鏡ツール。関心領域（ROI）を選択するために、ツールバーの矩形ツールを使用してください。これは再構築を最適化するように、長方形の中に可能な限りのホログラムの干渉縞のような多くをキャプチャします。 </li><li> 2画像スタックを生成するために、「プロセス」ボタンを押してください。 （で無料で取得することができるのImageJ使用して結果のスタック点検し<a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/">http://rsb.info.nih.gov/ij/を</a> ）。関心のある物体がはっきりと勾配画像スタックに見られる場合には、物体座標を抽出するために、次のステップに進む。 </li></ol> 3。レンダリング<ol><li>フレーム再集束に加えて、このプログラムのx、y、zは、関心対象の各ボクセルの座標を見つけることができる。この機能を有効にするには、「特徴抽出」ボタンを押してください。 </li><li>のために、（ホームの output.inc ：C：など）拡張子を含むパスを入力してください出力は、ファイルを調整します。 「出力座標スタイル &#39;ボックスに「POV-Rayのスタイル」を選択します。これは、プログラムが（から取得することができる無料のPOV-Rayのレイトレーシングソフトウェアパッケージを用いて可視化することができるオブジェクト·ファイルの書き込みさせ<a href="http://www.povray.org/">http://www.povray.org/を</a> ）。 </li><li>上記のセクション2のように、画像を再処理します。プログラムは、「出力座標」ボックスにファイル名に書き込む（x、y、z）の一連の選択されたROI座標を提供する。オブジェクト座標の抽出はスタックの世代よりもはるかに長い時間がかかります。 </li><li>座標は単に生成されたファイルとして（再コードに付属）サンプルPOV-Rayのファイルが同じフォルダにあることを確認してください。サンプル。POVファイルを編集し、行に引用符でファイル名を置き換える ＃ &quot;はてmyfile.inc」を含む 再構成コードによって生成されたデータファイルの名前を持つ。 </li><li>ビットマップ画像を描画するために、POV-Rayの中で「ファイル名を指定して実行]ボタンをクリックします。 T彼はカメラ位置、照明やテクスチャのオプションは、POV-Rayの中で可能なカスタマイズのほんの一部です。詳細については、オンラインマニュアルを参照してください。 </li></ol>

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	<li>Xu, W., Jericho, M. H., Meinertzhagen, I. A., Kreuzer, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+in-line+holography+for+biological+applications.">Digital in-line holography for biological applications.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98 (20), 11301-11305 (2001).</li><li>Sheng, J., Malkiel, E., Katz, J., Adolf, J., Belas, R., Place, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+holographic+microscopy+reveals+prey-induced+changes+in+swimming+behavior+of+predatory+dinoflagellates.">Digital holographic microscopy reveals prey-induced changes in swimming behavior of predatory dinoflagellates.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 17512-17517 (2007).</li><li>Lee, S. H., Roichman, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+and+tracking+single+colloidal+particles+with+video+holographic+microscopy.">Characterizing and tracking single colloidal particles with video holographic microscopy.</a> Opt. Express. 15 (26), 18275-18282 (2007).</li><li>Fung, J., Martin, K. E., Perry, R. W., Katz, D. M., McGorty, R., Manoharan, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+translational,+rotational,+and+vibrational+dynamics+in+colloids+with+digital+holographic+microscopy.">Measuring translational, rotational, and vibrational dynamics in colloids with digital holographic microscopy.</a> Opt. Express. 19 (9), 8051-8065 (2011).</li><li>Lee, S. H., Grier, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Holographic+microscopy+of+holographically+trapped+three-dimensional+structures.">Holographic microscopy of holographically trapped three-dimensional structures.</a> Opt. Express. 15 (4), 1505-1512 (2007).</li><li>Kim, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+and+techniques+of+digital+holographic+microscopy.">Principles and techniques of digital holographic microscopy.</a> SPIE Rev. 1, 018005 (2010).</li><li>Corkidi, G., Taboada, B., Wood, C. D., Guerrero, A., Darszon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+sperm+in+three-dimensions.">Tracking sperm in three-dimensions.</a> Biochem. Biophys. Res. Comm. 373, 125-129 (2008).</li><li>Santi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+Sheet+Fluorescence+Microscopy+:+A+Review.">Light Sheet Fluorescence Microscopy : A Review.</a> J. Histochem. Cytochem. 59, 129-138 (2011).</li><li>van Blaaderen, A., Wiltzius, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Real-Space Structure of Colloidal Hard-Sphere Glasses. Science. 270, 1177-1179 (1990).</li><li>Besseling, R., Weeks, E. R., Schofield, A. B., Poon, W. C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-Dimensional+Imaging+of+Colloidal+Glasses+under+Steady+Shear.">Three-Dimensional Imaging of Colloidal Glasses under Steady Shear.</a> Phys. Rev. Lett. 99, 028301 (2007).</li><li>Schall, P., Weitz, D., Spaepen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+Rearrangements+That+Govern+Flow+in+Colloidal+Glasses.">Structural Rearrangements That Govern Flow in Colloidal Glasses.</a> Science. 318, 1895-1899 (2007).</li><li>Rosen, J., Brooker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+incoherent+color+holography.">Fluorescence incoherent color holography.</a> Opt. Exp. 15, 2244-2250 (2007).</li><li>Jericho, M. H., Kreuzer, H. J., Kanka, M., Riesenberg, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+phase+and+refractive+index+measurements+with+point-source+digital+in-line+holographic+microscopy.">Quantitative phase and refractive index measurements with point-source digital in-line holographic microscopy.</a> Appl. Opt. 51 (10), 1503-1515 (2012).</li><li>Mudanyali, O., Erlinger, A., Seo, S., Su, T., Ozcan, D. T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lensless+On-chip+Imaging+of+Cells+Provides+a+New+Tool+for+High-throughput+Cell-Biology+and+Medical.">Lensless On-chip Imaging of Cells Provides a New Tool for High-throughput Cell-Biology and Medical.</a> J. Vis. Exp. 34, (2009).</li><li>Langehanenberg, P., Kemper, B., Dirksen, D., von Bally, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autofocusing+in+digital+holographic+phase+contrast+microscopy+on+pure+phase+objects+for+live+cell+imaging.">Autofocusing in digital holographic phase contrast microscopy on pure phase objects for live cell imaging.</a> Appl. Opt. 47 (19), (2008).</li><li>Elliot, M. S., Poon, W. C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conventional+optical+microscopy+of+colloidal+suspensions.">Conventional optical microscopy of colloidal suspensions.</a> Adv. Coll. Interf. Sci. 92, 133-194 (2001).</li><li>Agero, U., Monken, C. H., Ropert, C., Gazzinelli, R. T., Mesquita, O. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+surface+fluctuations+studied+with+defocusing+microscopy.">Cell surface fluctuations studied with defocusing microscopy.</a> Phys. Rev. E. 67, 051904 (2003).</li><li>Born, M., Wolf, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Principles of Optics, 6th Ed. , (1998).</li><li>Wilson, L., Zhang, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+Localization+of+weak+scatterers+in+digital+holographic+microscopy+using+Rayleigh-Sommerfeld+back-propagation.">3D Localization of weak scatterers in digital holographic microscopy using Rayleigh-Sommerfeld back-propagation.</a> Opt. Express. 20, 16735-16744 (2012).</li><li>Bohren, C., Huffman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Absorption and Scattering of Light by Small Particles. , (1983).</li><li>Balaev, A. E., Dvoretski, K. N., Doubrovski, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Refractive+index+of+escherichia+coli+cells.">Refractive index of escherichia coli cells.</a> Saratov Fall Meeting 2001: Optical Technologies in Biophysics and Medicine III. 4707 (1), 253-260 (2002).</li><li>Berg, H. C., Manson, M. D., Conley, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+and+Energetics+of+Flagellar+Rotation+in+Bacteria.">Dynamics and Energetics of Flagellar Rotation in Bacteria.</a> Symp. Soc. Exp. Biol. 35, 1-31 (1982).</li><li>Garcia-Sucerquia, J., Xu, W., Jericho, S. K., Klages, P., Jericho, M. H., Kreuzer, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+in-line+holographic+microscopy.">Digital in-line holographic microscopy.</a> Appl. Optics. 45 (5), 836-850 (2006).</li><li>Restrepo, J. F., Garcia-Sucerquia, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnified+reconstruction+of+digitally+recorded+holograms+by+Fresnel-Bluestein+transform.">Magnified reconstruction of digitally recorded holograms by Fresnel-Bluestein transform.</a> Appl. Optics. 49 (33), 6430-6435 (2010).</li><li>Dubois, F., Joannes, L., Legros, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+three-dimensional+imaging+with+a+digital+holography+microscope+with+a+source+of+partial+spatial+coherence.">Improved three-dimensional imaging with a digital holography microscope with a source of partial spatial coherence.</a> Appl. Optics. 38 (34), 7085-7094 (1999).</li><li>Kanka, M., Riesenberg, R., Petruck, P., Graulig, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+resolution+(NA=0.8)+in+lensless+in-line+holographic+microscopy+with+glass+sample+carriers.">High resolution (NA=0.8) in lensless in-line holographic microscopy with glass sample carriers.</a> Opt. Lett. 36 (18), 3651-3653 (2011).</li><li>Dubois, F., Requena, M. L., Minetti, C., Monnom, O., Istasse, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partial+spatial+coherence+effects+in+digital+holographic+microscopy+with+a+laser+source.">Partial spatial coherence effects in digital holographic microscopy with a laser source.</a> Appl. Optics. 43 (5), 1131-1139 (2004).</li><li>Magariyama, Y., Sugiyama, S., Muramoto, K., Kawagishi, I., Imae, Y., Kudo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+measurement+of+bacterial+flagellar+rotation+rate+and+swimming+speed.">Simultaneous measurement of bacterial flagellar rotation rate and swimming speed.</a> Biophysical Journal. 69 (5), 2154-2162 (1995).</li><li>Berg, H. C., Brown, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotaxis+in+Escherichia+coli+analysed+by+three-dimensional+tracking.">Chemotaxis in Escherichia coli analysed by three-dimensional tracking.</a> Nature. 239 (5374), 500-504 (1972).</li><li>Brooker, G., Siegel, N., Wang, V., Rosen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimal+resolution+in+Fresnel+incoherent+correlation+holographic+fluorescence+microscopy.">Optimal resolution in Fresnel incoherent correlation holographic fluorescence microscopy.</a> Opt. Express. 19 (6), 5047-5062 (2011).</li></ol>

著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。

この実験プロトコルの中で最も重要なステップは、安定した実験装置からの画像の正確なキャプチャです。貧しい背景データと、高忠実度の再構築は不可能に近い。これは、再構成された画像を劣化させることができるように、（対物レンズの背面から見て暗色年輪として可視）内部位相差素子と対物レンズを回避することも重要である。関心のあるオブジェクトは、回折縞のいくつかのペ?...

デジタルインラインホログラフィ顕微鏡法（DIHM）は、標準的な顕微鏡のセットアップへの最小限の変更で、微生物1,2とソフト物質系3,4水泳などの微細なサンプルを迅速に3次元画像化することができます。本論文ではDIHMの教育的なデモは、当社の研究室で開発されたソフトウェアを中心に、提供されています。本稿では、顕微鏡のセットアップデータの取得を最適化し、3次元データを再構成するために記録画像を処理する方法の説明が含まれています。ソフトウェア（DGグリアら5によって開発されたソフトウェアに一部基づいて）および実施例の画像は、当社のウェブサイト上で自由にご利用いただけます。説明は、顕微鏡を構成するホログラムから三次元ボリュームを再構成し、ソフトウェアパッケージのトレース自由線を用い、目的の結果としてのボリュームをレンダリングするのに必要なステップが設けられている。論文は、再構成の品質に影響を与える要因についての議論で締めくくりと競合する方法とDIHMの比較。 DIHMが（キム6を参照して、その原則と発展の全般的なレビューのために）いくつかの時間前に説明したが、必要な演算能力と画像処理の専門知識は、これまで主に、機器の開発を中心とした専門家の研究グループに、その使用を制限している。この状況は、コンピューティングおよびカメラ技術における最近の進歩に照らして変化している。近代的なデスクトップコンピュータを簡単に処理し、データストレージ要件に対応できる、CCDまたはCMOSカメラは、ほとんどの顕微鏡ラボに存在し、かつ、必要なソフトウェアは、技術の開発に時間を投資しているグループが、インターネット上で自由に利用できるようにされています。 様々なスキームは、三次元試料体積に微視的オブジェクトの構成を撮像するために提案されている。これらの多くは、画像のスタックがmで記録された技術は7,8、スキャンするechanically試料を通って像面の翻訳。共焦点蛍光顕微鏡をスキャンすると、おそらく最も身近な例である。典型的には、蛍光染料は、サンプルコントラストの許容レベルを達成するために、位相物体に添加し、共焦点配置は、空間的に蛍光発光を局在化するために使用される。この方法は、混雑したシステム9-11の三次元ダイナミクスへのアクセスを許可しているコロイド科学において、例えば有意な進歩をもたらした。ラベルの使用は、蛍光共焦点顕微鏡とDIHMの重要な違いですが、2つの技術のその他の特徴は、比較する価値があります。 DIHMは装置が可動部品を持たないという点で重要な速度の利点を持っています。共焦点システムにおける機械的な走査ミラーは、データ取得速度に上限を置く - 512×512ピクセルの画像のための、典型的には約30フレーム/秒。異なる焦点面からのような画像のスタックは、物理的に：訳で得ることができる30フレームスタック毎秒約1ボリュームの最終的な捕捉率につながる、フレーム間の試料ステージや対物レンズating。比較において、現代のCMOSカメラに基づいて、ホログラフィシステムは、同じ画像サイズと解像度で2000フレーム/秒をキャプチャすることができ、各フレームはサンプルボリュームの独立したスナップショットを与えるためにオフライン `&#39;を処理する。繰り返しになります。システムは、蛍光被写体12のホログラフィック再構成を実行するように開発されてきたが、蛍光サンプルは、DIHMには必要ありません。ならびに三次元ボリューム情報は、DIHMも定量的位相コントラスト画像13を提供するために使用することができるが、それは、ここでの議論の範囲外である。 生DIHMデータ画像は2次元であり、いくつかの点で、焦点の外ではあるが、標準的な顕微鏡画像のように見える。 DIHM標準明視野顕微鏡の主な違いは、オブジェクトを囲む回折リングにあるInの視野は、これらは、照明の性質によるも​​のである。一般的に、LEDまたはレーザー - DIHM明視野よりも多くのコヒーレント光源を必要とします。ホログラムの回折リングは、三次元画像を再構築するために必要な情報が含まれている。ダイレクトフィッティングと数値リフォーカシング; DIHMデータを解釈するには、2つの主要なアプローチがあります。最初のアプローチは、回折パターンの数学的形式が予め3,4において知られている場合においても適用可能であり、この状態は、球、円柱、および半平面上の障害のような単純なオブジェクトの一握りによって満たされる。直接フィッティングはまた、オブジェクトの軸方向の位置が既知である場合に適用され、画像は、画像テンプレート14のルックアップテーブルを用いて取り付けることができる。 第二のアプローチ（数字リフォーカス）がむしろ一般的であり、数値的に光場を再構成するために、二次元画像のホログラム回折リングを使用に依存しているサンプル量全体（任意間隔）フォーカルプレーンの数。いくつかの関連するメソッドは、この6を行うために存在し、リーとグリア5で説明したように、この作品は、バックプロパゲーション法をレイリー·ゾンマーフェルトを使用しています。この手順の結果は、手動で顕微鏡の焦点面（名前の由来 `数値リフォーカシング &#39;）を変更した場合の効果を再現する画像のスタックです。画像のスタックが生成されると、焦点体積内の被写体の位置を得なければならない。このような局所強度分散または空間周波数コンテンツとして画像解析ヒューリスティックの数は、試料15中の異なる点で焦点の鮮明度を定量化するために提示されている。特定の画像メトリックが最大化​​（または最小化）されたときにそれぞれの場合において、オブジェクトが焦点にあると考えられる。 オブジェクトが「ピントが合って」で、特定の焦点面を識別しようと他の方式とは異なり、この作品における方法は、pを選び出す焦点面の広い範囲で延長することができる対象となる物体の内側にあるoints、。このアプローチは、被験体の広い範囲に適用可能であり、そのような棒状コロイド、細菌の鞭毛鎖または真核生物のような拡張され、弱散乱サンプル（位相物体）に特に適している。物体が焦点面を通過する際にこのような試料では、画像のコントラストが変化し、それが他にある場合、オブジェクトが焦点面と暗い中心の一方の側にある場合、デフォーカス画像は、光の中心を有する。彼らは焦点面に正確に位置したときの純粋な位相物体なしコントラストがほとんどを持っている。コントラスト反転のこの現象は、他の著者によって16,17について議論し 、異常18グイ相へ、最終的に起因しているされています。これは他の場所で、技術の限界が評価される場所ホログラフィーの文脈で、より厳格な立場に置かれています。位置の典型的な不確実性は、EACさ150nm（約1ピクセル）のオーダーであるH方向19。グイ相が異常方法は、三次元で拡張されたオブジェクトの構造を決定するためのいくつかの明確に定義されたDIHM方式の一つであるが、それにもかかわらず、いくつかのオブジェクトが再構成する問題がある。 （カメラを指差し）を光軸に沿って直接うそのオブジェクトを正確に再構築することは困難である。オブジェクトの長さと位置の不確実性が大きくなる。この制限は、ホログラムを記録する画素の制限されたビット深度（カメラが記録することができる別個の階調数）に一部である。対象とする物体が焦点面に非常に近い場合に、別の問題の設定が行われます。この場合、対象物の実および仮想イメージは解釈が困難である複雑な光学場を生じさせる、近接して再構築さ​​れる。ここ二、やや少ないの重要な関心事は、得られた回折縞がこの粗い粒度のINFのイメージセンサの少ないを占有していることであるormationが悪く品質の再構築につながる。 実際には、単純な勾配フィルタは、照射方向に沿った強い強度の反転を検出するための三次元再構成されたボリュームに適用される。強度は、暗い、またはその逆に光から迅速に変化する領域は、次いで、散乱領域に関連付けられる。これらの個々の寄与の合計が簡単にレイリー·ゾンマーフェルトバックプロパゲーション法を用いて反転され、全散乱場を与えるために、弱散乱体がよく、そのような要素20の非干渉コレクションとして記載されている。本論文では、軸方向の強度勾配技術は連鎖球菌細胞のチェーンに適用されます。細胞体は、位相物体である（種E.コリは ​​、波長λ= 589 nmで1.384であると21を測定した屈折率を有し、 ストレプトコッカス株は類似している可能性がある）とに接続されたブロブの高輝度鎖として現れる目勾配フィルタ後の電子の試料体積が適用された。この濾過ボリュームに適用基準閾値と特徴抽出方法は、細胞内領域に対応する体積画素（ボクセル）の抽出を可能にする。この方法の特別な利点は、それが軸方向の物体の位置の明確な再構成を可能にすることである。同様の方法が（少なくとも、顕微鏡対物レンズを通して撮像対象に近いもの、そのレコードのホログラムは、）、この変位の符号を決定することができないことに苦しんでいます。レイリー·ゾンマーフェルト再構成法もあるが、署名に依存しないこの意味では、勾配の動作は、私たちは、焦点面の上下の弱位相物体を区別することができます。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="780">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;width:180px;">Nikon Eclipse Ti-E inverted microscope</td>
			<td style="width:187px;">Nikon Corp.</td>
			<td style="width:147px;"> </td>
			<td style="width:267px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;width:180px;">LED</td>
			<td style="width:187px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:147px;">M660L3</td>
			<td style="width:267px;">emission wavelength &#955;=660 nm, linewidth approximately 20 nm </td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:180px;">LED power supply</td>
			<td style="width:187px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:147px;">LEDD1B</td>
			<td style="width:267px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:180px;">Thread Adapter</td>
			<td style="width:187px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:147px;">SM2T2</td>
			<td style="width:267px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:180px;">Thread Adapter</td>
			<td style="width:187px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:147px;">SM1A2</td>
			<td style="width:267px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:180px;">Frame Grabber board</td>
			<td style="width:187px;">EPIX </td>
			<td style="width:147px;">PIXCI E4 </td>
			<td style="width:267px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:180px;">High-Speed CMOS camera</td>
			<td style="width:187px;">Mikrotron</td>
			<td style="width:147px;">MC-1362</td>
			<td style="width:267px;"> </td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

digital inline holographic microscopy (dihm) of weakly-scattering subjects

このような小さなコロイド粒子であり、最も生物細胞のような弱散乱オブジェクトは、しばしば顕微鏡法で遭遇する。実際に、技術の範囲は、これらのより良好な位相物体を可視化するために開発されている。位相コントラストおよびDICは、コントラストを増強するための最も一般的な方法の一つである。しかしながら、外撮像面内方向の記録位置や形状が困難なままである。このレポートには、正確にデジタルインラインホログラフィ顕微鏡（DIHM）を使用して、場所と3次元のオブジェクトの形状を決定するための簡単​​な実験方法を紹介します。大まかに言えば、アクセス可能なサンプル容量を、横方向にカメラセンササイズ、および軸方向に、照明のコヒーレンスによって定義される。典型的なサンプル量は、LED照明を使用して200 ミクロン ×200 ミクロン ×200ミクロンから、の範囲レーザ照射を用いて5 ミリメートル×5mm角以上である。平面波が試料に入射するように、この照明光は、構成されている。サンプル容積内のオブジェクトは、次いで、照明方向に垂直な干渉パターンを形成する非散乱光と干渉する、光を散乱する。この画像（ホログラム）は、3次元再構成に必要な奥行き情報を含み、例えば、CMOSまたはCCDカメラなどの標準的な撮像素子上に撮像することができる。バックレイリー·ゾンマーフェルト伝搬法を数値顕微鏡画像をリフォーカスするために使用され、グイ位相に基づいて単純な撮像ヒューリスティックは、異常再構成されたボリューム内の散乱物体を識別するために使用される。このシンプルでありながら堅牢な方法は、顕微鏡の試料内のオブジェクトの位置や形状の明確な、モデルフリー測定、その結果。

DIHMの能力を実証するために、実験は、 ストレプトコッカス属細菌の鎖上で実施した。チェーン自体は長い10.5ミリメートルを測定し、範囲0.6〜1ミクロンの直径を有する6-7球面円柱細胞（チェーン内のセルの2が分裂に近い）から構成されていた。 図1aおよび1bのショーのメインインタフェースを復興とレンダリングソフトウェアの。数値的再集束手順の例は、?...

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Digital Inline Holographic Microscopy DIHM of Weakly-scattering Subjects

弱散乱物体の三次元位置が一意的に標準的な顕微鏡に軽微な改変を伴うデジタルインラインホログラフィック顕微鏡法（DIHM）を用いて同定することができる。当社のソフトウェアは、微細な位相物体の3次元位置と形状を得るためにレイリー·ゾンマーフェルトバックプロパゲーションと相まって、簡単な画像処理、ヒューリスティックを使用しています。

弱散乱被験者のデジタルインラインホログラフィ顕微鏡（DIHM）

Weakly-scattering objects, such as small colloidal particles and most biological cells, are frequently encountered in microscopy. Indeed, a range of ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Digital Inline Holographic Microscopy (DIHM) of Weakly-scattering Subjects

12.1K ビュー.  Harvard University. 弱散乱物体の三次元位置が一意的に標準的な顕微鏡に軽微な改変を伴うデジタルインラインホログラフィック顕微鏡法（DIHM）を用いて同定することができる。当社のソフトウェアは、微細な位相物体の3次元位置と形状を得るためにレイリー·ゾンマーフェルトバックプロパゲーションと相まって、簡単な画像処理、ヒューリスティックを使用しています?...

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Determining heat and mechanical pain threshold in inflamed skin of human subjects

In a previous article in the Journal of Visualized Experiments we have demonstrated skin microdialysis techniques for the collection of tissue-specific nociceptive and inflammatory biochemicals in humans. In this article we will show pain-testing paradigms that are often used in tandem with microdialysis procedures. Combining pain tests with microdialysis provides the critical link between behavioral and biochemical data that allows identifying key biochemicals responsible for generating and propagating pain.
Two models of evoking pain in inflamed skin of human study participants are shown. The first model evokes pain with aid of heat stimuli. Heat evoked pain as described here is predominantly mediated by small, non-myelinated peripheral nociceptive nerve fibers (C-fibers). The second model evokes pain via punctuated pressure stimuli. Punctuated pressure evoked pain is predominantly mediated by small, myelinated peripheral nociceptive nerve fibers (A-delta fibers). The two models are mechanistically distinct and independently examine nociceptive processing by the two major peripheral nerve fiber populations involved in pain signaling.
Heat pain is evoked with aid of the TSA II, a commercially available thermo-sensory analyzer (Medoc Advanced Medical Systems, Durham, NC). Stimulus configuration and delivery is handled with aid of specific software. Thermodes vary in size and shape but in principle consist of a metal plate that can be heated or cooled at various rates and for different periods of time. Algorithms assessing heat-evoked pain are manifold. In the experiments shown here, study participants are asked to indicate at what point they start experiencing pain while the thermode in contact with skin is heated at a predetermined rate starting at a temperature that does not evoke pain. The thermode temperature at which a subject starts experiencing pain constitutes the heat pain threshold.
Mechanical pain is evoked with punctuated probes. Such probes are commercially available from several manufacturers (von Frey hairs). However, the accuracy of von Frey hairs has been criticized and many investigators use custom made punctuated pressure probes. In the experiments shown here eight custom-made punctuated probes of different weights are applied in consecutive order, a procedure called up-down algorithm, to identify perceptional deflection points, i.e., a change from feeling no pain to feeling pain or vice versa. The average weight causing a perceptional deflection constitutes the mechanical pain threshold.

Algorithms assessing heat and mechanical pain thresholds in experimentally inflamed skin of human study subjects are shown. The two pain testing paradigms independently examine nociceptive processing by the two major peripheral nerve fiber populations transmitting pain, i.e., non-myelinated C fibers and small myelinated A-delta fibers.

熱とヒトの炎症を起こしている皮膚における機械的痛覚閾値の決定

In a previous article in the Journal of Visualized Experiments we have demonstrated skin microdialysis techniques for the collection of tissue-specific ...

生物学

Digital Microfluidics for Automated Proteomic Processing

Clinical proteomics has emerged as an important new discipline, promising the discovery of biomarkers that will be useful for early diagnosis and prognosis of disease. While clinical proteomic methods vary widely, a common characteristic is the need for (i) extraction of proteins from extremely heterogeneous fluids (i.e. serum, whole blood, etc.) and (ii) extensive biochemical processing prior to analysis. Here, we report a new digital microfluidics (DMF) based method integrating several processing steps used in clinical proteomics. This includes protein extraction, resolubilization, reduction, alkylation and enzymatic digestion. Digital microfluidics is a microscale fluid-handling technique in which nanoliter-microliter sized droplets are manipulated on an open surface. Droplets are positioned on top of an array of electrodes that are coated by a dielectric layer - when an electrical potential is applied to the droplet, charges accumulate on either side of the dielectric. The charges serve as electrostatic handles that can be used to control droplet position, and by biasing a sequence of electrodes in series, droplets can be made to dispense, move, merge, mix, and split on the surface. Therefore, DMF is a natural fit for carrying rapid, sequential, multistep, miniaturized automated biochemical assays. This represents a significant advance over conventional methods (relying on manual pipetting or robots), and has the potential to be a useful new tool in clinical proteomics.
Mais J. Jebrail, Vivienne N. Luk, and Steve C. C. Shih contributed equally to this work.
Sergio L. S. Freire's current address is at the University of the Sciences in Philadelphia located at 600 South 43rd Street, Philadelphia, PA 19104.

Digital Microfluidics is a technique characterized by the manipulation of discrete droplets (~nL - mL) on an array of electrodes by the application of electrical fields. It is well-suited for carrying out rapid, sequential, miniaturized automated biochemical assays. Here, we report a platform capable of automating several proteomic processing steps.

自動プロテオーム処理のためのデジタルマイクロ流体

Clinical proteomics has emerged as an important new discipline, promising the discovery of biomarkers that will be useful for early diagnosis and ...

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and cellular content. Hallmark events of mitosis, such as chromosome movement, can be readily tracked on an individual cell basis using time-lapse fluorescence microscopy of mammalian cell lines expressing specific GFP-tagged proteins. In combination with RNAi-based depletion, this can be a powerful method for pinpointing the stage(s) of mitosis where defects occur after levels of a particular protein have been lowered. In this protocol, we present a basic method for assessing the effect of depleting a potential mitotic regulatory protein on the timing of mitosis. Cells are transfected with siRNA, placed in a stage-top incubation chamber, and imaged using an automated fluorescence microscope. We describe how to use software to set up a time-lapse experiment, how to process the image sequences to make either still-image montages or movies, and how to quantify and analyze the timing of mitotic stages using a cell-line expressing mCherry-tagged histone H2B. Finally, we discuss important considerations for designing a time-lapse experiment. This strategy is complementary to other approaches and offers the advantages of 1) sensitivity to changes in kinetics that might not be observed when looking at cells as a population and 2) analysis of mitosis without the need to synchronize the cell cycle using drug treatments. The visual information from such imaging experiments not only allows the sub-stages of mitosis to be assessed, but can also provide unexpected insight that would not be apparent from cell cycle analysis by FACS.

Here we describe a basic protocol to image and quantify the mitotic timing of live mammalian tissue culture cells after siRNA transfection.

siRNAトランスフェクション後の有糸分裂のタイムラプスイメージング

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and temporal resolution to study in vivo hematopoiesis using the murine bone marrow transplant experimental model. Genetic combinatorial marking using lentiviral vectors encoding fluorescent proteins (FPs) enabled cell fate mapping through advanced microscopy imaging. Vectors encoding five different FPs: Cerulean, EGFP, Venus, tdTomato, and mCherry were used to concurrently transduce HSPCs, creating a diverse palette of color marked cells. Imaging using confocal/two-photon hybrid microscopy enables simultaneous high resolution assessment of uniquely marked cells and their progeny in conjunction with structural components of the tissues. Volumetric analyses over large areas reveal that spectrally coded HSPC-derived cells can be detected non-invasively in various intact tissues, including the bone marrow (BM), for extensive periods of time following transplantation. Live studies combining video-rate multiphoton and confocal time-lapse imaging in 4D demonstrate the possibility of dynamic cellular and clonal tracking in a quantitative manner.

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

Combinatorial 5 fluorescent proteins marking of hematopoietic stem and progenitor cells allows in vivo clonal tracking via confocal and two-photon microscopy, providing insights into bone marrow hematopoietic architecture during regeneration. This method allows non-invasive fate mapping of spectrally-coded HSPCs-derived cells in intact tissues for extensive periods of time following transplantation.

共焦点および多光子顕微鏡を用いて5蛍光タンパク質によってマーク造血幹細胞および前駆細胞の生体内でクローン追跡で

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

成体マウス頭蓋冠骨髄中の造血幹細胞および前駆細胞のin vivo 4次元トラッキングで

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Simple Bulk Readout of Digital Nucleic Acid Quantification Assays

Digital assays are powerful methods that enable detection of rare cells and counting of individual nucleic acid molecules. However, digital assays are still not routinely applied, due to the cost and specific equipment associated with commercially available methods. Here we present a simplified method for readout of digital droplet assays using a conventional real-time PCR instrument to measure bulk fluorescence of droplet-based digital assays.
We characterize the performance of the bulk readout assay using synthetic droplet mixtures and a droplet digital multiple displacement amplification (MDA) assay. Quantitative MDA particularly benefits from a digital reaction format, but our new method&#160;applies to any digital assay. For established digital assay protocols such as digital PCR, this method serves to speed up and simplify assay readout.
Our bulk readout methodology brings the advantages of partitioned assays without the need for specialized readout instrumentation. The principal limitations of the bulk readout methodology are reduced dynamic range compared with droplet-counting platforms and the need for a standard sample, although the requirements for this standard are less demanding than for a conventional real-time experiment. Quantitative whole genome amplification (WGA) is used to test for contaminants in WGA reactions and is the most sensitive way to detect the presence of DNA fragments with unknown sequences, giving the method great promise in diverse application areas including pharmaceutical quality control and astrobiology.

We describe an endpoint digital assay for quantifying nucleic acids with a simplified (analog) readout. We measure bulk fluorescence of droplet-based digital assays using a standard qPCR machine rather than specialized instrumentation and confirm our results by microscopy.

デジタル核酸定量アッセイの簡単な一括読み出し

Digital assays are powerful methods that enable detection of rare cells and counting of individual nucleic acid molecules. However, digital assays are ...

Magnetic-Activated Cell Sorting Strategies to Isolate and Purify Synovial Fluid-Derived Mesenchymal Stem Cells from a Rabbit Model

Mesenchymal stem cells (MSCs) are the main cell source for cell-based therapy. MSCs from articular cavity synovial fluid could potentially be used for cartilage tissue engineering. MSCs from synovial fluid (SF-MSCs) have been considered promising candidates for articular regeneration, and their potential therapeutic benefit has made them an important research topic of late. SF-MSCs from the knee cavity of the New Zealand white rabbit can be employed as an optimized translational model to assess human regenerative medicine. By means of CD90-based magnetic activated cell sorting (MACS) technologies, this protocol successfully obtains rabbit SF-MSCs (rbSF-MSCs) from this rabbit model and further fully demonstrates the MSC phenotype of these cells by inducing them to differentiate to osteoblasts, adipocytes, and chondrocytes. Therefore, this approach can be applied in cell biology research and tissue engineering using simple equipment and procedures.

This article presents a simple and economic protocol for the straightforward isolation and purification of mesenchymal stem cells from New Zealand white rabbit synovial fluid.

磁気活性化細胞を分離し、滑膜液由来間葉系幹細胞が家兎モデルからの浄化戦略を並べ替え

Mesenchymal stem cells (MSCs) are the main cell source for cell-based therapy. MSCs from articular cavity synovial fluid could potentially be used for ...

Micron-scale Phenotyping Techniques of Maize Vascular Bundles Based on X-ray Microcomputed Tomography

It is necessary to accurately quantify the anatomical structures of maize materials based on high-throughput image analysis techniques. Here, we provide a 'sample preparation protocol' for maize materials (i.e., stem, leaf, and root) suitable for ordinary microcomputed tomography (micro-CT) scanning. Based on high-resolution CT images of maize stem, leaf, and root, we describe two protocols for the phenotypic analysis of vascular bundles: (1) based on the CT image of maize stem and leaf, we developed a specific image analysis pipeline to automatically extract 31 and 33 phenotypic traits of vascular bundles; (2) based on the CT image series of maize root, we set up an image processing scheme for the three-dimensional (3-D) segmentation of metaxylem vessels, and extracted two-dimensional (2-D) and 3-D phenotypic traits, such as volume, surface area of metaxylem vessels, etc. Compared with traditional manual measurement of vascular bundles of maize materials, the proposed protocols significantly improve the efficiency and accuracy of micron-scale phenotypic quantification.

We provide a novel method to improve the X-ray absorption contrast of maize tissue suitable for ordinary microcomputed tomography scanning. Based on CT images, we introduce a set of image-processing workflows for different maize materials to effectively extract microscopic phenotypes of vascular bundles of maize.

X 線マイクロ断層レントゲン写真撮影に基づいてトウモロコシの維管束のミクロン スケール表現型解析技術

It is necessary to accurately quantify the anatomical structures of maize materials based on high-throughput image analysis techniques. Here, we provide a ...

Biological Sample Preparation by High-pressure Freezing, Microwave-assisted Contrast Enhancement, and Minimal Resin Embedding for Volume Imaging

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the imaging modality in a focused ion beam scanning electron microscope (FIB-SEM), which is used to obtain stacks of sequential images for 3D reconstruction and modelling. High-pressure freezing (HPF) allows close to native structural preservation, but the subsequent freeze substitution often does not provide sufficient contrast, especially for a bigger specimen, which is needed for high-quality imaging in the SEM required for 3D reconstruction. Therefore, in this protocol, after the freeze substitution, additional contrasting steps are carried out at room temperature. Although these steps are performed in a microwave, it is also possible to follow traditional bench processing, which requires longer incubation times.The subsequent embedding in minimal amounts of resin allows for faster and more precise targeting and preparation inside the FIB-SEM. This protocol is especially useful for samples that require preparation by high-pressure freezing for a reliable ultrastructural preservation but do not gain enough contrast during the freeze substitution for volume imaging using FIB-SEM. In combination with the minimal resin embedding, this protocol provides an efficient workflow for the acquisition of high-quality volume data.

Here we present a protocol for combining two sample processing techniques, high-pressure freezing and microwave-assisted sample processing, followed by minimal resin embedding for acquiring data with a focused ion beam scanning electron microscope (FIB-SEM). This is demonstrated using a mouse tibial nerve sample and Caenorhabditis elegans.

高圧急速凍結、マイクロ波を用いたコントラスト強調、およびボリューム イメージングのために埋め込む最小限の樹脂による生体試料作製

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the ...

Cryo-Electron Microscopic Grid Preparation for Time-Resolved Studies using a Novel Robotic System, Spotiton

The capture of short-lived molecular states triggered by the early encounter of two or more interacting particles continues to be an experimental challenge of great interest to the field of cryo-electron microscopy (cryo-EM). A few methodological strategies have been developed that support these &#34;time-resolved&#34; studies, one of which, Spotiton-a novel robotic system-combines the dispensing of picoliter-sized sample droplets with precise temporal and spatial control. The time-resolved Spotiton workflow offers a uniquely efficient approach to interrogate early structural rearrangements from minimal sample volume. Fired from independently controlled piezoelectric dispensers, two samples land and rapidly mix on a nanowire EM grid as it plunges toward the cryogen. Potentially hundreds of grids can be prepared in rapid succession from only a few microliters of a sample. Here, a detailed step-by-step protocol of the operation of the Spotiton system is presented with a focus on troubleshooting specific problems that arise during grid preparation.

The protocol presented here describes the use of Spotiton, a novel robotic system, to deliver two samples of interest onto a self-wicking, nanowire grid that mix for a minimum of 90 ms prior to vitrification in liquid cryogen.