والمؤلفان بالشكر ليندا تيرنر للمساعدة في إعداد الميكروبيولوجية. وتم تمويل RZ وLGW من قبل معهد رولاند في جامعة هارفارد وCGB كما تم تمويل مؤسسة عالم الرؤوس، والعلوم بلا حدود البرنامج، البرازيل (عملية # 7340-11-7)

1. الإعداد والحصول على البيانات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنمو ثقافة العقدية سلالة V4051-197 (السباحة على نحو سلس) الخلايا في كتاي المتوسطة من الأسهم المجمدة 22. احتضان في شاكر دوارة بين عشية وضحاها في 35 درجة مئوية و 150 دورة في الدقيقة، لالتشبع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطعيم 10 مل من الطازجة المتوسطة كتاي مع 500 ميكرولتر من ثقافة مشبعة. احتضان لمدة 3.5 ساعة أخرى في 35 درجة مئوية و 150 دورة في الدقيقة حتى الخلايا التوصل إلى الكثافة البصرية ما يقرب من 1.0 في λ = 600 نانومتر (حوالي 5 × 10 8 خلية / مل). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع 1:400 في وسائل الإعلام الجديدة للحصول على التركيز النهائي للخلايا متحركة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> على شريحة المجهر، وجعل حلقة من الشحوم (على سبيل المثال من حقنة مليئة الفازلين) حوالي 1 مم في الارتفاع ووضع قطرة من محلول العينة في المركز. وضع غطاء زجاجي على أعلى واضغط برفق على حواف لختم، وضمان أن السائل هو في اتصال مع كل الشرائح والزجاج غطاء. وينبغي أن تكون حجرة العينة الناتجة أروالثانية 100-200 ميكرون في العمق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع حجرة العينة في المجهر مع غطاء زجاجي لأسفل، وبعناية، لمنع تشكيل فقاعات الهواء في النفط بين الزجاج والعدسة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تركيز المجهر على السطح السفلي من الغرفة العينة، وتحقيق المكثف على التركيز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إيقاف تشغيل الإضاءة القياسية ووضع الرأس الصمام وراء فتحة المكثف من المجهر. تعيين وادى امدادات الطاقة إلى أقصى الانتاج. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إغلاق الفتحة مكثف إلى أقصى مداه، وإذا لزم الأمر، دفع الصمام في جبل لحين تركزت الإضاءة على فتحة عدسة الهدف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التبديل على جهاز الكمبيوتر والكاميرا، وتوجيه كل الضوء إلى منفذ الكاميرا المجهر. ضبط معدل الإطار وحجم الصورة في البرنامج الحصول على الصور. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل زمن التعرض الإطار قصيرة قدر الإمكان في حين لا يزال الإبقاء على النقيض جيدة. تحقق صورة كثافة الرسم البياني للتأكد من أن الصورة ليست saturaتيد أو تحت المكشوفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا لزم الأمر، إعادة تركيز المجهر بحيث يتم امتبائر موضع اهتمام قليلا (عادة بنسبة 10-30 ميكرون). يجب أن يكون الهدف والمستوى البؤري في نفس المتوسطة (أي البؤري يجب أن تقع داخل حجرة العينة). </li></ol> 2. إعادة الإعمار الخطوة الأولى في معالجة البيانات لإعادة تركيز عدديا إطار الفيديو في سلسلة من أعماق مختلفة، وإنتاج كومة من الصور. صديقة للمستخدم البرنامج للقيام بذلك ويمكن الاطلاع هنا: <a href="http://www.rowland.harvard.edu/rjf/wilson/Downloads.html">http://www.rowland.harvard.edu/rjf/wilson/Downloads.html</a> جنبا إلى جنب مع صور سبيل المثال (المكتسبة باستخدام مجهر مقلوب، و60X الغمر النفط عدسة الهدف) وملف المسرح لتتبع أشعة التقديم. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إدخال إطار المصالح والخلفية الخاصة به على شكل ملفات صورة منفصلة، ​​في المربعات ذات الصلة على الواجهة. صورة الخلفية هو الإطار الذي وairly يمثل خلفية شريط الفيديو، في غياب صورة ثلاثية الأبعاد، وسيتم استخدامها لقمع أي الضوضاء نمط ثابت التي يمكن أن تتداخل مع التعريب صورة ثلاثية الأبعاد وتحليلها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إدخال قيم في مربعات الإعدادات العمومية على الجانب الأيسر من الشاشة قبل تشغيل البرنامج. الثلاثة الأولى هي إخراج معلمات مكدس: الموقف المحوري من الإطار الأول (&#39;بدء التركيز&#39;)؛ عدد من الشرائح في كومة بناؤها (&#39;عدد من الخطوات&#39;)؛ مسافة محورية بين كل شريحة في المكدس (&#39;حجم الخطوة&#39;) . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> من أجل إعادة بناء الأجسام مع النسب الصحيح، يجب أن يكون حجم الخطوة بنفس حجم التباعد بكسل الجانبي. دخول الجانبية تردد أخذ العينات الكاميرا (تباعد 1/pixel) في المربع &quot;بكسل / ميكرون&quot;، والطول الموجي الإضاءة ومعامل الانكسار المتوسطة في مربعات الماضيين. القيم الافتراضية للبرنامج هي مناسبة لإعادة بناء البيانات المثال. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اضغط على زر &#39;Z-التدرج فليب&#39; إذا كان مركز objeط مظلمة في صورة ثلاثية الأبعاد (انظر الإطار سبيل المثال لعام 2005 ومناقشة القسم لمزيد من التفاصيل). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التحقق من ممر الموجة مرشح على / قبالة الدولة (الافتراضي هو جرا). هذا ممر الموجة مرشح اختياري، وتقع في المربع أدناه التبديل التدرج في الوجه، هي المسؤولة عن قمع مساهمة من بكسل صاخبة. يتم تطبيق ممر الموجة مرشح لكل شريحة الصورة على الفور بعد جيل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التحقق من التبديل الناتج متوسطة على / قبالة الدول (الافتراضي هو جرا). تتم كتابة الخطوات تحليل وسيطة في اثنين من أشرطة الفيديو الناتج، غير مضغوط ملفات افي: الأول هو مكدس تركيز (اسم الملف تنتهي في &#39;_stack.avi&#39;)، والثاني هو مكدس بعد العملية التدرج المحوري (اسم الملف تنتهي في &#39; _gradient.avi &#39;). من الناحية المثالية، سوف يحتوي هذا المكدس الثاني موضع اهتمام أبرز ككائن مشرق على خلفية داكنة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد وضع جميع المعلمات، اضغط على &quot;تشغيل&quot; في النافذة الرئيسية. سيظهر الإطار المحدد في المربع الرئيسي من البرنامج. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدامالمكبرة أداة الزجاج وجدت في شريط الأدوات على يسار الصورة للتكبير (فوق اليسار) والتصغير (التحول + فوق اليسار). استخدام الأداة مستطيل على شريط الأدوات لتحديد المنطقة ذات الاهتمام (ROI). التقاط أكبر عدد ممكن من هامش الهولوغرام وممكن داخل المستطيل، حيث سيؤدي ذلك إلى تحسين إعادة الإعمار. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اضغط على زر &#39;عملية&#39; لتوليد اثنين من مداخن الصورة. تفقد المداخن الناتجة باستخدام يماغيج (التي يمكن الحصول عليها مجانا في <a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/">http://rsb.info.nih.gov/ij/</a> ). إذا كان موضع اهتمام ويمكن رؤيتها بوضوح في صورة التدرج مكدس، انتقل إلى الخطوة التالية لاستخراج الإحداثيات الكائن. </li></ol> 3. أداء <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إلى جانب إعادة تركيز الإطار، يمكن هذا البرنامج تحديد إحداثيات س، ص، ض لكل فوكسل في كائن من الفائدة. اضغط على زر &#39;ميزة استخراج &quot;لتمكين هذه الوظيفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إدخال مسار، بما في ذلك التمديد (على سبيل المثال: C: منزل output.inc)، لخرج إحداثيات ملف. اختر &#39;نمط بوف راي &quot;في مربع&quot; تنسيق الإخراج أسلوب&#39;. يؤدي هذا البرنامج إلى إرسال ملف الكائن الذي يمكن تصور باستخدام بوف راي حزمة البرامج raytracing الحرة (التي يمكن الحصول عليها من <a href="http://www.povray.org/">http://www.povray.org/</a> ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اعادة معالجة الصور كما في القسم 2 أعلاه. سيوفر البرنامج سلسلة من (س، ص، ض) الإحداثيات في العائد على الاستثمار مختارة، وكتب إلى اسم الملف في &#39;إخراج التنسيق&#39; مربع. استخراج الإحداثيات الكائن يأخذ فترة أطول كثيرا من الجيل المكدس. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تأكد من أن العينة ملف بوف راي (مرفق مع رمز إعادة الإعمار) هو في نفس المجلد مثل ملف الإحداثيات ولدت للتو. تحرير ملف بوف العينة. واستبدال اسم الملف في الفواصل المقلوب على الخط # تشمل &quot;MYFILE.inc&quot; مع اسم ملف البيانات التي تم إنشاؤها بواسطة رمز إعادة الإعمار. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انقر فوق الزر &#39;تشغيل&#39; في بوف راي لتقديم صورة نقطية. Tانه موقف الكاميرا، والإضاءة وخيارات الملمس ليست سوى عدد قليل من التخصيصات ممكن في بوف راي؛ راجع وثائق على الانترنت لمزيد من التفاصيل. </li></ol>

<ol>
	<li>Xu, W., Jericho, M. H., Meinertzhagen, I. A., Kreuzer, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+in-line+holography+for+biological+applications.">Digital in-line holography for biological applications.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98 (20), 11301-11305 (2001).</li><li>Sheng, J., Malkiel, E., Katz, J., Adolf, J., Belas, R., Place, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+holographic+microscopy+reveals+prey-induced+changes+in+swimming+behavior+of+predatory+dinoflagellates.">Digital holographic microscopy reveals prey-induced changes in swimming behavior of predatory dinoflagellates.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 17512-17517 (2007).</li><li>Lee, S. H., Roichman, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+and+tracking+single+colloidal+particles+with+video+holographic+microscopy.">Characterizing and tracking single colloidal particles with video holographic microscopy.</a> Opt. Express. 15 (26), 18275-18282 (2007).</li><li>Fung, J., Martin, K. E., Perry, R. W., Katz, D. M., McGorty, R., Manoharan, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+translational,+rotational,+and+vibrational+dynamics+in+colloids+with+digital+holographic+microscopy.">Measuring translational, rotational, and vibrational dynamics in colloids with digital holographic microscopy.</a> Opt. Express. 19 (9), 8051-8065 (2011).</li><li>Lee, S. H., Grier, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Holographic+microscopy+of+holographically+trapped+three-dimensional+structures.">Holographic microscopy of holographically trapped three-dimensional structures.</a> Opt. Express. 15 (4), 1505-1512 (2007).</li><li>Kim, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+and+techniques+of+digital+holographic+microscopy.">Principles and techniques of digital holographic microscopy.</a> SPIE Rev. 1, 018005 (2010).</li><li>Corkidi, G., Taboada, B., Wood, C. D., Guerrero, A., Darszon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+sperm+in+three-dimensions.">Tracking sperm in three-dimensions.</a> Biochem. Biophys. Res. Comm. 373, 125-129 (2008).</li><li>Santi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+Sheet+Fluorescence+Microscopy+:+A+Review.">Light Sheet Fluorescence Microscopy : A Review.</a> J. Histochem. Cytochem. 59, 129-138 (2011).</li><li>van Blaaderen, A., Wiltzius, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Real-Space Structure of Colloidal Hard-Sphere Glasses. Science. 270, 1177-1179 (1990).</li><li>Besseling, R., Weeks, E. R., Schofield, A. B., Poon, W. C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-Dimensional+Imaging+of+Colloidal+Glasses+under+Steady+Shear.">Three-Dimensional Imaging of Colloidal Glasses under Steady Shear.</a> Phys. Rev. Lett. 99, 028301 (2007).</li><li>Schall, P., Weitz, D., Spaepen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+Rearrangements+That+Govern+Flow+in+Colloidal+Glasses.">Structural Rearrangements That Govern Flow in Colloidal Glasses.</a> Science. 318, 1895-1899 (2007).</li><li>Rosen, J., Brooker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+incoherent+color+holography.">Fluorescence incoherent color holography.</a> Opt. Exp. 15, 2244-2250 (2007).</li><li>Jericho, M. H., Kreuzer, H. J., Kanka, M., Riesenberg, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+phase+and+refractive+index+measurements+with+point-source+digital+in-line+holographic+microscopy.">Quantitative phase and refractive index measurements with point-source digital in-line holographic microscopy.</a> Appl. Opt. 51 (10), 1503-1515 (2012).</li><li>Mudanyali, O., Erlinger, A., Seo, S., Su, T., Ozcan, D. T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lensless+On-chip+Imaging+of+Cells+Provides+a+New+Tool+for+High-throughput+Cell-Biology+and+Medical.">Lensless On-chip Imaging of Cells Provides a New Tool for High-throughput Cell-Biology and Medical.</a> J. Vis. Exp. 34, (2009).</li><li>Langehanenberg, P., Kemper, B., Dirksen, D., von Bally, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autofocusing+in+digital+holographic+phase+contrast+microscopy+on+pure+phase+objects+for+live+cell+imaging.">Autofocusing in digital holographic phase contrast microscopy on pure phase objects for live cell imaging.</a> Appl. Opt. 47 (19), (2008).</li><li>Elliot, M. S., Poon, W. C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conventional+optical+microscopy+of+colloidal+suspensions.">Conventional optical microscopy of colloidal suspensions.</a> Adv. Coll. Interf. Sci. 92, 133-194 (2001).</li><li>Agero, U., Monken, C. H., Ropert, C., Gazzinelli, R. T., Mesquita, O. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+surface+fluctuations+studied+with+defocusing+microscopy.">Cell surface fluctuations studied with defocusing microscopy.</a> Phys. Rev. E. 67, 051904 (2003).</li><li>Born, M., Wolf, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Principles of Optics, 6th Ed. , (1998).</li><li>Wilson, L., Zhang, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+Localization+of+weak+scatterers+in+digital+holographic+microscopy+using+Rayleigh-Sommerfeld+back-propagation.">3D Localization of weak scatterers in digital holographic microscopy using Rayleigh-Sommerfeld back-propagation.</a> Opt. Express. 20, 16735-16744 (2012).</li><li>Bohren, C., Huffman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Absorption and Scattering of Light by Small Particles. , (1983).</li><li>Balaev, A. E., Dvoretski, K. N., Doubrovski, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Refractive+index+of+escherichia+coli+cells.">Refractive index of escherichia coli cells.</a> Saratov Fall Meeting 2001: Optical Technologies in Biophysics and Medicine III. 4707 (1), 253-260 (2002).</li><li>Berg, H. C., Manson, M. D., Conley, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+and+Energetics+of+Flagellar+Rotation+in+Bacteria.">Dynamics and Energetics of Flagellar Rotation in Bacteria.</a> Symp. Soc. Exp. Biol. 35, 1-31 (1982).</li><li>Garcia-Sucerquia, J., Xu, W., Jericho, S. K., Klages, P., Jericho, M. H., Kreuzer, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+in-line+holographic+microscopy.">Digital in-line holographic microscopy.</a> Appl. Optics. 45 (5), 836-850 (2006).</li><li>Restrepo, J. F., Garcia-Sucerquia, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnified+reconstruction+of+digitally+recorded+holograms+by+Fresnel-Bluestein+transform.">Magnified reconstruction of digitally recorded holograms by Fresnel-Bluestein transform.</a> Appl. Optics. 49 (33), 6430-6435 (2010).</li><li>Dubois, F., Joannes, L., Legros, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+three-dimensional+imaging+with+a+digital+holography+microscope+with+a+source+of+partial+spatial+coherence.">Improved three-dimensional imaging with a digital holography microscope with a source of partial spatial coherence.</a> Appl. Optics. 38 (34), 7085-7094 (1999).</li><li>Kanka, M., Riesenberg, R., Petruck, P., Graulig, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+resolution+(NA=0.8)+in+lensless+in-line+holographic+microscopy+with+glass+sample+carriers.">High resolution (NA=0.8) in lensless in-line holographic microscopy with glass sample carriers.</a> Opt. Lett. 36 (18), 3651-3653 (2011).</li><li>Dubois, F., Requena, M. L., Minetti, C., Monnom, O., Istasse, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partial+spatial+coherence+effects+in+digital+holographic+microscopy+with+a+laser+source.">Partial spatial coherence effects in digital holographic microscopy with a laser source.</a> Appl. Optics. 43 (5), 1131-1139 (2004).</li><li>Magariyama, Y., Sugiyama, S., Muramoto, K., Kawagishi, I., Imae, Y., Kudo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+measurement+of+bacterial+flagellar+rotation+rate+and+swimming+speed.">Simultaneous measurement of bacterial flagellar rotation rate and swimming speed.</a> Biophysical Journal. 69 (5), 2154-2162 (1995).</li><li>Berg, H. C., Brown, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotaxis+in+Escherichia+coli+analysed+by+three-dimensional+tracking.">Chemotaxis in Escherichia coli analysed by three-dimensional tracking.</a> Nature. 239 (5374), 500-504 (1972).</li><li>Brooker, G., Siegel, N., Wang, V., Rosen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimal+resolution+in+Fresnel+incoherent+correlation+holographic+fluorescence+microscopy.">Optimal resolution in Fresnel incoherent correlation holographic fluorescence microscopy.</a> Opt. Express. 19 (6), 5047-5062 (2011).</li></ol>

يعلن الكتاب أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.

أهم خطوة في هذا البروتوكول التجريبي هو التقاط دقيقة من الصور من الإعداد التجريبية مستقرة. مع البيانات الأساسية الفقراء والتعمير الدقة العالية هو أقرب إلى المستحيل. من المهم أيضا لتجنب العدسات الهدف مع عنصر النقيض من المرحلة الداخلية (مرئية كما بالطوق الظلام عندما ت?...

مضمنة الرقمية المجهر الثلاثية الأبعاد (DIHM) يسمح بسرعة التصوير ثلاثي الأبعاد للعينات مجهرية، مثل الكائنات الحية الدقيقة السباحة 1،2 و 3،4 أنظمة المسألة لينة، مع الحد الأدنى من التعديل لإعداد المجهر القياسية. في هذه الورقة يتم توفير مظاهرة تربوية من DIHM، تتمحور حول برنامج تم تطويره في المختبر. وتشمل هذه الورقة وصفا لكيفية إعداد المجهر، وتحسين الحصول على البيانات، ومعالجة الصور المسجلة لإعادة بناء البيانات ثلاثية الأبعاد. برنامج (مقرها في جزء منه على البرامج التي وضعتها المديرية العامة جرير وغيرهم 5) والمثال الصور هي متاحة بحرية على موقعنا. ويرد وصف الخطوات اللازمة لتكوين المجهر، وإعادة بناء ثلاثة مجلدات الأبعاد من الصور المجسمة وتقديم وحدات التخزين الناتجة من الاهتمام باستخدام شعاع الحرة تتبع حزمة البرامج. تخلص الورقة مع مناقشة العوامل التي تؤثر على جودة إعادة الإعمار، ومقارنة مع طرق DIHM المتنافسة. على الرغم من DIHM وصفت منذ بعض الوقت (لاستعراض عام للمبادئ وتطورها، انظر كيم 6)، والقدرة الحاسوبية المطلوبة وصورة الخبرة تجهيز وحتى الآن تقتصر إلى حد كبير استخدامه لمجموعات بحثية متخصصة مع التركيز على تطوير الصك. هذا الوضع يتغير في ضوء التطورات الحديثة في مجال الحوسبة والتكنولوجيا الكاميرا. يمكن لأجهزة الكمبيوتر المكتبية الحديثة التعامل بسهولة مع تجهيز ومتطلبات تخزين البيانات؛ CCD أو CMOS الكاميرات موجودة في معظم مختبرات الفحص المجهري، وتبذل البرنامج المطلوبة متاحة بحرية على شبكة الانترنت من قبل الجماعات الذين استثمروا الوقت في تطوير هذه التقنية. وقد اقترحت عدة مخططات لتصوير تكوين الكائنات المجهرية في حجم العينة ثلاثية الأبعاد. العديد من هذه التقنيات يتم مسح 7،8، والتي يتم تسجيلها في كومة من الصور عن طريق مترجمة echanically الطائرة الصورة من خلال العينة. المسح المجهري متحد البؤر مضان وربما كان المثال الأكثر دراية. عادة، يتم إضافة صبغة الفلورسنت إلى كائن المرحلة من أجل تحقيق مستوى مقبول من عينة النقيض من ذلك، وترتيب متحد البؤر تستخدم لتوطين مكانيا الانبعاثات الفلورسنت. وقد أدى هذا الأسلوب إلى تقدم كبير، على سبيل المثال في العلوم الغروي، حيث سمح لها الوصول إلى ديناميكية ثلاثية الأبعاد للأنظمة مزدحمة 9-11. استخدام الوسم هو الفرق المهم بين المجهري متحد البؤر مضان وDIHM، ولكن ميزات أخرى من التقنيات اثنين تستحق المقارنة. DIHM لديه ميزة سرعة كبيرة في هذا الجهاز ليس لها أجزاء متحركة. المرايا المسح الميكانيكية في أنظمة متحد البؤر وضع حد أعلى لمعدل الحصول على البيانات - عادة حوالي 30 لقطة / ثانية للحصول على صورة بكسل 512 X 512. وتستخدم مجموعة من مثل هذه الصور من طائرات التنسيق المختلفة التي يمكن أن يحصل عليها جسديا translating المرحلة عينة أو عدسة الهدف بين الإطارات، مما أدى إلى معدل التقاط النهائية حول حجم واحد في الثانية لمدة 30 إطار المكدس. في المقابل، يمكن لنظام الثلاثية الأبعاد استنادا على كاميرا CMOS الحديثة التقاط 2،000 لقطة / ثانية في نفس حجم الصورة والقرار؛ تتم معالجة كل إطار `حاليا &#39;لإعطاء لقطة مستقلة من حجم العينة. أن أكرر: ليس مطلوبا من عينات الفلورسنت لDIHM، على الرغم من أن النظام تم تطويره الذي ينفذ إعادة الإعمار الثلاثية الأبعاد للموضوع الفلورسنت 12. فضلا عن معلومات وحدة التخزين ثلاثي الأبعاد، DIHM يمكن أن تستخدم أيضا لتوفير الكمية المرحلة على النقيض من الصور 13، ولكن هذا خارج نطاق المناقشة هنا. الصور DIHM البيانات الخام هي ثنائية الأبعاد، وفي بعض النواحي تبدو وكأنها صور المجهر القياسية، وإن كان خارج التركيز. والفرق الرئيسي بين DIHM ومعيار المجهر حقل مشرق يكمن في حلقات حيود التي تحيط الأجسام طن مجال الرؤية، وهذه هي نتيجة لطبيعة الإضاءة. يتطلب DIHM مصدر أكثر تماسكا من حقل مشرق - عادة ما يكون LED أو ليزر. حلقات حيود في صورة ثلاثية الأبعاد تحتوي على المعلومات الضرورية لإعادة بناء صورة ثلاثية الأبعاد. هناك نوعان من الأساليب الرئيسية لتفسير البيانات DIHM؛ المباشر المناسب وإعادة تركيز العددية. النهج الأول هو المعمول بها في الحالات التي يعرف الشكل الرياضي للنمط حيود مقدما 3،4؛ يتحقق هذا الشرط من قبل حفنة صغيرة من أشياء بسيطة مثل المجالات، واسطوانات، والعقبات نصف الطائرة. تركيب المباشرة ينطبق أيضا في الحالات التي يعرف الموقف المحوري للكائن، والصورة يمكن تركيبها باستخدام ننظر إلى أعلى الجدول من القوالب صورة 14. النهج الثاني (إعادة تركيز العددية) بل هي أعم وتعتمد على استخدام حلقات حيود في صورة ثلاثية الأبعاد ثنائي الأبعاد لإعادة بناء المجال البصري عدديا فيعدد من طائرات التنسيق (متباعدة بشكل تعسفي) في جميع أنحاء حجم العينة. توجد العديد من الطرق ذات الصلة للقيام بذلك 6؛ يستخدم هذا العمل رايلي-سمرفلد الظهر تقنية إكثار كما وصفها لي وجرير 5. نتائج هذا الإجراء هو كومة من الصور التي تحاكي تأثير تغيير البؤري المجهر (ومن هنا جاء اسم `إعادة تركيز العددية &#39;) يدويا. مرة واحدة تم إنشاؤها كومة من الصور، يجب الحصول على موقف من هذا الموضوع في الحجم البؤري. ، وقد تم عرض عدد من الاستدلال تحليل الصور، مثل التباين كثافة المحلية أو محتوى التردد المكاني لتحديد من حدة التركيز في نقاط مختلفة في العينة 15. في كل حالة، عندما يتم تكبير الصورة متري معين (أو التقليل منها)، ويعتبر الكائن ليكون في التركيز. خلافا لغيرها من البرامج التي تسعى إلى تحديد المستوى البؤري خاص حيث هو كائن &quot;في التركيز&quot;، وطريقة في هذا العمل يختار من عoints التي تقع داخل الكائن من الفائدة، والتي قد تمتد عبر مجموعة واسعة من طائرات التنسيق. هذا النهج ينطبق على طائفة واسعة من المواضيع ومناسبة خاصة للمدد، وعينات من نثر ضعيفة (كائنات المرحلة)، مثل الغرويات على شكل قضيب، وسلاسل من البكتيريا أو سياط حقيقية النواة. في مثل هذه العينات يغير الصورة النقيض عندما يمر جسم من خلال البؤري؛ صورة امتبائر بها مركز الضوء إذا كان الكائن على جانب واحد من الطائرة ومركز التنسيق الظلام إذا كان من جهة أخرى. كائنات مرحلة نقية ليس لديهم أي النقيض عندما تقع بالضبط في المستوى البؤري. وقد تمت مناقشة هذه الظاهرة من انعكاس على النقيض من قبل مؤلفين آخرين 16،17 هو في نهاية المطاف وبسبب المرحلة GOUY الشذوذ 18. وقد تم وضع هذا على أساس أكثر صرامة في سياق تصوير ثلاثي الأبعاد في أي مكان آخر، حيث يتم تقييم حدود التقنية، وعدم اليقين في موقف نموذجي هو من أجل من 150 نانومتر (ما يقرب من واحد بكسل) في مجموعة شرق افريقياح 19 اتجاه. على طريقة GOUY مرحلة الشذوذ هو واحد من عدد قليل من مخططات DIHM واضحة المعالم لتحديد بنية الكائنات الموسعة في ثلاثة أبعاد، ولكن مع ذلك بعض الكائنات هي إشكالية لإعادة بناء. الكائنات التي تقع مباشرة على طول المحور البصري (مشيرا في الكاميرا) يصعب إعادة بناء بدقة؛ الشكوك في طول وموضع الكائن تصبح كبيرة. هذا القيد هو في جزء منه نتيجة لعمق بت محدود من وحدات البكسل تسجيل الهولوغرام (عدد مستويات الرمادي المتميزة التي يمكن أن تسجل الكاميرا). يحدث التكوين إشكالية أخرى عند موضع اهتمام هو قريب جدا من المستوى البؤري. في هذه الحالة، يتم بناؤها الصور الحقيقية والافتراضية للكائن على مقربة، مما أدى إلى الحقول البصرية المعقدة التي يصعب تفسيرها. ثانيا، والقلق قليلا أقل أهمية هنا هو أن هامش حيود الناتجة تشغل أقل من صورة الاستشعار، وهذا الوقود النووي المشع الحبيبات الخشنةormation يؤدي إلى إعادة بناء ذات جودة الفقيرة. في الممارسة العملية، يتم تطبيق مرشح التدرج إلى وحدات تخزين بسيطة أعيد بناؤها ثلاثي الأبعاد للكشف عن ظاهرة الانقلاب كثافة قوية على طول اتجاه الإضاءة. المناطق التي يتغير بسرعة شدة من الضوء إلى الظلام، أو العكس، ثم يتم المرتبطة المناطق نثر. موصوفة جيدا الأجسام نثر ضعيفة، كمجموعة noninteracting من هذه العناصر 20، وهذه المساهمات الفردية المبلغ لإعطاء مجموع الحقل متناثرة الذي هو مقلوب بسهولة باستخدام رايلي-سمرفلد أسلوب ظهر الانتشار. في هذه الورقة، يتم تطبيق كثافة المحوري تقنية الانحدار إلى سلسلة من الخلايا العقدية. أجسام الخلايا هي كائنات المرحلة (الأنواع كولاي ديها معامل الانكسار قياس 21 ليكون 1.384 في الطول الموجي λ = 589 نانومتر؛ من المرجح أن تكون مماثلة سلالة العقدية) وتبدو وكأنها سلسلة عالية الكثافة من النقط المتصلة في اله حجم العينة بعد التصفية التدرج تم تطبيقه. عتبة وميزة أساليب الاستخراج القياسية المطبقة على وحدة التخزين هذه تصفيتها تسمح استخراج بكسل الحجمي (voxels) المقابلة لمنطقة داخل الخلايا. وهناك ميزة خاصة لهذا الأسلوب هو أنه يتيح إعادة الإعمار لا لبس فيه من موقف كائن في الاتجاه المحوري. أساليب مماثلة (على الأقل، وتلك التي الهولوغرام سجل على مقربة من وجوه، من خلال تصويرها الهدف المجهر) يعانون من عدم القدرة على تحديد علامة على هذا النزوح. على الرغم من أن طريقة إعادة الإعمار رايلي-سمرفلد هو أيضا التوقيع مستقلة في هذا المعنى، فإن عملية التدرج يتيح لنا أن تميز بين الكائنات المرحلة ضعيفة فوق وتحت المستوى البؤري.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="780">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;width:180px;">Nikon Eclipse Ti-E inverted microscope</td>
			<td style="width:187px;">Nikon Corp.</td>
			<td style="width:147px;"> </td>
			<td style="width:267px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;width:180px;">LED</td>
			<td style="width:187px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:147px;">M660L3</td>
			<td style="width:267px;">emission wavelength &#955;=660 nm, linewidth approximately 20 nm </td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:180px;">LED power supply</td>
			<td style="width:187px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:147px;">LEDD1B</td>
			<td style="width:267px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:180px;">Thread Adapter</td>
			<td style="width:187px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:147px;">SM2T2</td>
			<td style="width:267px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:180px;">Thread Adapter</td>
			<td style="width:187px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:147px;">SM1A2</td>
			<td style="width:267px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:180px;">Frame Grabber board</td>
			<td style="width:187px;">EPIX </td>
			<td style="width:147px;">PIXCI E4 </td>
			<td style="width:267px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:180px;">High-Speed CMOS camera</td>
			<td style="width:187px;">Mikrotron</td>
			<td style="width:147px;">MC-1362</td>
			<td style="width:267px;"> </td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

digital inline holographic microscopy (dihm) of weakly-scattering subjects

كائنات نثر ضعيفة، مثل الجسيمات الغروية الصغيرة ومعظم الخلايا البيولوجية، كثيرا ما واجه في المجهر. في الواقع، تم تطوير مجموعة من التقنيات لتصور أفضل هذه الكائنات المرحلة؛ الطوري ومدينة دبي للإنترنت هي من بين الأساليب الأكثر شعبية لتعزيز التباين. ومع ذلك، وتسجيل موقف والشكل في الاتجاه خارج التصوير الطائرة لا تزال صعبة. يقدم هذا التقرير المنهج التجريبي بسيطة لتحديد دقيق لمكان وهندسة الكائنات في ثلاثة أبعاد، وذلك باستخدام المجهر مضمنة الرقمية الثلاثية الأبعاد (DIHM). بشكل عام، يتم تعريف حجم العينة الوصول إليها عن طريق حجم مستشعر الكاميرا في الاتجاه الجانبي، وتماسك الإضاءة في الاتجاه المحوري. وتتراوح أحجام عينة نموذجية من 200 ميكرون × 200 ميكرون × 200 ميكرون باستخدام الإضاءة LED، ل5 مم × 5 مم × 5 مم أو أكبر باستخدام إضاءة الليزر. يتم تكوين هذا الضوء الإضاءة بحيث موجات الطائرة هي الحادثة على العينة. الكائنات في حجم العينة ثم تبعثر الضوء، والتي تتعارض مع ضوء unscattered لتشكيل أنماط التدخل عمودي على اتجاه الإضاءة. هذه الصورة (الهولوغرام) يحتوي على المعلومات المطلوبة لإعادة الإعمار عمق ثلاثي الأبعاد، ويمكن أن يتم القبض على جهاز التصوير القياسية مثل CMOS أو كاميرا CCD. يعمل على رايلي-سمرفلد طريقة الانتشار مرة أخرى إلى إعادة تركيز عدديا الصور المجهر، والكشف عن مجريات الأمور التصوير البسيط القائم على المرحلة GOUY الشذوذ يستخدم لتحديد نثر الكائنات ضمن حجم أعيد بناؤها. النتائج هذه الطريقة بسيطة ولكنها قوية في لا لبس فيها، خالية من نموذج قياس موقع وشكل الأشياء في عينات مجهرية.

للتدليل على قدرات DIHM، أجريت التجارب على سلسلة من البكتيريا العقدية. سلسلة نفسها قياس 10.5 مم طويل، وكان يتألف من 6-7 خلايا اسطوانية الكروية (اثنين من الخلايا في سلسلة هي قريبة من تقسيم) بأقطار في نطاق 0،6-1 ميكرون. أرقام 1A 1B وتظهر الواجهة الرئيسية إعادة الإعم?...

Watch this Scientific Journal Video about Digital Inline Holographic Microscopy DIHM of Weakly-scattering Subjects at JoVE.com

Digital Inline Holographic Microscopy DIHM of Weakly-scattering Subjects

المواقع الثلاثة الأبعاد للأجسام نثر ضعيفة ويمكن تحديدها بشكل فريد باستخدام مضمنة الرقمية المجهر الثلاثية الأبعاد (DIHM)، والذي ينطوي على تعديلات طفيفة على المجهر القياسية. برنامجنا يستخدم ارشادي التصوير بسيطة إلى جانب رايلي-سمرفلد العودة الانتشار لانتاج موقف ثلاثي الأبعاد والهندسة لكائن المرحلة المجهرية.

الرقمية المضمنة المجسم مجهرية (DIHM) من الموضوعات وكلي نثر

Weakly-scattering objects, such as small colloidal particles and most biological cells, are frequently encountered in microscopy. Indeed, a range of ...

digital-inline-holographic-microscopy-dihm-weakly-scattering

Research

JoVE Journal

Biology

Digital Inline Holographic Microscopy (DIHM) of Weakly-scattering Subjects

12.1K Views.  Harvard University.  المواقع الثلاثة الأبعاد للأجسام نثر ضعيفة ويمكن تحديدها بشكل فريد باستخدام مضمنة الرقمية المجهر الثلاثية الأبعاد (DIHM)، والذي ينطوي على تعديلات طفيفة على المجهر القياسية. برنامجنا يستخدم ارشادي التصوير بسيطة إلى جانب رايلي-سمرفلد العودة ?...

Video: Digital Inline Holographic Microscopy DIHM of Weakly-scattering Subjects

Determining heat and mechanical pain threshold in inflamed skin of human subjects

In a previous article in the Journal of Visualized Experiments we have demonstrated skin microdialysis techniques for the collection of tissue-specific nociceptive and inflammatory biochemicals in humans. In this article we will show pain-testing paradigms that are often used in tandem with microdialysis procedures. Combining pain tests with microdialysis provides the critical link between behavioral and biochemical data that allows identifying key biochemicals responsible for generating and propagating pain.
Two models of evoking pain in inflamed skin of human study participants are shown. The first model evokes pain with aid of heat stimuli. Heat evoked pain as described here is predominantly mediated by small, non-myelinated peripheral nociceptive nerve fibers (C-fibers). The second model evokes pain via punctuated pressure stimuli. Punctuated pressure evoked pain is predominantly mediated by small, myelinated peripheral nociceptive nerve fibers (A-delta fibers). The two models are mechanistically distinct and independently examine nociceptive processing by the two major peripheral nerve fiber populations involved in pain signaling.
Heat pain is evoked with aid of the TSA II, a commercially available thermo-sensory analyzer (Medoc Advanced Medical Systems, Durham, NC). Stimulus configuration and delivery is handled with aid of specific software. Thermodes vary in size and shape but in principle consist of a metal plate that can be heated or cooled at various rates and for different periods of time. Algorithms assessing heat-evoked pain are manifold. In the experiments shown here, study participants are asked to indicate at what point they start experiencing pain while the thermode in contact with skin is heated at a predetermined rate starting at a temperature that does not evoke pain. The thermode temperature at which a subject starts experiencing pain constitutes the heat pain threshold.
Mechanical pain is evoked with punctuated probes. Such probes are commercially available from several manufacturers (von Frey hairs). However, the accuracy of von Frey hairs has been criticized and many investigators use custom made punctuated pressure probes. In the experiments shown here eight custom-made punctuated probes of different weights are applied in consecutive order, a procedure called up-down algorithm, to identify perceptional deflection points, i.e., a change from feeling no pain to feeling pain or vice versa. The average weight causing a perceptional deflection constitutes the mechanical pain threshold.

Algorithms assessing heat and mechanical pain thresholds in experimentally inflamed skin of human study subjects are shown. The two pain testing paradigms independently examine nociceptive processing by the two major peripheral nerve fiber populations transmitting pain, i.e., non-myelinated C fibers and small myelinated A-delta fibers.

تحديد حرارة والميكانيكية عتبة الألم في الجلد ملتهبة من الموضوعات البشرية

In a previous article in the Journal of Visualized Experiments we have demonstrated skin microdialysis techniques for the collection of tissue-specific ...

Digital Microfluidics for Automated Proteomic Processing

Clinical proteomics has emerged as an important new discipline, promising the discovery of biomarkers that will be useful for early diagnosis and prognosis of disease. While clinical proteomic methods vary widely, a common characteristic is the need for (i) extraction of proteins from extremely heterogeneous fluids (i.e. serum, whole blood, etc.) and (ii) extensive biochemical processing prior to analysis. Here, we report a new digital microfluidics (DMF) based method integrating several processing steps used in clinical proteomics. This includes protein extraction, resolubilization, reduction, alkylation and enzymatic digestion. Digital microfluidics is a microscale fluid-handling technique in which nanoliter-microliter sized droplets are manipulated on an open surface. Droplets are positioned on top of an array of electrodes that are coated by a dielectric layer - when an electrical potential is applied to the droplet, charges accumulate on either side of the dielectric. The charges serve as electrostatic handles that can be used to control droplet position, and by biasing a sequence of electrodes in series, droplets can be made to dispense, move, merge, mix, and split on the surface. Therefore, DMF is a natural fit for carrying rapid, sequential, multistep, miniaturized automated biochemical assays. This represents a significant advance over conventional methods (relying on manual pipetting or robots), and has the potential to be a useful new tool in clinical proteomics.
Mais J. Jebrail, Vivienne N. Luk, and Steve C. C. Shih contributed equally to this work.
Sergio L. S. Freire's current address is at the University of the Sciences in Philadelphia located at 600 South 43rd Street, Philadelphia, PA 19104.

Digital Microfluidics is a technique characterized by the manipulation of discrete droplets (~nL - mL) on an array of electrodes by the application of electrical fields. It is well-suited for carrying out rapid, sequential, miniaturized automated biochemical assays. Here, we report a platform capable of automating several proteomic processing steps.

الرقمية على microfluidics لتصنيع البروتين الآلي

Clinical proteomics has emerged as an important new discipline, promising the discovery of biomarkers that will be useful for early diagnosis and ...

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and cellular content. Hallmark events of mitosis, such as chromosome movement, can be readily tracked on an individual cell basis using time-lapse fluorescence microscopy of mammalian cell lines expressing specific GFP-tagged proteins. In combination with RNAi-based depletion, this can be a powerful method for pinpointing the stage(s) of mitosis where defects occur after levels of a particular protein have been lowered. In this protocol, we present a basic method for assessing the effect of depleting a potential mitotic regulatory protein on the timing of mitosis. Cells are transfected with siRNA, placed in a stage-top incubation chamber, and imaged using an automated fluorescence microscope. We describe how to use software to set up a time-lapse experiment, how to process the image sequences to make either still-image montages or movies, and how to quantify and analyze the timing of mitotic stages using a cell-line expressing mCherry-tagged histone H2B. Finally, we discuss important considerations for designing a time-lapse experiment. This strategy is complementary to other approaches and offers the advantages of 1) sensitivity to changes in kinetics that might not be observed when looking at cells as a population and 2) analysis of mitosis without the need to synchronize the cell cycle using drug treatments. The visual information from such imaging experiments not only allows the sub-stages of mitosis to be assessed, but can also provide unexpected insight that would not be apparent from cell cycle analysis by FACS.

Here we describe a basic protocol to image and quantify the mitotic timing of live mammalian tissue culture cells after siRNA transfection.

الوقت الفاصل بين التصوير من الانقسام الميتوزي بعد ترنسفكأيشن سيرنا

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and temporal resolution to study in vivo hematopoiesis using the murine bone marrow transplant experimental model. Genetic combinatorial marking using lentiviral vectors encoding fluorescent proteins (FPs) enabled cell fate mapping through advanced microscopy imaging. Vectors encoding five different FPs: Cerulean, EGFP, Venus, tdTomato, and mCherry were used to concurrently transduce HSPCs, creating a diverse palette of color marked cells. Imaging using confocal/two-photon hybrid microscopy enables simultaneous high resolution assessment of uniquely marked cells and their progeny in conjunction with structural components of the tissues. Volumetric analyses over large areas reveal that spectrally coded HSPC-derived cells can be detected non-invasively in various intact tissues, including the bone marrow (BM), for extensive periods of time following transplantation. Live studies combining video-rate multiphoton and confocal time-lapse imaging in 4D demonstrate the possibility of dynamic cellular and clonal tracking in a quantitative manner.

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

Combinatorial 5 fluorescent proteins marking of hematopoietic stem and progenitor cells allows in vivo clonal tracking via confocal and two-photon microscopy, providing insights into bone marrow hematopoietic architecture during regeneration. This method allows non-invasive fate mapping of spectrally-coded HSPCs-derived cells in intact tissues for extensive periods of time following transplantation.

في الجسم الحي تتبع نسيلي من الخلايا الجذعية المكونة للدم والسلف تميزت خمسة البروتينات الفلورية باستخدام الميكروسكوب متحد البؤر وMultiphoton

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

في فيفو تتبع 4 الأبعاد للالجذعية المكونة للدم والسلف الكبار في خلايا الفأر قبي نخاع العظم

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Simple Bulk Readout of Digital Nucleic Acid Quantification Assays

Digital assays are powerful methods that enable detection of rare cells and counting of individual nucleic acid molecules. However, digital assays are still not routinely applied, due to the cost and specific equipment associated with commercially available methods. Here we present a simplified method for readout of digital droplet assays using a conventional real-time PCR instrument to measure bulk fluorescence of droplet-based digital assays.
We characterize the performance of the bulk readout assay using synthetic droplet mixtures and a droplet digital multiple displacement amplification (MDA) assay. Quantitative MDA particularly benefits from a digital reaction format, but our new method&#160;applies to any digital assay. For established digital assay protocols such as digital PCR, this method serves to speed up and simplify assay readout.
Our bulk readout methodology brings the advantages of partitioned assays without the need for specialized readout instrumentation. The principal limitations of the bulk readout methodology are reduced dynamic range compared with droplet-counting platforms and the need for a standard sample, although the requirements for this standard are less demanding than for a conventional real-time experiment. Quantitative whole genome amplification (WGA) is used to test for contaminants in WGA reactions and is the most sensitive way to detect the presence of DNA fragments with unknown sequences, giving the method great promise in diverse application areas including pharmaceutical quality control and astrobiology.

We describe an endpoint digital assay for quantifying nucleic acids with a simplified (analog) readout. We measure bulk fluorescence of droplet-based digital assays using a standard qPCR machine rather than specialized instrumentation and confirm our results by microscopy.

قراءات السائبة بسيطة الرقمية نوكليك حمض الكمي فحوصات

Digital assays are powerful methods that enable detection of rare cells and counting of individual nucleic acid molecules. However, digital assays are ...

Magnetic-Activated Cell Sorting Strategies to Isolate and Purify Synovial Fluid-Derived Mesenchymal Stem Cells from a Rabbit Model

Mesenchymal stem cells (MSCs) are the main cell source for cell-based therapy. MSCs from articular cavity synovial fluid could potentially be used for cartilage tissue engineering. MSCs from synovial fluid (SF-MSCs) have been considered promising candidates for articular regeneration, and their potential therapeutic benefit has made them an important research topic of late. SF-MSCs from the knee cavity of the New Zealand white rabbit can be employed as an optimized translational model to assess human regenerative medicine. By means of CD90-based magnetic activated cell sorting (MACS) technologies, this protocol successfully obtains rabbit SF-MSCs (rbSF-MSCs) from this rabbit model and further fully demonstrates the MSC phenotype of these cells by inducing them to differentiate to osteoblasts, adipocytes, and chondrocytes. Therefore, this approach can be applied in cell biology research and tissue engineering using simple equipment and procedures.

This article presents a simple and economic protocol for the straightforward isolation and purification of mesenchymal stem cells from New Zealand white rabbit synovial fluid.

مغناطيسية تنشيط الخلية فرز الاستراتيجيات الرامية إلى عزل وتنقية الزليلي المستمدة من سائل الخلايا الجذعية الوسيطة من طراز الأرنب

Mesenchymal stem cells (MSCs) are the main cell source for cell-based therapy. MSCs from articular cavity synovial fluid could potentially be used for ...

Micron-scale Phenotyping Techniques of Maize Vascular Bundles Based on X-ray Microcomputed Tomography

It is necessary to accurately quantify the anatomical structures of maize materials based on high-throughput image analysis techniques. Here, we provide a 'sample preparation protocol' for maize materials (i.e., stem, leaf, and root) suitable for ordinary microcomputed tomography (micro-CT) scanning. Based on high-resolution CT images of maize stem, leaf, and root, we describe two protocols for the phenotypic analysis of vascular bundles: (1) based on the CT image of maize stem and leaf, we developed a specific image analysis pipeline to automatically extract 31 and 33 phenotypic traits of vascular bundles; (2) based on the CT image series of maize root, we set up an image processing scheme for the three-dimensional (3-D) segmentation of metaxylem vessels, and extracted two-dimensional (2-D) and 3-D phenotypic traits, such as volume, surface area of metaxylem vessels, etc. Compared with traditional manual measurement of vascular bundles of maize materials, the proposed protocols significantly improve the efficiency and accuracy of micron-scale phenotypic quantification.

We provide a novel method to improve the X-ray absorption contrast of maize tissue suitable for ordinary microcomputed tomography scanning. Based on CT images, we introduce a set of image-processing workflows for different maize materials to effectively extract microscopic phenotypes of vascular bundles of maize.

تقنيات Phenotyping ميكرون-مقياس الذرة حزم وعائية استناداً إلى التصوير المقطعي بالأشعة السينية ميكروكومبوتيد

It is necessary to accurately quantify the anatomical structures of maize materials based on high-throughput image analysis techniques. Here, we provide a ...

Biological Sample Preparation by High-pressure Freezing, Microwave-assisted Contrast Enhancement, and Minimal Resin Embedding for Volume Imaging

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the imaging modality in a focused ion beam scanning electron microscope (FIB-SEM), which is used to obtain stacks of sequential images for 3D reconstruction and modelling. High-pressure freezing (HPF) allows close to native structural preservation, but the subsequent freeze substitution often does not provide sufficient contrast, especially for a bigger specimen, which is needed for high-quality imaging in the SEM required for 3D reconstruction. Therefore, in this protocol, after the freeze substitution, additional contrasting steps are carried out at room temperature. Although these steps are performed in a microwave, it is also possible to follow traditional bench processing, which requires longer incubation times.The subsequent embedding in minimal amounts of resin allows for faster and more precise targeting and preparation inside the FIB-SEM. This protocol is especially useful for samples that require preparation by high-pressure freezing for a reliable ultrastructural preservation but do not gain enough contrast during the freeze substitution for volume imaging using FIB-SEM. In combination with the minimal resin embedding, this protocol provides an efficient workflow for the acquisition of high-quality volume data.

Here we present a protocol for combining two sample processing techniques, high-pressure freezing and microwave-assisted sample processing, followed by minimal resin embedding for acquiring data with a focused ion beam scanning electron microscope (FIB-SEM). This is demonstrated using a mouse tibial nerve sample and Caenorhabditis elegans.

إعداد العينات البيولوجية بالتجميد ذات الضغط العالي، وتعزيز النقيض ساعدت الموجات الدقيقة، والحد الأدنى راتنج التضمين لتصوير حجم

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the ...

Cryo-Electron Microscopic Grid Preparation for Time-Resolved Studies using a Novel Robotic System, Spotiton

The capture of short-lived molecular states triggered by the early encounter of two or more interacting particles continues to be an experimental challenge of great interest to the field of cryo-electron microscopy (cryo-EM). A few methodological strategies have been developed that support these &#34;time-resolved&#34; studies, one of which, Spotiton-a novel robotic system-combines the dispensing of picoliter-sized sample droplets with precise temporal and spatial control. The time-resolved Spotiton workflow offers a uniquely efficient approach to interrogate early structural rearrangements from minimal sample volume. Fired from independently controlled piezoelectric dispensers, two samples land and rapidly mix on a nanowire EM grid as it plunges toward the cryogen. Potentially hundreds of grids can be prepared in rapid succession from only a few microliters of a sample. Here, a detailed step-by-step protocol of the operation of the Spotiton system is presented with a focus on troubleshooting specific problems that arise during grid preparation.

The protocol presented here describes the use of Spotiton, a novel robotic system, to deliver two samples of interest onto a self-wicking, nanowire grid that mix for a minimum of 90 ms prior to vitrification in liquid cryogen.