Esta es una demostración de un método simple para la expresión, extracción y purificación de IgG humano recombinante fusionado con la GFP en plantas Nicotiana benthamiana relacionadas con el tabaco. Este protocolo se puede utilizar para la purificación y visualización de anticuerpos producidos por plantas, fusiones de anticuerpos y la mayoría de las proteínas que se pueden purificar a través de la cromatografía de columna. Este protocolo permite a investigadores y estudiantes de laboratorios de trabajo universitarios visualizar proteínas etiquetadas por GFP en la mayoría de los pasos del proceso de producción de proteínas.
Coloque los pellets de turba de tierra en una bandeja y vierta previamente hervido, agua todavía caliente sobre los pellets de turba para una expansión completa. Los pellets tardarán unos minutos en expandirse por completo. Después de que los palets se expandan por completo, coloque de dos a tres semillas de Nicotiana benthamiana en cada pellet de turba utilizando pinzas.
Después de esto, tendrá que verter alrededor de 0,5 pulgadas de agua para cubrir la parte inferior de la bandeja. No olvide etiquetar la bandeja con la fecha de siembra. Continúe regando las plántulas diariamente con cantidades apropiadas de fertilizante.
La bandeja debe cubrirse con una tapa de humidomo y colocarla en una cámara de crecimiento. El pellet de turba de semillas debe mantenerse en la cámara de crecimiento de 23 a 25 grados Celsius con un período fotográfico de 16 horas y 60% de humedad relativa. Después de una semana, retire una planta extra del pellet dejando cada palé de turba con una sola plántula.
Cuando las plantas tienen de dos a tres semanas de edad, transfiera cada pellet de turba a una maceta individual que contenga suelo controlado por humedad. Continúe regando las plántulas diariamente con un litro por litro de fertilizante, nunca deje el suelo completamente seco. Las plantas están listas para la infiltración cuando tienen cinco a seis semanas de edad.
Los siguientes pasos deben realizarse junto a un quemador Bunsen y se deben aplicar técnicas asépticas básicas para evitar la contaminación. Necesitarás una placa de kanamicina Lb. Concentración de kanamicina de un microgramo por mililitro.
estricto con dos mutaciones EHA105 que alberga su construcción resistente a la kanamicina deseada y se cultiva de la noche a la mañana. EHA105 es una de las cepas más utilizadas de Agrobacterium dos mutaciones. Para comenzar el cultivo, llenar el tubo cónico con 10 mililitros de medios de libra, a continuación, a 10 microlitros de 100 microgramos por mililitrormicina, también se pueden añadir 10 microlitros de 2,5 microgramos por mililitro de rifampicina para evitar la contaminación por e-coli.
Desde la placa, utilizará una sola colonia aislada verificada por PCR para hacer crecer su nueva cultura. Elige tu colonia aislada e inocula en la libra. Coloque la inoculación en la coctelera.
incubar a 30 grados centígrados y 120 a 150 RPM durante la noche. Al día siguiente, si la cultura Agrobacterium se atrae a OD600 igual a 0.6 a 0.9 se puede utilizar para la infiltración. Si está cubierto OD600 por encima de uno de uno a dos mililitros deben ser transferidos a una libra fresca con antibióticos y crecidos a la OD600 requerida.
Una vez en el OD600 apropiado colocar las culturas en una centrífuga, asegurándose de que la centrífuga está equilibrada. Pelar las bacterias por centrifugación a 4, 500G durante 20 minutos a temperatura ambiente. No pueden superncarse de ambas muestras.
A continuación, resuspender cada pellet y un búfer de infiltración X para llevar el OD final a 0.4. Combine volúmenes iguales de cada construcción de fusión IgG con la construcción de la cadena ligera, para obtener el OD final de 0,2 por construcción en cada tubo. Tome un clip de papel y una planta de cinco a seis semanas de edad y benthamiana del primer paso.
Usando el borde afilado del clip de papel desplegado hacer una pequeña punción en la primera capa epidérmica de la hoja. Evite perforar la hoja hasta el final. Llene una jeringa de mililitro sin una aguja unida con la solución de Agrobacterium preparada del paso dos.
Cubra el orificio realizado en el paso anterior con el extremo de la jeringa. Y empuje lentamente para inyectar las bacterias en la hoja mientras se aplica una suave contrapresión desde detrás de la hoja. Trate de infiltrarse en la mayor parte de la hoja y pinchar la hoja un máximo de tres a cuatro veces, el exceso de daño de la hoja puede obstaculizar el rendimiento proteico.
Observe cómo la hoja se oscurece mientras se inyecta la solución sin aplicar demasiada presión sobre la jeringa. La hoja de la planta infiltrada aparecerá en su mayoría oscura desde la vista inferior. Tenga en cuenta que esta solución bacteriana debe ser suficiente para al menos tres a cuatro plantas por construcción.
Autoclave cualquier solución bacteriana restante antes de desecharla. Después de haber terminado la infiltración sin aguja, coloque las plantas de nuevo en la cámara de crecimiento y continúe regando diariamente. Observó las hojas para la clorosis, necrosis, así como para la fluorescencia GFP, invierno largo y lámpara UV de onda corta.
Por lo general, las hojas en los días cuatro y cinco muestran la fluorescencia GFP más alta. Cosecha todas las hojas a los cuatro a cinco días después de la infiltración y pesa la cantidad total de material de la hoja. Puede utilizar el material de la hoja inmediatamente para el procesamiento aguas abajo, o puede congelarlo en 80 grados Celsius negativos hasta que esté listo para usar Coloque las plantas infiltradas de nuevo en la cámara de crecimiento y continúe regando diariamente.
observó las hojas de clorosis, necrosis, cambios en el color y la muerte del tejido de las hojas en áreas infiltradas. Plantas observadas para la fluorescencia de la GFP. Si GFP está presente bajo una lámpara UV de onda larga y corta.
La expresión de proteínas aumenta con el tiempo, con la fluorescencia más alta de ambas construcciones de GFP que generalmente ocurren entre los días cuatro y cinco. Cosecha todas las hojas a los cuatro a cinco días después de la infiltración y pesa el material total de la hoja. Utilícelo inmediatamente para procesos posteriores o congele a 80 grados Celsius negativos hasta que esté listo para usar.
Durante el proceso de mezcla, asegúrese de mantener los tampones y las tazas de la licuadora en hielo o a cuatro grados centígrados antes de usarlos. Coloque el tejido vegetal del paso cuatro en la taza de la licuadora previa al juicio. En el tampón de extracción refrigerado que contiene las respectivas concentraciones de PMSF y ascorbato sódico a la taza de la licuadora.
Coloque la taza de la licuadora en la licuadora, tome una hoja precortado de para film y estírela sobre la parte superior de la taza de la licuadora. Mezcle el tejido de la hoja con el tampón de extracción para imaginar 80 con intervalos 22. Tendrás que agitar bien entre ciclos de mezcla según sea necesario.
La mezcla debe parecer homogénea sin trozos de material de hoja. Transfiera material mezclado a un vaso de precipitados. En una barra de agitación y revuelva durante cuatro grados Centígrados durante 30 minutos para mejorar la solubilidad proteica y permitir la precipitación de sólidos.
Coloque dos capas de tela desnuda sobre un vaso limpio sobre hielo y vierta el extracto a través de él para eliminar los restos de hojas grandes. Después de todo el extracto se vierte a través del paño del espejo doblar el paño del espejo para apretar el extracto de hoja residual. El extracto debe aparecer de color verde oscuro sin partículas visibles.
Transfiera el extracto a tubos centrífugos. Centrifugar el extracto a 16.000G durante 20 minutos a cuatro grados centígrados. Esto va a peletizar cualquier material insoluble restante.
Asegúrese de que ambos tubos estén equilibrados y de que la tapa del rotor esté bien apretada. Después de la centrifugación, el pellet debe ser visible, decir sobrenadante y desechar el pellet. Filtrar el sobrenadante utilizando una jeringa de 50 mililitros y un filtro de fibra de vidrio.
Recoger 50 microlitros de una muestra y etiquetar extracto crudo para su posterior análisis. Configure una columna de polipropileno que contiene 20 mililitros de muestra. Estimar la cantidad de lodos necesarios dependiendo del tipo de inmunoglobulina objetivo y su afinidad con la resina.
En esta demostración, usamos tres mililitros de purines. Generalmente tres mililitros de lodo total con 1,5 mililitros de volumen de lecho es eficiente para la purificación de varios miligramos de anticuerpo. Pipetee cuidadosamente la cantidad necesaria de lodos resuspendidos en la columna tapada.
Abra la salida de columna desde la parte inferior de la columna y permita que drene hasta que la mayor parte del búfer haya desaparecido. Verter inmediatamente 10 mililitros de tampón de lavado una vez PBS en la parte superior. Deje que drene y repita este paso de lavado dos veces.
Aplique la muestra filtrada del paso cinco a la columna y recoja el flujo a través. Aliquot 50 microlitros de flujo a través para su posterior análisis. Guarde el resto del flujo a través en caso de que el anticuerpo no se uniera a la resina.
Lave la resina dos veces con 10 mililitros de una vez PBS para reducir la unión no específica. Si se desea, aliquot 50 microlitros de lavado a medida que el tampón drena a través de la columna para verificar que el anticuerpo objetivo no se alude con un tampón de lavado. Mientras el tampón de lavado atraviesa la resina, configure y etiquete cinco tubos de micro centrífuga con 125 microlitros de estériles, un tris-HCL molar a pH ocho para neutralizar el tampón de elución.
Alternativamente, agregue 30 microlitros de dos bases de tris molares para obtener un eluido más concentrado. Durante la elución, se puede utilizar luz UV para la visualización. Esto no necesita hacerse durante la duración de la elución.
Si se está utilizando UV, asegúrese de usar un equipo de protección personal adecuado para evitar daños en los ojos y la piel. No es necesario utilizar una luz UV durante el paso de elución. Eluir los anticuerpos mediante la aplicación de cinco mililitros de tampón de elución a la columna y recoger fracciones de mililitro, a cada tubo designado del paso anterior.
Regenere inmediatamente la columna aplicando 20 mililitros seguidos de 10 mililitros de tampón de lavado. Asegúrese de que la resina no se deja en un ambiente ácido durante un período prolongado de tiempo. La elución debe parecer fluorescente.
A menudo se observa la fluorescencia más alta en la segunda elución, pero puede variar de la extracción a la extracción. Para el almacenamiento, lave la resina con 10 mililitros de 20% de etanol y PBS y deje drenar hasta la mitad. Recapitula la parte superior, luego la parte inferior de la columna y manténgase erguida a cuatro grados C.Determine la concentración de anticuerpos utilizando un espectrómetro de foto midiendo la absorbancia a 280 nanómetros.
Almacene los eluidos en 80 grados Celsius negativos y aliquot 50 microlitros de cada fracción a un tubo separado para su posterior análisis. Generalmente, las duraciones proteicas se pueden reutilizar hasta 10 veces sin pérdida significativa de eficiencia. Consulte las directrices del fabricante para obtener detalles específicos para determinar la concentración de anticuerpos, utilizando un espectrofotómetro midiendo la absorbancia a 280 nanómetros.
Almacene los eluidos en menos 80 grados Celsius y aliquot 50 microlitros de cada fracción en un tubo separado para su posterior análisis. El análisis de la proteína purificada por la página Zs se puede hacer siguiendo los protocolos estándar. Fluorescencia observada como resultado que indica el éxito de la clonación, infiltración y expresión de una construcción que contiene GFP.
En el transcurso de unos días, los fluorescentes deben aumentar progresivamente con alta fluorescencia en los días cuatro y cinco. Cuando se utiliza la proteína G, la unión a proteínas fluorescentes y la elución posterior de la columna indica la purificación de una fusión IgG que contiene como una GFP estable. Y el gel expuesto a los rayos UV, se pueden ver sólo las bandas 25KDa y 75KDa de la escalera.
También se puede ver, la muestra de elución no reducida 2. La elución no reducida conserva su fluorescencia como el tamaño relativo que uno esperaría de un IgG intacto como su fusión GFP estable. En el gel de tinción coomassie se visualizan tanto las muestras reducidas como las no reducidas.
Todos los componentes de la escalera son visibles, las proteínas nativas y las fusiones IgG se pueden ver en el sobrenadante total de extractos y fluyen a través de muestras. El lavado contiene una pequeña cantidad de fusión IgG. Elución uno y cuatro contenían proteína menos concentrada como se espera, ya que la mayoría de las proteínas generalmente ha eludido de la segunda y tercera medidas de elución.
Elution 2 non reduce también se puede ver que existen múltiples bandas en todas las muestras de elución reductoras. 75KDa indica un fusible de cadena pesada a GFP. 50KDa indica una cadena pesada solo, 25KDa indica una cadena ligera sola, y 10 KDA probablemente indica degradación que se puede prevenir mediante la adición de inhibidores de la proteasa.
Este protocolo se puede utilizar para la purificación de cualquier anticuerpo fusionado con cualquier proteína diana deseada. El proceso se puede editar para acomodar varias cantidades de material de hoja, y también permite la determinación visual de la presencia de proteínas antes, durante y después de la conclusión de los procesos de extracción y purificación de proteínas. Estos métodos pueden ser útiles como controles y pueden ser propósito para las técnicas de enseñanza.
