Gli autori ringraziano Linda Turner per l&#39;assistenza con la preparazione microbiologica. RZ e LGW sono stati finanziati dall&#39;Istituto Rowland ad Harvard e CGB è stato finanziato come studioso di una Fondazione CAPES, Scienza Senza Frontiere Programma, Brasile (Processo # 7340-11-7)

1. Setup and Data Acquisition <ol><li> Far crescere una cultura di Streptococcus ceppo V4051-197 (nuoto liscio), le cellule in KTY medio da congelato magazzino 22. Incubare in un agitatore rotativo notte a 35 ° C e 150 rpm, a saturazione. </li><li> Inoculare 10 ml di mezzo fresco KTY con 500 microlitri della cultura satura. Incubare per un ulteriore 3,5 ore a 35 ° C e 150 rpm fino a quando le cellule raggiungono una densità ottica di circa 1,0 a λ = 600 nm (circa 5 x 10 8 cellule / ml). </li><li> Diluire 1:400 in mezzi freschi per ottenere la concentrazione finale di cellule mobili. </li><li> Su un vetrino da microscopio, fare un anello di grasso (per esempio da una siringa riempita di vaselina) di circa 1 mm di altezza e una goccia della soluzione campione al centro. Inserire un vetro di copertura sulla parte superiore e premere leggermente ai bordi per sigillare quella che liquido è in contatto sia con vetrino e coprioggetto. La camera del campione risultante dovrebbe essere around 100-200 micron di profondità. </li><li> Posizionare la camera di campione nel microscopio con il vetro di copertura rivolto verso il basso, e con attenzione, per evitare la formazione di bolle d&#39;aria nell&#39;olio tra vetro e lente. </li><li> Fuoco il microscopio sulla superficie inferiore della camera del campione, e portare il condensatore a concentrarsi. </li><li> Spegnere l&#39;illuminazione standard e posizionare la testina LED dietro l&#39;apertura del condensatore del microscopio. Impostare il LED di alimentazione alla massima potenza. </li><li> Chiudere l&#39;apertura del condensatore a sua misura massima e, se necessario, spostare il LED relativo supporto fino a quando l&#39;illuminazione è centrata sul diaframma lente dell&#39;obiettivo. </li><li> Accendere il computer e la macchina fotografica, e reindirizzare tutta la luce alla porta macchina fotografica del microscopio. Regolare il frame rate e la dimensione dell&#39;immagine nel software di acquisizione immagini. </li><li> Rendere il tempo di esposizione telaio il più breve possibile, pur mantenendo un buon contrasto. Controllare un&#39;intensità istogramma dell&#39;immagine per assicurare che l&#39;immagine non è saturated o sottoesposta. </li><li> Se necessario, riorientare il microscopio in modo tale oggetto di interesse è leggermente sfocato (tipicamente del 10-30 micron). L&#39;oggetto e il piano focale dovrebbe essere nello stesso mezzo (cioè il piano focale dovrebbe trovarsi all&#39;interno della camera del campione). </li></ol> 2. Ricostruzione Il primo passo di elaborazione dati è riorientare numericamente un fotogramma video di una serie di diverse profondità, producendo una pila di immagini. Software di facile utilizzo per fare questo possono essere trovate qui: <a href="http://www.rowland.harvard.edu/rjf/wilson/Downloads.html">http://www.rowland.harvard.edu/rjf/wilson/Downloads.html</a> insieme a esempio immagini (acquisite utilizzando un microscopio invertito, e una immersione in olio lente obiettivo 60X) e un file di scena per il raggio tracciato rendering. <ol><li> Inserire il telaio di interesse e rispettiva background come file immagine separati, nelle caselle relative sull&#39;interfaccia. Una immagine di sfondo è una cornice che fAirly rappresenta lo sfondo del video, in assenza dell&#39;ologramma, e verrà utilizzato per sopprimere qualsiasi rumore schema fisso che potrebbe interferire con la localizzazione ologramma e analisi. </li><li> Inserire i valori nelle caselle di impostazioni globali sul lato sinistro dello schermo prima di eseguire il programma. I primi tre sono i parametri dello stack di uscita: la posizione assiale del primo telaio (&#39;Start focus&#39;), numero di strati dello stack ricostruita (&#39;Numero di passi&#39;); distanza assiale tra ogni fetta dello stack (&#39;Step size&#39;) . </li><li> Per ricostruire oggetti con le giuste proporzioni, la dimensione del passo dovrebbe essere la stessa dimensione della spaziatura tra pixel laterale. Immettere la frequenza di campionamento laterale della fotocamera (spaziatura 1/pixel) nella casella &#39;Pixel / micron&#39;, la lunghezza d&#39;onda illuminazione e indice di rifrazione medio negli ultimi due caselle. Valori di default del programma sono appropriate per ricostruire i dati di esempio. </li><li> Premere il tasto &#39;Flip Z-gradient&#39; se il centro del object è scuro in ologramma (vedi esempio telaio 2005 e la sezione di discussione per maggiori dettagli). </li><li> Controllare il filtro passa-banda sullo stato / off (di default è on). Questo filtro passabanda opzionale, situata in una scatola sotto l&#39;interruttore gradiente-flip, è responsabile per la soppressione del contributo di pixel rumorosi. Il filtro passa-banda è applicato ad ogni fetta immagine immediatamente dopo generazione. </li><li> Controllare l&#39;interruttore di uscita intermedia stati on / off (di default è on). Fasi di analisi intermedia sono scritti in due video in uscita, come non compresso file avi:. Il primo è lo stack riorientato (nome file che termina in &#39;_stack.avi&#39;), il secondo è lo stack dopo l&#39;operazione gradiente assiale (nome file che termina in &#39; _gradient.avi &#39;). Idealmente, questo secondo pila conterrà l&#39;oggetto di interesse ha evidenziato come un oggetto luminoso su uno sfondo scuro. </li><li> Dopo aver impostato tutti i parametri, premere &#39;Run&#39; nella finestra principale. La cornice selezionata viene visualizzata nel riquadro principale del software. </li><li> Utilizzare l&#39;ingrandimento strumento di vetro trovato nella barra degli strumenti a sinistra l&#39;immagine per ingrandire (click sinistro) e zoom out (Shift + click sinistro). Utilizzare lo strumento rettangolo sulla barra degli strumenti per selezionare una regione di interesse (ROI). Cattura il maggior numero di frange del ologramma possibile all&#39;interno del rettangolo, in modo da ottimizzare la ricostruzione. </li><li> Premere il tasto &#39;Processo&#39; per generare i due stack di immagine. Ispezionare le pile risultanti utilizzando ImageJ (che può essere ottenuto gratuitamente presso <a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/">http://rsb.info.nih.gov/ij/</a> ). Se l&#39;oggetto di interesse può essere chiaramente visto nella pila di immagini gradiente, procedere al passaggio successivo per estrarre le coordinate dell&#39;oggetto. </li></ol> 3. Rendering <ol><li> Oltre telaio rifocalizzazione, questo programma può individuare la x, y, z coordinate per ogni voxel in oggetto di interesse. Premere il pulsante &#39;Feature Extraction&#39; per abilitare questa funzione. </li><li> Immettere un percorso, inclusa l&#39;estensione (per esempio: c: home output.inc), per ilUscita coordinate file. Selezionare &#39;stile POV-Ray&#39; nella casella &#39;stile coordinata di uscita&#39;. Questo fa sì che il programma di scrivere un file oggetto che può essere visualizzato utilizzando il pacchetto software raytracing libero POV-Ray (che può essere ottenuto da <a href="http://www.povray.org/">http://www.povray.org/</a> ). </li><li> Rielaborare le immagini come al precedente punto 2. Il programma fornirà una serie di (x, y, z) coordina nel ROI selezionata, scritto nel nome del file nella &#39;uscita coordinate&#39; box. Estrazione di coordinate dell&#39;oggetto richiede molto più tempo rispetto alla generazione stack. </li><li> Assicurarsi che il file POV-Ray campione (fornito con il codice ricostruzione) si trova nella stessa cartella il file delle coordinate appena generati. Modificare il file pov di esempio. E sostituire il nome del file tra virgolette sulla linea # Include &quot;MYFILE.inc&quot; , con il nome del file di dati generati dalla ricostruzione del codice. </li><li> Fare clic sul pulsante &#39;Esegui&#39; in POV-Ray per il rendering di un&#39;immagine bitmap. Tegli posizione della telecamera, l&#39;illuminazione e le opzioni di texture sono solo alcune delle personalizzazioni possibili in POV-Ray, vedere la documentazione in linea per i dettagli. </li></ol>

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Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

Il passo più importante in questo protocollo sperimentale è la cattura accurata di immagini da un setup sperimentale stabile. Con scarsi dati di base, ad alta ricostruzione fedeltà è quasi impossibile. E &#39;anche importante evitare lenti dell&#39;obiettivo con un elemento di contrasto di fase interna (visibile come un anello scuro quando guardando attraverso il posteriore dell&#39;obiettivo), in quanto questo può degradare l&#39;immagine ricostruita. L&#39;oggetto di interesse deve essere sufficientemente lontana...

Linea digitale microscopia olografica (DIHM) permette veloce l&#39;imaging tridimensionale di campioni microscopici, quali microrganismi nuoto 1,2 e sistemi di materia morbidi 3,4, con modifiche minime a una configurazione microscopio standard. In questo documento viene fornita una dimostrazione pedagogica di DIHM, incentrata su software sviluppato nel nostro laboratorio. Questo documento contiene una descrizione di come impostare il microscopio, ottimizzare l&#39;acquisizione dei dati, ed elaborare le immagini registrate per ricostruire i dati tridimensionali. Il software (basato in parte su software sviluppato dalla DG Grier e altri 5) e immagini di esempio sono disponibili gratuitamente sul nostro sito web. Fornire una descrizione dei passaggi necessari per configurare il microscopio, ricostruire i volumi tridimensionali da ologrammi e rendere i volumi risultanti di interesse utilizzando un raggio gratuito tracing pacchetto software. L&#39;articolo si conclude con una discussione di fattori che incidono sulla qualità della ricostruzione, E un confronto di DIHM con metodi concorrenti. Anche se DIHM stato descritto qualche tempo fa (per una revisione generale dei suoi principi e sviluppo, vedi Kim 6), la potenza di calcolo necessaria e la competenza di elaborazione delle immagini hanno sinora in gran parte limitato l&#39;uso di gruppi di ricerca specializzati con una particolare attenzione allo sviluppo dello strumento. Questa situazione sta cambiando alla luce dei recenti progressi nella tecnologia informatica e fotocamera. Computer desktop moderni possono facilmente far fronte con la trasformazione e sui requisiti di archiviazione dati; telecamere CCD o CMOS sono presenti nella maggior parte dei laboratori di microscopia e del software necessario è effettuata liberamente disponibile su internet da gruppi che hanno investito tempo nello sviluppo della tecnica. Vari sistemi sono stati proposti per l&#39;imaging la configurazione di oggetti microscopici in un volume di campione tridimensionale. Molti di questi sono tecniche di scansione 7,8, in cui una pila di immagini viene registrata dalla mechanically tradurre il piano dell&#39;immagine attraverso il campione. Confocale a scansione microscopia a fluorescenza è forse l&#39;esempio più familiare. Tipicamente, un colorante fluorescente viene aggiunto a un oggetto fase per raggiungere un livello accettabile di contrasto campione, e la disposizione confocale utilizzato per localizzare spazialmente emissione fluorescente. Questo metodo ha portato a progressi significativi, per esempio nel campo della scienza colloidale in cui è consentito l&#39;accesso alla dinamica tridimensionale di sistemi affollati 9-11. L&#39;uso di etichettatura è una differenza importante tra la microscopia confocale e DIHM, ma le altre caratteristiche delle due tecniche sono paragonabili. DIHM ha un vantaggio significativo in velocità che l&#39;apparecchio ha parti in movimento. Gli specchi a scansione meccanica in sistemi confocale pongono un limite superiore sul tasso di acquisizione dei dati - in genere circa 30 fotogrammi / sec per immagine pixel a 512 x 512. Una pila di tali immagini da diversi piani focali può essere ottenuta con fisicamente transldall&#39;uso della fase del campione o lente obiettivo tra i fotogrammi, portando ad una velocità di acquisizione finale di circa un volume al secondo per uno stack frame 30. In confronto, un sistema olografico basato su una moderna fotocamera CMOS in grado di catturare 2.000 fotogrammi / sec con le stesse dimensioni e la risoluzione dell&#39;immagine, ogni fotogramma viene elaborato `in linea &#39;per dare uno snapshot indipendente dal volume del campione. Per ribadire: campioni fluorescenti non sono richiesti per DIHM, anche se un sistema è stato sviluppato che esegue la ricostruzione olografica di un soggetto fluorescente 12. Nonché informazioni sul volume tridimensionale, DIHM può anche essere utilizzato per fornire immagini a contrasto di fase quantitative 13, ma che non rientra nell&#39;ambito della discussione qui. Immagini di dati Raw DIHM sono bidimensionali, e per certi aspetti sembrano immagini al microscopio normali, anche se fuori fuoco. La differenza principale tra DIHM e microscopia a campo luminoso norma risiede negli anelli di diffrazione che circondano oggetti in il campo visivo; questi sono a causa della natura della illuminazione. DIHM richiede una fonte più coerente del campo luminoso - tipicamente un LED o laser. Gli anelli di diffrazione nell&#39;ologramma contengono le informazioni necessarie per ricostruire una immagine tridimensionale. Ci sono due approcci principali per l&#39;interpretazione dei dati DIHM; rifocalizzazione montaggio e numerica diretta. Il primo approccio è applicabile nei casi in cui la forma matematica del modello di diffrazione è noto in anticipo 3,4; questa condizione è soddisfatta da una piccola manciata di oggetti semplici come sfere, cilindri, e ostacoli mezzo aereo. Raccordo diretto si applica anche nei casi in cui la posizione assiale dell&#39;oggetto è noto, e l&#39;immagine può essere montato utilizzando una tabella di look-up di modelli di immagini 14. Il secondo approccio (rifocalizzazione numerico) è invece più generale e si basa sull&#39;utilizzo degli anelli di diffrazione dell&#39;immagine ologramma bidimensionale a ricostruire numericamente il campo otticoun numero di (arbitrariamente distanziati) piani focali in tutto il volume del campione. Esistono diversi metodi correlati per fare questo 6; questo lavoro utilizza il Rayleigh-Sommerfeld indietro tecnica di propagazione come descritto da Lee e Grier 5. L&#39;esito di questa procedura è una pila di immagini che riproducono l&#39;effetto di modificare manualmente il piano focale del microscopio (da qui il nome `rifocalizzazione numerica &#39;). Una volta che è stata generata una pila di immagini, la posizione del soggetto nel volume focale deve essere ottenuta. Una serie di euristica di analisi delle immagini, come ad esempio la varianza intensità locale o contenuto di frequenza spaziale, sono stati presentati per quantificare la nitidezza di messa a fuoco in diversi punti del campione 15. In ogni caso, quando una particolare metrica immagine è ingrandita (o minimizzata), l&#39;oggetto è considerato a fuoco. A differenza di altri programmi che cercano di identificare un piano focale particolare se un oggetto è &#39;a fuoco&#39;, il metodo in questo lavoro individua points che si trovano dentro l&#39;oggetto di interesse, che possono giungere attraverso una vasta gamma di piani focali. Questo approccio si applica ad una vasta gamma di argomenti ed è particolarmente adatto per estesi, campioni debolmente-Scattering (oggetti fase), come colloidi astiformi, catene di batteri o flagelli eucariotici. In tali campioni il contrasto dell&#39;immagine cambia quando l&#39;oggetto passa attraverso il piano focale; un&#39;immagine sfocata ha un centro luce se l&#39;oggetto è su un lato del piano focale e un centro scuro se è dall&#39;altra. Oggetti pura fase hanno poco o nessun contrasto quando esse si trovino esattamente nel piano focale. Questo fenomeno di inversione contrasto è stato discusso da altri autori 16,17 ed è infine dovuto alla fase Gouy anomalia 18. Questo è stato introdotto in forma più rigorosa nel contesto di olografia altrove, dove vengono valutati i limiti della tecnica, la tipica incertezza in posizione è dell&#39;ordine di 150 nm (circa un pixel) in EACh direzione 19. Il metodo della fase anomalia Gouy è uno dei pochi regimi DIHM ben definiti per determinare la struttura di oggetti estesi in tre dimensioni, ma comunque alcuni oggetti sono problematici per ricostruire. Gli oggetti che si trovano direttamente lungo l&#39;asse ottico (indicando la telecamera) sono difficili da ricostruire con precisione, incertezze nella lunghezza e la posizione dell&#39;oggetto diventano grandi. Questa limitazione è in parte dovuta alla profondità bit ristretta dei pixel di registrazione dell&#39;ologramma (il numero di livelli di grigio distinti che la fotocamera può registrare). Un&#39;altra configurazione problematica si verifica quando l&#39;oggetto di interesse è molto vicino al piano focale. In questo caso, le immagini reali e virtuali dell&#39;oggetto sono ricostruiti in prossimità, dando luogo a campi ottici complessi che sono difficili da interpretare. Un secondo, leggermente meno importante preoccupazione qui è che le frange di diffrazione risultanti occupano meno del sensore di immagine, e questo inf grossolana graniormazione porta ad una ricostruzione più povera qualità. In pratica, un filtro gradiente semplice viene applicato ai volumi ricostruiti tridimensionali per rilevare forti inversioni intensità lungo la direzione di illuminazione. Regioni dove l&#39;intensità cambia rapidamente dal chiaro allo scuro, o viceversa, vengono quindi associati con le regioni di scattering. Oggetti debolmente di scattering sono ben descritti come una collezione non interagenti di tali elementi 20, questi contributi individuali somma per dare il campo diffuso totale che è facilmente invertita utilizzando il retro metodo di propagazione di Rayleigh-Sommerfeld. In questo lavoro, l&#39;intensità tecnica gradiente assiale viene applicato a una catena di cellule Streptococcus. I corpi cellulari sono oggetti di fase (la specie E. coli ha un indice di rifrazione misurato 21 per essere 1.384 alla lunghezza d&#39;onda λ = 589 nm; ceppo Streptococcus è probabilmente simili) e appaiono come una catena ad alta intensità di blob collegati in thè stata applicata e volume del campione dopo il filtro gradiente. Soglia e includono metodi di estrazione standard applicati a questo volume filtrato consentono l&#39;estrazione di pixel volumetrici (voxel) corrispondenti alla regione all&#39;interno delle cellule. Un particolare vantaggio di questo metodo è che permette la ricostruzione non ambigua di posizione di un oggetto in direzione assiale. Metodi simili (almeno, quelli che registrano ologrammi vicino all&#39;oggetto, impressi attraverso un obiettivo microscopio) soffrono di essere in grado di determinare il segno di questo spostamento. Anche se il metodo di ricostruzione Rayleigh-Sommerfeld è anche l&#39;accesso indipendente in questo senso, l&#39;operazione di sfumatura permette di discriminare tra oggetti deboli fase sopra e sotto il piano focale.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="780">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;width:180px;">Nikon Eclipse Ti-E inverted microscope</td>
			<td style="width:187px;">Nikon Corp.</td>
			<td style="width:147px;"> </td>
			<td style="width:267px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;width:180px;">LED</td>
			<td style="width:187px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:147px;">M660L3</td>
			<td style="width:267px;">emission wavelength &#955;=660 nm, linewidth approximately 20 nm </td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:180px;">LED power supply</td>
			<td style="width:187px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:147px;">LEDD1B</td>
			<td style="width:267px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:180px;">Thread Adapter</td>
			<td style="width:187px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:147px;">SM2T2</td>
			<td style="width:267px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:180px;">Thread Adapter</td>
			<td style="width:187px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:147px;">SM1A2</td>
			<td style="width:267px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:180px;">Frame Grabber board</td>
			<td style="width:187px;">EPIX </td>
			<td style="width:147px;">PIXCI E4 </td>
			<td style="width:267px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:180px;">High-Speed CMOS camera</td>
			<td style="width:187px;">Mikrotron</td>
			<td style="width:147px;">MC-1362</td>
			<td style="width:267px;"> </td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

digital inline holographic microscopy (dihm) of weakly-scattering subjects

Oggetti debolmente di scattering, come piccole particelle colloidali e la maggior parte delle cellule biologiche, si incontrano spesso in microscopia. Infatti, una serie di tecniche sono state sviluppate per visualizzare meglio questi oggetti di fase; contrasto di fase e DIC sono tra i metodi più diffusi per migliorare il contrasto. Tuttavia, la posizione di registrazione e la forma in direzione out-of-imaging-plane rimane difficile. Questa relazione introduce un semplice metodo sperimentale per determinare con precisione la posizione e la geometria di oggetti in tre dimensioni, utilizzando la microscopia olografica digitale inline (DIHM). In generale, il volume del campione accessibile è definita dalla dimensione del sensore telecamera nella direzione laterale, e la coerenza illuminazione nella direzione assiale. Volumi di campione tipiche vanno da 200 micron x 200 micron x 200 micron con illuminazione a LED, per5 millimetri x 5 mm x 5 mm o superiore in illuminazione laser. Questa luce di illuminazione è configurato in modo che le onde piane sono incidenti sul campione. Oggetti nel volume del campione poi diffondono la luce, che interferisce con la luce unscattered per formare modelli di interferenza perpendicolare alla direzione di illuminazione. Questa immagine (l&#39;ologramma) contiene le informazioni profondità richiesta per ricostruzione tridimensionale, e può essere catturata su un dispositivo di imaging quali uno CMOS o CCD. Il metodo Back Propagation Rayleigh-Sommerfeld è impiegato per rifocalizzare numericamente immagini al microscopio, e una semplice euristica di imaging basata sulla fase Gouy anomalia viene utilizzato per identificare spargendo oggetti all&#39;interno del volume ricostruito. Questo metodo semplice e robusto risulta in un, misura univoca senza modello della posizione e forma degli oggetti in campioni microscopici.

Per dimostrare le capacità di DIHM, esperimenti sono stati eseguiti su una catena di batteri Streptococcus. La catena stessa misurato 10,5 millimetri lungo, ed era composta di 6-7 cellule sferico cilindrico (due delle cellule della catena sono vicini a dividere) con diametri nell&#39;intervallo 0,6-1 micron. Figure 1a e 1b mostrano l&#39;interfaccia principale della ricostruzione e del software di rendering. Esempi del procedimento rifocalizzazione numerico si vedono nella <st...

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Digital Inline Holographic Microscopy DIHM of Weakly-scattering Subjects

Le posizioni tridimensionali di oggetti debolmente scattering possono essere identificati univocamente tramite linea digitale microscopia olografica (DIHM), che comporta una modifica minore ad un microscopio standard. Il nostro software utilizza un semplice euristica di imaging accoppiato con Rayleigh-Sommerfeld back-propagation cedere la posizione tridimensionale e la geometria di un oggetto fase microscopico.

Digital Inline Holographic Microscopy (DIHM) dei soggetti debolmente di scattering

Weakly-scattering objects, such as small colloidal particles and most biological cells, are frequently encountered in microscopy. Indeed, a range of ...

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JoVE Journal

Biology

Digital Inline Holographic Microscopy (DIHM) of Weakly-scattering Subjects

12.1K Views.  Harvard University.  Le posizioni tridimensionali di oggetti debolmente scattering possono essere identificati univocamente tramite linea digitale microscopia olografica (DIHM), che comporta una modifica minore ad un microscopio standard. Il nostro software utilizza un semplice euristica di imaging accoppiato con Rayleigh-Sommerfeld back-propagation cedere la posizione tridimensionale e la geometria di un oggetto fase microscopico. 