המחברים מודים ללינדה טרנר לקבלת סיוע בהכנת המיקרוביולוגית. RZ וLGW מומנו על ידי מכון רולנד בהרווארד וCGB מומן כחוקר של קרן שכמיות, המדע ללא גבולות תכנית, ברזיל (# 7340-11-7 תהליך)

1. התקנה ורכישת נתונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדול תרבות של סטרפטוקוקוס מתח V4051-197 תאים (שחיה חלקה) במדיום KTY ממניות קפוא 22. דגירה שבייקרה סיבובי לילה בשעה 35 מעלות צלזיוס ו150 סל&quot;ד, לרוויה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסן 10 מיליליטר של מדיום KTY הטרי עם 500 μl של התרבות הרווי. דגירה במשך שעה 3.5 נוספת ב35 מעלות צלזיוס ו150 סל&quot;ד עד שהתאים מגיעים לצפיפות אופטית של כ 1.0 בλ = 600 ננומטר (מיליליטר / כ 5 x 10 8 תאים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל 1:400 בתקשורת טרי כדי להשיג הריכוז הסופי של תאי ניעתי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשקופית מיקרוסקופ, להפוך את טבעת של שומן (לדוגמא ממזרק מלא בוזלין) בסביבות 1 מ&quot;מ גובה ובמקום ירידה של הפתרון לדוגמא במרכז. מניחים מכסה זכוכית באורח קל בראש ולחץ בקצוות כדי לאטום, הבטחת הנוזל שנמצאה בקשר עם שני שקופיות וכיסוי זכוכית. מדגם החדר וכתוצאה מכך צריך להיות around 100-200 מיקרומטר לעומק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את החדר לדוגמא במיקרוסקופ עם מכסה הזכוכית פונה כלפי מטה, ובזהירות, כדי למנוע היווצרות של בועות אוויר בשמן בין הזכוכית ועדשות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פוקוס מיקרוסקופ על פני השטח התחתון של חדר המדגם, ולהביא את הקבל להתמקד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כבה את התאורה סטנדרטית ולמקם את ראש LED מאחורי צמצם הקבל של המיקרוסקופ. הגדר את אספקת חשמל LED לתפוקה מקסימלית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סגור את צמצם הקבל מידה במלואם, ואם יש צורך, דחיפה LED בהר ועד התאורה מתמקדת בצמצם העדשה האובייקטיבי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את המחשב והמצלמה, ולהפנות את כל האור ליציאת המצלמה של המיקרוסקופ. התאם את קצב מסגרת ואת גודל התמונה בתוכנת רכישת תמונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך את זמן חשיפת מסגרת קצר ככל האפשר, תוך שמירה על ניגודיות טובה. בדוק היסטוגרמה עוצמת תמונה, כדי להבטיח שהתמונה היא לא saturaטד או חשוף תחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במידת צורך, ולמקד את המיקרוסקופ כך שמושא העניין הוא מעט מזוגג (בדרך כלל על ידי 10-30 מיקרומטר). האובייקט ומישור המוקד צריך להיות באותו המדיום (כלומר מישור המוקד צריך לשכב בתוך החדר לדוגמא). </li></ol> 2. שחזור הצעד הראשון של עיבוד נתונים הוא למקד מחדש מבחינה מספרית מסגרת וידאו בסדרה של עומקים שונים, לייצר ערימה של תמונות. תוכנה ידידותית למשתמש עושה את זה ניתן למצוא כאן: <a href="http://www.rowland.harvard.edu/rjf/wilson/Downloads.html">http://www.rowland.harvard.edu/rjf/wilson/Downloads.html</a> יחד עם תמונות דוגמא (שנרכשו באמצעות מיקרוסקופ הפוכה, ועדשה אובייקטיבית 60x טבילת שמן) וזירת קובץ לקרן לייחס טיוח. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קלט למסגרת של עניין והרקע שלה בהתאמה כקבצי תמונה נפרדות, בתיבות הרלוונטיות בממשק. תמונת רקע היא מסגרת שfairly מייצג את הרקע של הווידאו, בהיעדר הולוגרמה, וישמש לדיכוי כל רעש קבוע דפוס שיכול להפריע ללוקליזציה הולוגרמה וניתוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזן ערכים בתיבות ההגדרות הגלובליות בצד שמאל של המסך לפני הפעלת התכנית. השלושה הראשונים פרמטרים מחסנית פלט הם: מיקום ציר הסיבוב של המסגרת הראשונה (&#39;התחל מוקד&#39;), מספר פרוסות בערימה המשוחזרת (&quot;מספר הצעדים&quot;); מרחק צירי בין כל פרוסה במחסנית (&quot;גודל צעד&quot;) . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לשחזר את האובייקטים עם הפרופורציות הנכונות, גודל הצעד צריך להיות באותו הגודל כמו את מרווח פיקסל לרוחב. הזן את התדר של המצלמה לרוחב דגימה (מרווח 1/pixel) בתיבת &#39;Pixel / מיקרון&#39;, אורך גל התאורה ומקדם שבירה בינונית בשתי התיבות האחרונות. ערכי ברירת המחדל של התכנית מתאימים לשחזור נתונים ירושלים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על הכפתור &#39;Z-שיפוע פליפ &quot;אם מרכז objeCT הוא כהה בהולוגרמה (ראה דוגמא מסגרת 2005 וסעיף הדיון לפרטים נוספים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדקו את מסנן bandpass / כיבוי מדינה (ברירת מחדל הוא על). מסנן זה אופציונלי bandpass, הממוקם בתיבה שמתחת למתג שיפוע-Flip, הוא אחראי לדיכוי התרומה מפיקסלים רועשים. מסנן bandpass מוחל על כל פרוסה תמונה באופן מיידי אחרי הדור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את מתג תוצרת ביניים במדינות / כיבוי (ברירת מחדל היא על). צעדי ניתוח ביניים שנכתבו בשני קטעי וידאו פלט, כדחוס קבצי avi:. הראשון הוא הערימה מקדה מחדש (שם קובץ מסתיים ב &#39;_stack.avi&#39;), השני היא הערימה לאחר ניתוח השיפוע הצירי (שם קובץ מסתיים ב &#39; _gradient.avi &#39;). באופן אידיאלי, ערימה שנייה תכיל את מושא העניין מודגש כאובייקט בהיר על רקע כהה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הגדרת כל הפרמטרים, לחץ על &#39;הפעל&#39; בחלון הראשי. המסגרת שנבחרה תופיע בתיבה הראשית של התוכנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמשכלי זכוכית מגדלת שנמצא בסרגל הכלים בצד השמאל של התמונה כדי להגדיל ב( קליק שמאלי) ולהקטין את התצוגה (shift + קליק שמאלי). השתמש בכלי המלבן בסרגל הכלים כדי לבחור אזור של העניין (ROI). ללכוד כמה שיותר מהשולים של הולוגרמה ככל האפשר בתוך המלבן, כמו זה יהיה לייעל את השיקום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על הכפתור &#39;התהליך&#39; כדי ליצור שתי ערימות תמונה. בדוק את הערימות וכתוצאה מכך באמצעות ImageJ (שניתן להשיג בחינם <a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/">בhttp://rsb.info.nih.gov/ij/).</a> אם האובייקט של עניין ניתן לראות בתמונת מחסנית הצבע באופן ברור, המשך לשלב הבא כדי לחלץ את קואורדינטות האובייקט. </li></ol> 3. טיוח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חוץ ממיקוד מחודש מסגרת, תכנית זו יכולה לאתר את x, y, z קואורדינטות עבור כל voxel באובייקט של עניין. לחץ על הכפתור &#39;הפקת תכונה&#39; כדי לאפשר פונקציה זו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזן את נתיב, כולל סיומת (לדוגמא: c: output.inc הבית), עבורפלט קובץ קואורדינטות. בחר &#39;סגנון POV-Ray&#39; בתיבה &#39;פלט לתאם סגנון&#39;. זה גורם לתכנית לכתוב קובץ אובייקט שניתן דמיינו באמצעות החבילה חינם POV-Ray תוכנת raytracing (אשר ניתן להשיג <a href="http://www.povray.org/">מhttp://www.povray.org/).</a> </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעבד מחדש את התמונות כאמורות בסעיף 2 לעיל. התכנית תספק סדרה של (x, y, z) קואורדינטות בהחזר על ההשקעה שנבחרה, שנכתבה לשם הקובץ ב&#39;הפלט לתאם &#39;התיבה. חילוץ של קואורדינטות אובייקט לוקח משמעותי יותר מאשר דור ערימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא כי מדגם קובץ POV-Ray (מסופק עם קוד השיקום) הוא באותה התיקייה כקואורדינטות להגיש רק נוצרו. ערוך את קובץ POV מדגם. ולהחליף את שם הקובץ במרכאות כפולות על הקו # Include &quot;MYFILE.inc&quot; עם השם של קובץ נתונים שנוצר על ידי קוד השחזור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על לחצן &#39;הפעלת&#39; בPOV-Ray כדי להבהיר תמונת מפת סיביות. Tהוא מיקום המצלמה, תאורה ואפשרויות מרקם הם רק כמה מההתאמות אפשריות בPOV-Ray, ראה את התיעוד באינטרנט לקבלת פרטים. </li></ol>

<ol>
	<li>Xu, W., Jericho, M. H., Meinertzhagen, I. A., Kreuzer, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+in-line+holography+for+biological+applications.">Digital in-line holography for biological applications.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98 (20), 11301-11305 (2001).</li><li>Sheng, J., Malkiel, E., Katz, J., Adolf, J., Belas, R., Place, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+holographic+microscopy+reveals+prey-induced+changes+in+swimming+behavior+of+predatory+dinoflagellates.">Digital holographic microscopy reveals prey-induced changes in swimming behavior of predatory dinoflagellates.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 17512-17517 (2007).</li><li>Lee, S. H., Roichman, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+and+tracking+single+colloidal+particles+with+video+holographic+microscopy.">Characterizing and tracking single colloidal particles with video holographic microscopy.</a> Opt. Express. 15 (26), 18275-18282 (2007).</li><li>Fung, J., Martin, K. E., Perry, R. W., Katz, D. M., McGorty, R., Manoharan, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+translational,+rotational,+and+vibrational+dynamics+in+colloids+with+digital+holographic+microscopy.">Measuring translational, rotational, and vibrational dynamics in colloids with digital holographic microscopy.</a> Opt. Express. 19 (9), 8051-8065 (2011).</li><li>Lee, S. H., Grier, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Holographic+microscopy+of+holographically+trapped+three-dimensional+structures.">Holographic microscopy of holographically trapped three-dimensional structures.</a> Opt. Express. 15 (4), 1505-1512 (2007).</li><li>Kim, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+and+techniques+of+digital+holographic+microscopy.">Principles and techniques of digital holographic microscopy.</a> SPIE Rev. 1, 018005 (2010).</li><li>Corkidi, G., Taboada, B., Wood, C. D., Guerrero, A., Darszon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+sperm+in+three-dimensions.">Tracking sperm in three-dimensions.</a> Biochem. Biophys. Res. Comm. 373, 125-129 (2008).</li><li>Santi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+Sheet+Fluorescence+Microscopy+:+A+Review.">Light Sheet Fluorescence Microscopy : A Review.</a> J. Histochem. Cytochem. 59, 129-138 (2011).</li><li>van Blaaderen, A., Wiltzius, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Real-Space Structure of Colloidal Hard-Sphere Glasses. Science. 270, 1177-1179 (1990).</li><li>Besseling, R., Weeks, E. R., Schofield, A. B., Poon, W. C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-Dimensional+Imaging+of+Colloidal+Glasses+under+Steady+Shear.">Three-Dimensional Imaging of Colloidal Glasses under Steady Shear.</a> Phys. Rev. Lett. 99, 028301 (2007).</li><li>Schall, P., Weitz, D., Spaepen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+Rearrangements+That+Govern+Flow+in+Colloidal+Glasses.">Structural Rearrangements That Govern Flow in Colloidal Glasses.</a> Science. 318, 1895-1899 (2007).</li><li>Rosen, J., Brooker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+incoherent+color+holography.">Fluorescence incoherent color holography.</a> Opt. Exp. 15, 2244-2250 (2007).</li><li>Jericho, M. H., Kreuzer, H. J., Kanka, M., Riesenberg, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+phase+and+refractive+index+measurements+with+point-source+digital+in-line+holographic+microscopy.">Quantitative phase and refractive index measurements with point-source digital in-line holographic microscopy.</a> Appl. Opt. 51 (10), 1503-1515 (2012).</li><li>Mudanyali, O., Erlinger, A., Seo, S., Su, T., Ozcan, D. T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lensless+On-chip+Imaging+of+Cells+Provides+a+New+Tool+for+High-throughput+Cell-Biology+and+Medical.">Lensless On-chip Imaging of Cells Provides a New Tool for High-throughput Cell-Biology and Medical.</a> J. Vis. Exp. 34, (2009).</li><li>Langehanenberg, P., Kemper, B., Dirksen, D., von Bally, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autofocusing+in+digital+holographic+phase+contrast+microscopy+on+pure+phase+objects+for+live+cell+imaging.">Autofocusing in digital holographic phase contrast microscopy on pure phase objects for live cell imaging.</a> Appl. Opt. 47 (19), (2008).</li><li>Elliot, M. S., Poon, W. C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conventional+optical+microscopy+of+colloidal+suspensions.">Conventional optical microscopy of colloidal suspensions.</a> Adv. Coll. Interf. Sci. 92, 133-194 (2001).</li><li>Agero, U., Monken, C. H., Ropert, C., Gazzinelli, R. T., Mesquita, O. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+surface+fluctuations+studied+with+defocusing+microscopy.">Cell surface fluctuations studied with defocusing microscopy.</a> Phys. Rev. E. 67, 051904 (2003).</li><li>Born, M., Wolf, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Principles of Optics, 6th Ed. , (1998).</li><li>Wilson, L., Zhang, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+Localization+of+weak+scatterers+in+digital+holographic+microscopy+using+Rayleigh-Sommerfeld+back-propagation.">3D Localization of weak scatterers in digital holographic microscopy using Rayleigh-Sommerfeld back-propagation.</a> Opt. Express. 20, 16735-16744 (2012).</li><li>Bohren, C., Huffman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Absorption and Scattering of Light by Small Particles. , (1983).</li><li>Balaev, A. E., Dvoretski, K. N., Doubrovski, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Refractive+index+of+escherichia+coli+cells.">Refractive index of escherichia coli cells.</a> Saratov Fall Meeting 2001: Optical Technologies in Biophysics and Medicine III. 4707 (1), 253-260 (2002).</li><li>Berg, H. C., Manson, M. D., Conley, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+and+Energetics+of+Flagellar+Rotation+in+Bacteria.">Dynamics and Energetics of Flagellar Rotation in Bacteria.</a> Symp. Soc. Exp. Biol. 35, 1-31 (1982).</li><li>Garcia-Sucerquia, J., Xu, W., Jericho, S. K., Klages, P., Jericho, M. H., Kreuzer, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+in-line+holographic+microscopy.">Digital in-line holographic microscopy.</a> Appl. Optics. 45 (5), 836-850 (2006).</li><li>Restrepo, J. F., Garcia-Sucerquia, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnified+reconstruction+of+digitally+recorded+holograms+by+Fresnel-Bluestein+transform.">Magnified reconstruction of digitally recorded holograms by Fresnel-Bluestein transform.</a> Appl. Optics. 49 (33), 6430-6435 (2010).</li><li>Dubois, F., Joannes, L., Legros, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+three-dimensional+imaging+with+a+digital+holography+microscope+with+a+source+of+partial+spatial+coherence.">Improved three-dimensional imaging with a digital holography microscope with a source of partial spatial coherence.</a> Appl. Optics. 38 (34), 7085-7094 (1999).</li><li>Kanka, M., Riesenberg, R., Petruck, P., Graulig, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+resolution+(NA=0.8)+in+lensless+in-line+holographic+microscopy+with+glass+sample+carriers.">High resolution (NA=0.8) in lensless in-line holographic microscopy with glass sample carriers.</a> Opt. Lett. 36 (18), 3651-3653 (2011).</li><li>Dubois, F., Requena, M. L., Minetti, C., Monnom, O., Istasse, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partial+spatial+coherence+effects+in+digital+holographic+microscopy+with+a+laser+source.">Partial spatial coherence effects in digital holographic microscopy with a laser source.</a> Appl. Optics. 43 (5), 1131-1139 (2004).</li><li>Magariyama, Y., Sugiyama, S., Muramoto, K., Kawagishi, I., Imae, Y., Kudo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+measurement+of+bacterial+flagellar+rotation+rate+and+swimming+speed.">Simultaneous measurement of bacterial flagellar rotation rate and swimming speed.</a> Biophysical Journal. 69 (5), 2154-2162 (1995).</li><li>Berg, H. C., Brown, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotaxis+in+Escherichia+coli+analysed+by+three-dimensional+tracking.">Chemotaxis in Escherichia coli analysed by three-dimensional tracking.</a> Nature. 239 (5374), 500-504 (1972).</li><li>Brooker, G., Siegel, N., Wang, V., Rosen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimal+resolution+in+Fresnel+incoherent+correlation+holographic+fluorescence+microscopy.">Optimal resolution in Fresnel incoherent correlation holographic fluorescence microscopy.</a> Opt. Express. 19 (6), 5047-5062 (2011).</li></ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

הצעד החשוב ביותר בפרוטוקול ניסוי זה הוא הלכידה מדויקת של תמונות מהתקנה ניסיונית יציבה. עם נתוני רקע עניים, שיקום באיכות גבוהה הוא כמעט בלתי אפשרי. כמו כן, חשוב להימנע מעדשות אובייקטיביות עם אלמנט פנימי שלב ניגוד (נראה כמו annulus כהה כאשר מסתכל דרך החלק האחורי של אובייקט?...

מיקרוסקופ הולוגרפי מוטבע דיגיטלי (DIHM) מאפשר הדמיה תלת ממדית מהירה של דגימות מיקרוסקופיות, כגון מיקרואורגניזמים שחייה 1,2 ומערכות חומר רכים 3,4, עם שינויים מינימאליים להתקנת מיקרוסקופ רגילה. במאמר זה הפגנה פדגוגית של DIHM מסופקת, סביב תוכנה שפותחה במעבדה שלנו. נייר זה כולל תיאור של איך להגדיר את המיקרוסקופ, לייעל את האיסוף וניתוח נתונים, ולעבד את התמונות שתועדו לשחזר נתונים תלת ממדיים. התוכנה (המבוססת בחלקו על תוכנה שפותח על ידי DG גריר ואחרים 5) ותמונות דוגמא זמינה באופן חופשי באתר האינטרנט שלנו. תיאור מסופק על הצעדים הדרושים כדי להגדיר את המיקרוסקופ, לשחזר נפחים תלת ממדים מהולוגרמות ולעבד כמויות של עניין וכתוצאה מכך באמצעות קרן חופשית התחקות חבילת תוכנה. העיתון מסכם בדיון על גורמים המשפיעים על איכות השיקום, והשוואה של DIHM עם שיטות מתחרות. למרות DIHM תואר לפני כמה זמן (לסקירה כללית של העקרונות והפיתוח שלה, לראות את קים 6), כוח המחשוב הנדרש ומומחיות עיבוד תמונה עד כה במידה רבה להגביל את השימוש בה לקבוצות מחקר מומחה עם דגש על פיתוח מכשיר. מצב זה משתנה לאור ההתקדמות שחלה באחרונה בטכנולוגית המצלמה מחשוב ו. מחשבים אישיים מודרניים יכולים בקלות להתמודד עם העיבוד ודרישות אחסון נתונים; מצלמות CCD או CMOS נמצאות ברוב המעבדות מיקרוסקופית, והתוכנה הנדרשת הוא עשויה להיות זמינה באופן חופשי באינטרנט על ידי קבוצות שהשקיעו זמן בפיתוח הטכניקה. תוכניות שונות הוצעו להדמית התצורה של עצמים מיקרוסקופיים בשלושה ממדי נפח דגימה. רבים מאלה סורקים טכניקות 7,8, שבו ערימה של תמונות שתועדה על ידי מ &#39;echanically תרגום מטוס התמונה באמצעות המדגם. מיקרוסקופ פלואורסצנטי confocal הסריקה הוא אולי הדוגמא המוכרת ביותר. בדרך כלל, צבע פלואורסצנטי מתווסף לאובייקט שלב על מנת להשיג רמה סבירה של ניגוד מדגם, והסדר confocal משמש למקם פליטת ניאון מרחבית. שיטה זו הובילה להתקדמות משמעותית, למשל במדע קולואיד שבו אפשרה גישה לדינמיקה תלת ממדית של מערכות צפופות 9-11. השימוש בתיוג הוא הבדל חשוב בין מיקרוסקופיה confocal פלואורסצנטי וDIHM, אבל תכונות אחרות של שתי הטכניקות הן כדאי להשוות. יש DIHM יתרון מהירות משמעותי בכך שיש לו את המכשיר ללא חלקים נעים. מראות הסריקה מכאניות במערכות confocal להציב גבול עליון לשיעור רכישת נתונים - בדרך כלל סביב 30 מסגרות / שניות לתמונת פיקסל 512 x 512. ניתן לקבל ערימה של תמונות כאלה ממטוסי מוקד שונים על ידי פיזי Translating שלב המדגם או עדשה אובייקטיבית בין מסגרות, מה שמוביל לשיעור לכידה סופי של כ כרך אחד לשנייה עבור מחסנית מסגרת 30. לשם השוואה, מערכת הולוגרפית המבוססת על מצלמת CMOS מודרנית יכולה ללכוד 2,000 מסגרות / שנייה באותו גודל התמונה ורזולוציה; כל תמונת מעובדת `מחובר &#39;לתת תמונת מצב בלתי תלויה בנפח הדגימה. כדי לחזור ולהדגיש: דגימות ניאון אינן נדרשות לDIHM, אם כי מערכת פותחה שמבצעת שחזור הולוגרפי של נושא ניאון 12. כמו גם מידע נפח תלת ממדים, DIHM יכול לשמש גם כדי לספק תמונות לעומת שלב הכמותי 13, אבל זה מעבר להיקף של הדיון כאן. תמונות הנתונים הגולמיים DIHM הן דו ממדיות, ובמובנים מסוימים נראות כמו תמונות מיקרוסקופ רגילות, אם כי מחוץ לפוקוס. ההבדל העיקרי בין DIHM ומיקרוסקופ שדה בהיר סטנדרטי טמון בטבעות העקיפה המקיפות את אובייקטי in את שדה הראיה, אלו הן בשל האופי של התאורה. DIHM דורש מקור קוהרנטית יותר מ שדה בהיר - בדרך כלל LED או לייזר. הטבעות העקיפה בהולוגרמה מכילות את המידע הדרוש כדי לשחזר תמונה תלת ממדית. ישנן שתי גישות עיקריות לפרשנות נתוני DIHM; מיקוד מחודש ראוי ומספרי ישיר. הגישה הראשונה היא ישימה במקרים בהם הצורה המתמטית של התבנית העקיפה ידועה מראש 3,4; תנאי זה מתקיים על ידי קומץ קטן של אובייקטים פשוטים כמו כדורים, גלילים, ומכשולים חצי מטוס. התאמה ישירה היא גם ישימה במקרים בהם המצב הצירי של האובייקט ידוע, והתמונה יכולה להיות מצוידת באמצעות טבלה להסתכל למעלה של תבניות תמונה 14. הגישה השנייה (מיקוד המחודש מספרי) היא די כללית יותר ומסתמכת על שימוש בטבעות העקיפה בדמות הולוגרמה דו ממדים לשחזר את השדה האופטי מבחינה מספרית במספר המטוסים (במרווחים באופן שרירותי) המוקדים ברחבי נפח הדגימה. מספר שיטות הקשורים קיימות עבור עושה 6 זה; עבודה זו משתמשת ריילי-זומרפלד חזרה טכניקת התפשטות כפי שתאר לי וגריר 5. התוצאה של הליך זה היא ערימה של תמונות המחקות את ההשפעה של שינוי מטוס מיקרוסקופ המוקד (ומכאן השם `מיקוד המחודש מספרי&quot;) באופן ידני. ברגע שערימה של תמונות כבר נוצרה, יש לקבל את עמדתו של הנושא בהיקף המוקד. מספר היוריסטיות ניתוח תמונה, כמו שונות עוצמת מקומית או תוכן תדר המרחבי, הוצג לכמת את חדות מיקוד בנקודות שונות במדגם 15. בכל מקרה, כאשר מדד תמונה מסוים מוגדל (או למזער), האובייקט נחשב בפוקוס. בניגוד לתוכניות אחרות שמבקשות לזהות מטוס מוקד מסוים שבו אובייקט הוא &quot;בפוקוס&quot;, השיטה בעבודה זו מרימה את points ששוכב בתוך האובייקט של עניין, אשר עשוי להאריך על פני מגוון רחב של מטוסי מוקד. גישה זו חלה על מגוון רחב של נושאים, והוא מתאים במיוחד להארכה, דגימות בחולשה-פיזור (אובייקטי שלב), כגון קולואידים בצורת מוט, שרשרות של חיידקים או שוטונים אוקריוטים. בדגימות כגון ניגוד התמונה משתנה כאשר האובייקט עובר דרך מישור המוקד; יש תמונה לא ממוקדת מרכז אור אם האובייקט הוא בצד אחד של מטוס המוקד ומרכז כהה, אם זה בצד השני. יש לא מעט ניגוד אובייקטי שלב טהורים כאשר הם שוכבים בדיוק במישור המוקד. תופעה זו של היפוך לעומת זאת נדונה על ידי מחברים אחרים 16,17 וסופו של דבר בשל שלב Gouy האנומליה 18. זה כבר הכניס על בסיס קפדני יותר בהקשר של הולוגרפיה במקום אחר, שבו הגבולות של הטכניקה מוערכים; חוסר הוודאות האופיינית בעמדה היא בסדר גודל של 150 ננומטר (כפיקסל) בEACכיוון שעות 19. שיטת האנומליה שלב Gouy היא אחת תוכניות DIHM המוגדרות היטב כמה לקביעת המבנה של אובייקטים מורחבים בשלושה ממדים, אבל בכל זאת כמה אובייקטים הם בעייתיים לשחזר. אובייקטים הנמצאים באופן ישיר לאורך הציר האופטי (מצביע על המצלמה) הם קשה לשחזר במדויק; אי ודאויות באורך והמיקום של האובייקט להיות גדולות. מגבלה זו היא בין שאר בשל העומק הסיביות המוגבל של פיקסלים הקלטת הולוגרמה (מספר הרמות האפורות שונות שהמצלמה יכולה להקליט). עוד תצורה בעייתית מתרחשת כאשר מושא העניין הוא קרוב מאוד למישור המוקד. במקרה זה, תמונות אמיתיות ווירטואליות של האובייקט משוחזרים בסמיכות, והוליד שדות אופטיים מסובכים שקשה לפרש. חשש שני, מעט פחות חשוב כאן הוא ששולי עקיפה וכתוצאה מתופסים פחות של חיישן התמונה, וinf גרנולות גס זהormation מוביל לשיקום עני באיכות. בפועל, מסנן שיפוע פשוט מוחל כרכים משוחזרים תלת ממדים כדי לזהות היפוכי עוצמה חזקים לאורך כיוון התאורה. אזורים שבם בעוצמה משתנה במהירות מהאור לחושך, או להיפך, אז הם קשורים באזורי פיזור. אובייקטים בחולשה-פיזור מתוארים גם כאוסף noninteracting של אלמנטים כגון 20; סכום תרומות הבודד האלה לתת את השדה המפוזר בסך הכל שהוא הפוך בקלות באמצעות גב שיטת ריבוי ריילי-זומרפלד. במאמר זה, טכניקת שיפוע עוצמת צירית מוחלת על שרשרת של תאי סטרפטוקוקוס. גופי התא הם אובייקטי שלב (יש החיידק מיני מקדם שבירה נמדדה 21 להיות 1.384 בλ = 589 ננומטר אורך גל; מתח סטרפטוקוקוס צפוי להיות דומה) ותופיע כשרשרת בעוצמה גבוהה של כתמים מחוברים ב הלאחר סינון שיפוע דואר נפח דגימה יושם. שיטות מיצוי סטנדרטיות סף והתכונה להחיל נפח מסונן זה מאפשרים המיצוי של פיקסלים נפח (voxels) המתאימים לאזור בתוך התאים. יתרון מסוים של שיטה זו הוא שהיא מאפשרת שחזור חד משמעי של העמדה של אובייקט בכיוון הצירי. שיטות דומות (לפחות, שהולוגרמות אלה השיא קרובים לאובייקט, צילמו באמצעות מיקרוסקופ מטרה) סובלות מחוסר יכולת לקבוע את הסימן של עקירה זו. למרות ששיטת שחזור ריילי-זומרפלד גם לחתום עצמאי במובן זה, הפעולה הדרגתית מאפשרת לנו להבחין בין עצמים שלב החלשים מעל ומתחת למישור המוקד.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="780">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;width:180px;">Nikon Eclipse Ti-E inverted microscope</td>
			<td style="width:187px;">Nikon Corp.</td>
			<td style="width:147px;"> </td>
			<td style="width:267px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;width:180px;">LED</td>
			<td style="width:187px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:147px;">M660L3</td>
			<td style="width:267px;">emission wavelength &#955;=660 nm, linewidth approximately 20 nm </td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:180px;">LED power supply</td>
			<td style="width:187px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:147px;">LEDD1B</td>
			<td style="width:267px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:180px;">Thread Adapter</td>
			<td style="width:187px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:147px;">SM2T2</td>
			<td style="width:267px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:180px;">Thread Adapter</td>
			<td style="width:187px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:147px;">SM1A2</td>
			<td style="width:267px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:180px;">Frame Grabber board</td>
			<td style="width:187px;">EPIX </td>
			<td style="width:147px;">PIXCI E4 </td>
			<td style="width:267px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:180px;">High-Speed CMOS camera</td>
			<td style="width:187px;">Mikrotron</td>
			<td style="width:147px;">MC-1362</td>
			<td style="width:267px;"> </td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

digital inline holographic microscopy (dihm) of weakly-scattering subjects

אובייקטים בחולשה-פיזור, כגון חלקיקי colloidal קטנים ורוב תאים ביולוגיים, הם נתקלו לעתים קרובות במיקרוסקופ. אכן, מגוון רחב של טכניקות פותחו כדי להמחיש טוב יותר אובייקטי השלב הבאים; ניגוד השלב ודסק&quot;ש הם בין השיטות הפופולריות ביותר לשיפור קונטרסט. עם זאת, עמדת הקלטה וצורה בכיוון מחוץ להדמית מטוס נותרים מאתגרות. דו&quot;ח זה מציג את שיטה ניסיונית פשוטה כדי לקבוע במדויק את המיקום וגיאומטריה של אובייקטים בשלושה ממדים, באמצעות מיקרוסקופ הולוגרפי מוטבע דיגיטלי (DIHM). באופן כללי, הנגיש נפח הדגימה מוגדר על ידי גודל חיישן המצלמה בכיוון לרוחב, ולכידות התאורה בכיוון הצירי. כרכי מדגם אופייניים נעים בין 200 מיקרומטר x 200 מיקרומטר x 200 מיקרומטר באמצעות תאורת LED, ל5 מ&quot;מ x 5 מ&quot;מ x 5 מ&quot;מ ויותר, באמצעות תאורת לייזר. אור ההארה זו מוגדר כך שגלי מטוס הם אירוע על המדגם. אובייקטים בנפח הדגימה אז מפזרים אור, אשר מפריע לאור unscattered כדי ליצור דפוסי התערבות בניצב לכיוון התאורה. תמונה זו (הולוגרמה) מכילה את מידע העומק הנדרש לשחזור תלת ממדי, ויכולה להיות שנתפס על מכשיר הדמיה סטנדרטי כגון ה-CMOS או מצלמת CCD. שיטת גב התפשטות ריילי-זומרפלד מועסקת למקד מחדש מבחינה מספרית תמונות מיקרוסקופ, והיוריסטי הדמיה פשוטה המבוסס על שלב Gouy האנומליה משמשת לזיהוי פיזור אובייקטים בתוך הנפח המשוחזר. שיטה פשוטה אך חזקה כתוצאה ממדידה חד משמעית, ללא מודל של המיקום וצורה של אובייקטים בדגימות מיקרוסקופיות.

כדי להדגים את היכולות של DIHM, ניסויים בוצעו על שרשרת של חיידקי סטרפטוקוקוס. השרשרת עצמה נמדדה 10.5 מ&quot;מ ארוכה, והייתה מורכבת מ6-7 תאי sphero-גלילי (שניים מהתאים בשרשרת קרובים לחלוקת) בקטרים ​​בטווח 0.6-1 מיקרומטר. איורים 1A ו-1B להראות את הממשק הראשי של השיקום ותו?...

Watch this Scientific Journal Video about Digital Inline Holographic Microscopy DIHM of Weakly-scattering Subjects at JoVE.com

Digital Inline Holographic Microscopy DIHM of Weakly-scattering Subjects

המקומות תלת ממדיים של אובייקטים בחולשה-פיזור יכולים להיות מזוהים באופן ייחודי באמצעות מיקרוסקופ דיגיטלי מוטבע הולוגרפית (DIHM), הכולל שינוי קל במיקרוסקופ רגיל. התוכנה שלנו משתמשת היוריסטי הדמיה פשוטה יחד עם ריילי-זומרפלד גב ההתפשטות להניב את המיקום ואת הגיאומטריה של אובייקט שלב מיקרוסקופי תלת ממדים.

דיגיטלי Inline הולוגרפי מיקרוסקופית (DIHM) של נושאים בחולשת פיזור

Weakly-scattering objects, such as small colloidal particles and most biological cells, are frequently encountered in microscopy. Indeed, a range of ...

digital-inline-holographic-microscopy-dihm-weakly-scattering

Research

JoVE Journal

Biology

Digital Inline Holographic Microscopy (DIHM) of Weakly-scattering Subjects

12.1K Views.  Harvard University.  המקומות תלת ממדיים של אובייקטים בחולשה-פיזור יכולים להיות מזוהים באופן ייחודי באמצעות מיקרוסקופ דיגיטלי מוטבע הולוגרפית (DIHM), הכולל שינוי קל במיקרוסקופ רגיל. התוכנה שלנו משתמשת היוריסטי הדמיה פשוטה יחד עם ריילי-זומרפלד גב ההתפשטות להניב ?...

Video: Digital Inline Holographic Microscopy DIHM of Weakly-scattering Subjects

Determining heat and mechanical pain threshold in inflamed skin of human subjects

In a previous article in the Journal of Visualized Experiments we have demonstrated skin microdialysis techniques for the collection of tissue-specific nociceptive and inflammatory biochemicals in humans. In this article we will show pain-testing paradigms that are often used in tandem with microdialysis procedures. Combining pain tests with microdialysis provides the critical link between behavioral and biochemical data that allows identifying key biochemicals responsible for generating and propagating pain.
Two models of evoking pain in inflamed skin of human study participants are shown. The first model evokes pain with aid of heat stimuli. Heat evoked pain as described here is predominantly mediated by small, non-myelinated peripheral nociceptive nerve fibers (C-fibers). The second model evokes pain via punctuated pressure stimuli. Punctuated pressure evoked pain is predominantly mediated by small, myelinated peripheral nociceptive nerve fibers (A-delta fibers). The two models are mechanistically distinct and independently examine nociceptive processing by the two major peripheral nerve fiber populations involved in pain signaling.
Heat pain is evoked with aid of the TSA II, a commercially available thermo-sensory analyzer (Medoc Advanced Medical Systems, Durham, NC). Stimulus configuration and delivery is handled with aid of specific software. Thermodes vary in size and shape but in principle consist of a metal plate that can be heated or cooled at various rates and for different periods of time. Algorithms assessing heat-evoked pain are manifold. In the experiments shown here, study participants are asked to indicate at what point they start experiencing pain while the thermode in contact with skin is heated at a predetermined rate starting at a temperature that does not evoke pain. The thermode temperature at which a subject starts experiencing pain constitutes the heat pain threshold.
Mechanical pain is evoked with punctuated probes. Such probes are commercially available from several manufacturers (von Frey hairs). However, the accuracy of von Frey hairs has been criticized and many investigators use custom made punctuated pressure probes. In the experiments shown here eight custom-made punctuated probes of different weights are applied in consecutive order, a procedure called up-down algorithm, to identify perceptional deflection points, i.e., a change from feeling no pain to feeling pain or vice versa. The average weight causing a perceptional deflection constitutes the mechanical pain threshold.

Algorithms assessing heat and mechanical pain thresholds in experimentally inflamed skin of human study subjects are shown. The two pain testing paradigms independently examine nociceptive processing by the two major peripheral nerve fiber populations transmitting pain, i.e., non-myelinated C fibers and small myelinated A-delta fibers.

קביעת חום סף כאב מכני של העור מודלק בבני אדם

In a previous article in the Journal of Visualized Experiments we have demonstrated skin microdialysis techniques for the collection of tissue-specific ...

Digital Microfluidics for Automated Proteomic Processing

Clinical proteomics has emerged as an important new discipline, promising the discovery of biomarkers that will be useful for early diagnosis and prognosis of disease. While clinical proteomic methods vary widely, a common characteristic is the need for (i) extraction of proteins from extremely heterogeneous fluids (i.e. serum, whole blood, etc.) and (ii) extensive biochemical processing prior to analysis. Here, we report a new digital microfluidics (DMF) based method integrating several processing steps used in clinical proteomics. This includes protein extraction, resolubilization, reduction, alkylation and enzymatic digestion. Digital microfluidics is a microscale fluid-handling technique in which nanoliter-microliter sized droplets are manipulated on an open surface. Droplets are positioned on top of an array of electrodes that are coated by a dielectric layer - when an electrical potential is applied to the droplet, charges accumulate on either side of the dielectric. The charges serve as electrostatic handles that can be used to control droplet position, and by biasing a sequence of electrodes in series, droplets can be made to dispense, move, merge, mix, and split on the surface. Therefore, DMF is a natural fit for carrying rapid, sequential, multistep, miniaturized automated biochemical assays. This represents a significant advance over conventional methods (relying on manual pipetting or robots), and has the potential to be a useful new tool in clinical proteomics.
Mais J. Jebrail, Vivienne N. Luk, and Steve C. C. Shih contributed equally to this work.
Sergio L. S. Freire's current address is at the University of the Sciences in Philadelphia located at 600 South 43rd Street, Philadelphia, PA 19104.

Digital Microfluidics is a technique characterized by the manipulation of discrete droplets (~nL - mL) on an array of electrodes by the application of electrical fields. It is well-suited for carrying out rapid, sequential, miniaturized automated biochemical assays. Here, we report a platform capable of automating several proteomic processing steps.

מיקרופלואידיקה דיגיטלי עבור עיבוד אוטומטי proteomic

Clinical proteomics has emerged as an important new discipline, promising the discovery of biomarkers that will be useful for early diagnosis and ...

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and cellular content. Hallmark events of mitosis, such as chromosome movement, can be readily tracked on an individual cell basis using time-lapse fluorescence microscopy of mammalian cell lines expressing specific GFP-tagged proteins. In combination with RNAi-based depletion, this can be a powerful method for pinpointing the stage(s) of mitosis where defects occur after levels of a particular protein have been lowered. In this protocol, we present a basic method for assessing the effect of depleting a potential mitotic regulatory protein on the timing of mitosis. Cells are transfected with siRNA, placed in a stage-top incubation chamber, and imaged using an automated fluorescence microscope. We describe how to use software to set up a time-lapse experiment, how to process the image sequences to make either still-image montages or movies, and how to quantify and analyze the timing of mitotic stages using a cell-line expressing mCherry-tagged histone H2B. Finally, we discuss important considerations for designing a time-lapse experiment. This strategy is complementary to other approaches and offers the advantages of 1) sensitivity to changes in kinetics that might not be observed when looking at cells as a population and 2) analysis of mitosis without the need to synchronize the cell cycle using drug treatments. The visual information from such imaging experiments not only allows the sub-stages of mitosis to be assessed, but can also provide unexpected insight that would not be apparent from cell cycle analysis by FACS.

Here we describe a basic protocol to image and quantify the mitotic timing of live mammalian tissue culture cells after siRNA transfection.

זמן לשגות הדמיה של מיטוזה לאחר transfection siRNA

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and temporal resolution to study in vivo hematopoiesis using the murine bone marrow transplant experimental model. Genetic combinatorial marking using lentiviral vectors encoding fluorescent proteins (FPs) enabled cell fate mapping through advanced microscopy imaging. Vectors encoding five different FPs: Cerulean, EGFP, Venus, tdTomato, and mCherry were used to concurrently transduce HSPCs, creating a diverse palette of color marked cells. Imaging using confocal/two-photon hybrid microscopy enables simultaneous high resolution assessment of uniquely marked cells and their progeny in conjunction with structural components of the tissues. Volumetric analyses over large areas reveal that spectrally coded HSPC-derived cells can be detected non-invasively in various intact tissues, including the bone marrow (BM), for extensive periods of time following transplantation. Live studies combining video-rate multiphoton and confocal time-lapse imaging in 4D demonstrate the possibility of dynamic cellular and clonal tracking in a quantitative manner.

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

Combinatorial 5 fluorescent proteins marking of hematopoietic stem and progenitor cells allows in vivo clonal tracking via confocal and two-photon microscopy, providing insights into bone marrow hematopoietic architecture during regeneration. This method allows non-invasive fate mapping of spectrally-coded HSPCs-derived cells in intact tissues for extensive periods of time following transplantation.

במשובט מעקב vivo של גזע hematopoietic ובתאים המסומנים על ידי חמישה חלבונים ניאון באמצעות Confocal וmultiphoton מיקרוסקופית

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

במעקב 4 ממדי Vivo של תאי גזע ואבות היווצרות דם במבוגרי עכבר calvarial מח עצם

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Simple Bulk Readout of Digital Nucleic Acid Quantification Assays

Digital assays are powerful methods that enable detection of rare cells and counting of individual nucleic acid molecules. However, digital assays are still not routinely applied, due to the cost and specific equipment associated with commercially available methods. Here we present a simplified method for readout of digital droplet assays using a conventional real-time PCR instrument to measure bulk fluorescence of droplet-based digital assays.
We characterize the performance of the bulk readout assay using synthetic droplet mixtures and a droplet digital multiple displacement amplification (MDA) assay. Quantitative MDA particularly benefits from a digital reaction format, but our new method&#160;applies to any digital assay. For established digital assay protocols such as digital PCR, this method serves to speed up and simplify assay readout.
Our bulk readout methodology brings the advantages of partitioned assays without the need for specialized readout instrumentation. The principal limitations of the bulk readout methodology are reduced dynamic range compared with droplet-counting platforms and the need for a standard sample, although the requirements for this standard are less demanding than for a conventional real-time experiment. Quantitative whole genome amplification (WGA) is used to test for contaminants in WGA reactions and is the most sensitive way to detect the presence of DNA fragments with unknown sequences, giving the method great promise in diverse application areas including pharmaceutical quality control and astrobiology.

We describe an endpoint digital assay for quantifying nucleic acids with a simplified (analog) readout. We measure bulk fluorescence of droplet-based digital assays using a standard qPCR machine rather than specialized instrumentation and confirm our results by microscopy.

Readout גורף פשוט של דיגיטלי מבחני כימות חומצות גרעין

Digital assays are powerful methods that enable detection of rare cells and counting of individual nucleic acid molecules. However, digital assays are ...

Magnetic-Activated Cell Sorting Strategies to Isolate and Purify Synovial Fluid-Derived Mesenchymal Stem Cells from a Rabbit Model

Mesenchymal stem cells (MSCs) are the main cell source for cell-based therapy. MSCs from articular cavity synovial fluid could potentially be used for cartilage tissue engineering. MSCs from synovial fluid (SF-MSCs) have been considered promising candidates for articular regeneration, and their potential therapeutic benefit has made them an important research topic of late. SF-MSCs from the knee cavity of the New Zealand white rabbit can be employed as an optimized translational model to assess human regenerative medicine. By means of CD90-based magnetic activated cell sorting (MACS) technologies, this protocol successfully obtains rabbit SF-MSCs (rbSF-MSCs) from this rabbit model and further fully demonstrates the MSC phenotype of these cells by inducing them to differentiate to osteoblasts, adipocytes, and chondrocytes. Therefore, this approach can be applied in cell biology research and tissue engineering using simple equipment and procedures.

This article presents a simple and economic protocol for the straightforward isolation and purification of mesenchymal stem cells from New Zealand white rabbit synovial fluid.

מגנטי תא לפעיל על-מיון אסטרטגיות כדי לבודד ולטהר Synovial נגזר הנוזלים בתאי גזע Mesenchymal ממודל ארנב

Mesenchymal stem cells (MSCs) are the main cell source for cell-based therapy. MSCs from articular cavity synovial fluid could potentially be used for ...

Micron-scale Phenotyping Techniques of Maize Vascular Bundles Based on X-ray Microcomputed Tomography

It is necessary to accurately quantify the anatomical structures of maize materials based on high-throughput image analysis techniques. Here, we provide a 'sample preparation protocol' for maize materials (i.e., stem, leaf, and root) suitable for ordinary microcomputed tomography (micro-CT) scanning. Based on high-resolution CT images of maize stem, leaf, and root, we describe two protocols for the phenotypic analysis of vascular bundles: (1) based on the CT image of maize stem and leaf, we developed a specific image analysis pipeline to automatically extract 31 and 33 phenotypic traits of vascular bundles; (2) based on the CT image series of maize root, we set up an image processing scheme for the three-dimensional (3-D) segmentation of metaxylem vessels, and extracted two-dimensional (2-D) and 3-D phenotypic traits, such as volume, surface area of metaxylem vessels, etc. Compared with traditional manual measurement of vascular bundles of maize materials, the proposed protocols significantly improve the efficiency and accuracy of micron-scale phenotypic quantification.

We provide a novel method to improve the X-ray absorption contrast of maize tissue suitable for ordinary microcomputed tomography scanning. Based on CT images, we introduce a set of image-processing workflows for different maize materials to effectively extract microscopic phenotypes of vascular bundles of maize.

טכניקות Phenotyping בקנה מידה מיקרון של חבילות וסקולריים תירס מבוסס על צילום רנטגן טומוגרפיה Microcomputed

It is necessary to accurately quantify the anatomical structures of maize materials based on high-throughput image analysis techniques. Here, we provide a ...

Biological Sample Preparation by High-pressure Freezing, Microwave-assisted Contrast Enhancement, and Minimal Resin Embedding for Volume Imaging

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the imaging modality in a focused ion beam scanning electron microscope (FIB-SEM), which is used to obtain stacks of sequential images for 3D reconstruction and modelling. High-pressure freezing (HPF) allows close to native structural preservation, but the subsequent freeze substitution often does not provide sufficient contrast, especially for a bigger specimen, which is needed for high-quality imaging in the SEM required for 3D reconstruction. Therefore, in this protocol, after the freeze substitution, additional contrasting steps are carried out at room temperature. Although these steps are performed in a microwave, it is also possible to follow traditional bench processing, which requires longer incubation times.The subsequent embedding in minimal amounts of resin allows for faster and more precise targeting and preparation inside the FIB-SEM. This protocol is especially useful for samples that require preparation by high-pressure freezing for a reliable ultrastructural preservation but do not gain enough contrast during the freeze substitution for volume imaging using FIB-SEM. In combination with the minimal resin embedding, this protocol provides an efficient workflow for the acquisition of high-quality volume data.

Here we present a protocol for combining two sample processing techniques, high-pressure freezing and microwave-assisted sample processing, followed by minimal resin embedding for acquiring data with a focused ion beam scanning electron microscope (FIB-SEM). This is demonstrated using a mouse tibial nerve sample and Caenorhabditis elegans.

הכנת הדוגמא ביולוגית על ידי הקפאת בלחץ גבוה, שיפור ניגודיות בסיוע מיקרוגל, ושרף מינימלי הטמעה של אמצעי הדמיה

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the ...

Cryo-Electron Microscopic Grid Preparation for Time-Resolved Studies using a Novel Robotic System, Spotiton

The capture of short-lived molecular states triggered by the early encounter of two or more interacting particles continues to be an experimental challenge of great interest to the field of cryo-electron microscopy (cryo-EM). A few methodological strategies have been developed that support these &#34;time-resolved&#34; studies, one of which, Spotiton-a novel robotic system-combines the dispensing of picoliter-sized sample droplets with precise temporal and spatial control. The time-resolved Spotiton workflow offers a uniquely efficient approach to interrogate early structural rearrangements from minimal sample volume. Fired from independently controlled piezoelectric dispensers, two samples land and rapidly mix on a nanowire EM grid as it plunges toward the cryogen. Potentially hundreds of grids can be prepared in rapid succession from only a few microliters of a sample. Here, a detailed step-by-step protocol of the operation of the Spotiton system is presented with a focus on troubleshooting specific problems that arise during grid preparation.

The protocol presented here describes the use of Spotiton, a novel robotic system, to deliver two samples of interest onto a self-wicking, nanowire grid that mix for a minimum of 90 ms prior to vitrification in liquid cryogen.