Los autores desean agradecer al Dr. Douglas Goetz (Departamento de Ingeniería Química y Biomolecular de la Universidad de Ohio) y el Dr. Fabian Benencia (Departamento de Ciencias Biomédicas de la Universidad de Ohio) para discusiones interesantes y revisión del manuscrito. También agradecemos al Dr. Christopher Huppenbauer para discusiones técnicas útiles (W. Nuhsbaum Inc.). Este trabajo fue apoyado por becas de la Fundación Nacional de Ciencia (CBET-1106118) y los Institutos Nacionales de Salud (1R15CA161830-01).

1. Instalación del software <ol><li> Compra StreamPix 5 Software multi-cámara con el módulo SimulPix u otro software de imagen capaz de recoger y combinar las imágenes captadas por las cámaras CCD monocromo. </li><li> Requisitos mínimos para StreamPix 5 incluyen: un PC equipado con Core 2 Duo con 2.4 GHz o superior con 2 GB de RAM o superior. Una cámara digital o analógico IEEE apoyado y capturadora compatible. Ventanas XP/7/Vista 32 o 64 bits. Un monitor de apoyo a la resolución 1024 x 768 o superior. (Se recomienda la OCU expresar 16x o superior) Un adaptador gráfico con un buen rendimiento en 2D y 7.200 rpm unidad de disco duro para la grabación con la configuración de RAID-O. </li></ol> 2. La instalación del sistema de cámara dual Capaz de dos tiempos de Real Color simultánea de imágenes <ol><li> Conecte el divisor DC2 Fotometría de emisión, o un dispositivo de doble cámara de separación de emisiones similar al microscopio deslizando el adaptador DC2 montaje C en el puerto de vídeo de la microscope de tal manera que la carcasa de la dicroico en el dispositivo es accesible. </li><li> Inserte dos cámaras CCD monocromo en hembra de montura C 1 y C hembra de montaje 2. Cámaras idénticas son preferibles. Cámaras similares pueden ser utilizados, pero la compatibilidad depende de hardware interno, lo más importante es el sensor de imagen CCD. </li><li> Utilice el software de imágenes para mostrar las imágenes de ambas cámaras. Los pasos siguientes (2.3.1 - 2.3.4) se aplican a StreamPix 5 con el módulo SimulPix y deben ser adaptados para otras aplicaciones de imagen multi-cámara. <ol><li> Abrir StreamPix 5 y seleccione &quot;espacio de trabajo&quot; en la cinta de tarea. </li><li> Abrir &quot;gerente de área de trabajo&quot; que se encuentra en el extremo derecho de la pantalla y seleccione &quot;nuevo espacio de trabajo&quot;. </li><li> Después de nombrar una cámara, siga software pide que seleccione un capturador de una lista pre-pobladas. Seleccione el capturador de que coincida con el modelo de la cámara y repita para el segundo espacio de trabajo de la cámara. Para el espacio de trabajo resultante de la fusión, se repiten una vez más, pero &quot;todas las cámaras están en uso&quot; error mensaje aparecerá. Este mensaje es normal. </li><li> Una vez cargado el espacio de trabajo resultante de la fusión, asignar cámaras del espacio de trabajo y espacio de trabajo 1 2 para el espacio de trabajo resultante de la fusión en el panel de conexión se encuentra en la parte derecha de la pantalla de visualización. </li></ol></li><li> Alinear las cámaras en el sistema de división de la emisión de la cámara dual. <ol><li> Alinear las cámaras en campo claro o de contraste de fase con la red de calibración proporcionado por el fabricante usando un objetivo 40X PlanApo (o mayor). </li><li> Enviar luz a los oculares del microscopio, coloque la rejilla de calibración metálico recubierto que fue proporcionado por el fabricante en la platina del microscopio, y cuadrar la cuadrícula en la platina del microscopio. </li><li> Traiga la red en el foco. </li><li> Plegar, pero no quite, el alojamiento dicroico para alinear la cámara 1 (cámara de derivación). Visualizar la cuadrícula sin hurgar en la basura y sin autoescala. Enfoque la imagen con el dial de ajuste de enfoque en el puerto de montaje C 1. </li><li> Empuje la carcasa dicroica en el doble channel dispositivo de adquisición totalmente, de modo que la imagen se divide por la dicroico a ambas cámaras. </li><li> Afloje los tres 5/64 &quot;tornillos de fijación y gire la segunda cámara en la hembra de montaje en C 2 hasta que la orientación de la red es idéntica en ambas imágenes. Utilización del dial de ajuste de enfoque en la C-mount puerto 2, llevar la imagen de la cámara 2 en el foco. </li><li> Finalizar la alineación utilizando la imagen combinada en el área de trabajo resultante de la fusión del software de imágenes. Esto permite ver una superposición de pseudocolor de tiempo real de las dos imágenes de la cuadrícula de calibración. Ajustar las posiciones de la imagen combinados utilizando sólo el mando de R / L en el lado derecho de la DC2. Ajuste este mando hasta límite vertical derecha / izquierda de la imagen se alinea con precisión. </li><li> Utilice el mando U / D para ajustar la alineación de arriba / abajo de la segunda imagen hasta que las barras horizontales de la cuadrícula están correctamente alineados. </li><li> Si durante el alineamiento hacia arriba / abajo una ligera rotación de la cámara se produce, corregir este problema, aflojando los tres 5/64 &quot;scre pulgadasws para la cámara 2 y gire hasta que la imagen visualizada esté correctamente alineada. </li></ol></li></ol> 3. Preparación de las células de cáncer de placas paralelas de flujo Cámara de ensayo de adhesión <ol><li> Cultura BT-20 células de cáncer de mama en medio esencial mínimo (MEM) suplementado con medio completo con 10% de suero bovino fetal (FBS) y 1% de penicilina-estreptomicina a 37 ° C y 5,0% de CO 2 como se ha descrito previamente 2. </li><li> Las células cancerosas de la cosecha con un tratamiento de tripsina diluida y cuentan las células con un hemocitómetro. </li><li> Lavar y suspender las células en 10 7 células / ml en 0,1% de albúmina de suero bovino (BSA) en DPBS con calcio y magnesio (DPBS +). </li><li> Diluir anticuerpos primarios de ratón purificada, CD24 anti-humano y de rata purificada HECA-452 (antígenos anti-sialofucosylated), a una concentración óptima predeterminada en 0,1% de BSA DPBS +. Se incuban las células durante 30 min 9, 10. </li><li> Centrifugar las células a 1200 rpm para obtener un sedimento celular. Aspitasa de anticuerpos primaria, y lavar las células dos veces con 0,1% de BSA + DBP. </li><li> Diluir los anticuerpos secundarios, de cabra anti-IgG de ratón AlexaFluor 568 (emisión máx, 603 nm), y de cabra anti-IgM de rata AlexaFluor 488 (emisión máx, 519 nm), a una concentración óptima predeterminada en 0,1% de BSA DPBS +. Se incuban las células durante 30 min. </li><li> Lavar las células dos veces y suspender en 0,1% BSA DPBS + a 10 6 células / ml en 0,1% BSA DPBS +. </li></ol> 4. Preparación del Reactivo Sustrato para placas paralelas de flujo Cámara de ensayo de adhesión <ol><li> Conectar dos longitudes separadas de tubo a los puertos de entrada y salida de la cámara de flujo de placas paralelas que se ajusta dentro de una 35 mm de placa de cultivo de tejido. Un tubo se conectará al depósito de células marcadas en suspensión en 0,1% de BSA DPBS + y el otro a la bomba de jeringa, que extraer fluido a un caudal especificado. </li><li> Conecte una línea de vacío a la cámara de flujo 1. </li><li> Coloque la cámara de flujo sobre el 35 mm de cultivo de tejidos diSH que contiene una monocapa de células de ovario de hámster chino que expresan E-selectina (CHO-E). Células CHO-E fueron cultivadas en medio MEM completo a 37 ° C y 5,0% de CO 2 2. </li><li> Ajustar la cámara de flujo y / o la junta cámara de flujo para asegurar una adecuada sello de vacío 1. </li><li> Retirar el fluido del depósito, el seguimiento conjunto de la cámara de flujo para sellado adecuado y no hay evidencia visual de la formación de burbujas de aire 1. </li><li> Coloque el conjunto de la cámara de flujo en el microscopio (Leica DMI 6000B) 1. </li></ol> 5. Dos colores de Adquisición de imágenes <ol><li> Energía de una fuente de luz compacta Leica EL-6000, o un dispositivo similar, para generar luz de alta intensidad y la pareja en una guía de luz. Utilice un microscopio invertido para pasar esta luz a través de un filtro de combinación de cubo, es decir, G / R (verde / rojo) de cubo de filtro, para excitar los fluoróforos de un color / intensidad deseada. </li><li> Asegúrese de dicroico vivienda está en la posición correcta de funcionamiento (deprimido) yno es en modo bypass. </li><li> Opere microscopio en modo de fluorescencia y seleccione apropiada filtro de cubo de fluorescencia (verde / rojo). </li><li> Determinar el tiempo de exposición y ganancia en la cámara 1 (roja; 620 ± 60 nm) y cámara de 2 (verde; 535 ± 40 nm). <ol><li> Presione el dicroico para obtener imágenes tanto en los canales de emisión de color rojo y verde. Utilice un ensayo de cámara de flujo con células marcadas con sólo el fluoróforo rojo, y obtener una imagen en el canal rojo, ajustando el tiempo de exposición de la cámara 1 en &quot;Ajustes en vivo&quot; del software de imágenes. </li><li> Coincidir con el tiempo de exposición de la cámara 2 para el tiempo de exposición de la cámara 1. Si se observa una imagen en el canal verde, los artefactos de purga a través están presentes y el tiempo de exposición en ambas cámaras debe ser reducida. </li><li> Mantener el tiempo de exposición equivalente en la cámara 1 y cámara 2, reducir el tiempo de exposición hasta que el artefacto de purga a través ya no es visible en el canal verde. Ajuste la ganancia de la cámara 1 para mejorar la imagen visibilitY en el canal rojo si es necesario. </li><li> Repetir los pasos 5.4.1 - 5.4.3 con células marcadas con sólo el fluoróforo verde, pero definir el tiempo de exposición con la cámara 2 a las células de imagen en el canal verde y sin artefactos de purga a través de en el canal rojo recogido por la cámara 1. </li><li> Anticuerpos Retitrate si artefactos sangrar a través no pueden ser eliminadas 11, o si el tiempo de exposición de la cámara 1 y cámara de 2 son sustancialmente diferentes de tal manera que se fusionaron las imágenes pueden ser temporalmente desalineado. </li></ol></li><li> Utilice el software de imágenes para ver las imágenes capturadas al mismo tiempo de dos cámaras CCD monocromo en el experimento de la cámara de flujo. </li><li> Combinar imágenes recogidas de las dos cámaras que utilizan el módulo SimulPix de StreamPix 5 o un paquete de software alternativo. </li><li> Utilice ajustes de corrección digitales en SimulPix o software alternativo para alinear espacialmente las imágenes fusionadas, si es necesario. Las imágenes pueden ser corregidos con el módulo SimulPix de horizontal, vertical, y regulación de la rotación. </li></ol>

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	<li>Wiese, G., Barthel, S. R., Dimitroff, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+physiologic+E-selectin-mediated+leukocyte+rolling+on+microvascular+endothelium.">Analysis of physiologic E-selectin-mediated leukocyte rolling on microvascular endothelium.</a> J. Vis. Exp. (24), e1009 (2009).</li><li>Shirure, V. S., Reynolds, N. M., Burdick, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mac-2+binding+protein+is+a+novel+e-selectin+ligand+expressed+by+breast+cancer+cells.">Mac-2 binding protein is a novel e-selectin ligand expressed by breast cancer cells.</a> PLoS One. 7 (9), e44529 (2012).</li><li>Burdick, M. M., McCaffery, J. M., Kim, Y. S., Bochner, B. S., Colon Konstantopoulos, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=carcinoma+cell+glycolipids,+integrins,+and+other+glycoproteins+mediate+adhesion+to+HUVECs+under+flow.">carcinoma cell glycolipids, integrins, and other glycoproteins mediate adhesion to HUVECs under flow.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 284 (4), C977-C987 (2003).</li><li>Resto, V. A., Burdick, M. M., Dagia, N. M., McCammon, S. D., Fennewald, S. M., Sackstein, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=L-selectin-mediated+lymphocyte-cancer+cell+interactions+under+low+fluid+shear+conditions.">L-selectin-mediated lymphocyte-cancer cell interactions under low fluid shear conditions.</a> J. Biol. Chem. 283 (23), 15816-15824 (2008).</li><li>Shirure, V. S., Henson, K. A., Schnaar, R. L., Nimrichter, L., Burdick, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gangliosides+expressed+on+breast+cancer+cells+are+E-selectin+ligands.">Gangliosides expressed on breast cancer cells are E-selectin ligands.</a> Biochem Biophys. Res. Commun. 406 (3), 423-429 (2011).</li><li>Tees, D. F., Goetz, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocyte+adhesion:+an+exquisite+balance+of+hydrodynamic+and+molecular+forces.">Leukocyte adhesion: an exquisite balance of hydrodynamic and molecular forces.</a> News Physiol. Sci. 18, 186-190 (2003).</li><li>Chang, K. C., Tees, D. F., Hammer, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+state+diagram+for+cell+adhesion+under+flow:+leukocyte+rolling+and+firm+adhesion.">The state diagram for cell adhesion under flow: leukocyte rolling and firm adhesion.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97 (21), 11262-11267 (2000).</li><li>Lichtman, J. W., Conchello, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+microscopy.">Fluorescence microscopy.</a> Nat. Methods. 2 (12), 910-919 (2005).</li><li>Kummitha, C. M., Shirure, V. S., Delgadillo, L. F., Deosarkar, S. P., Tees, D. F., Burdick, M. M., Goetz, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HECA-452+is+a+non-function+blocking+antibody+for+isolated+sialyl+Lewis+x+adhesion+to+endothelial+expressed+E-selectin+under+flow+conditions.">HECA-452 is a non-function blocking antibody for isolated sialyl Lewis x adhesion to endothelial expressed E-selectin under flow conditions.</a> J. Immunol. Methods. 384 (1-2), 43-50 (2012).</li><li>Burdick, M. M., Henson, K. A., Delgadillo, L. F., Choi, Y. E., Goetz, D. J., Tees, D. F., Benencia, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+E-selectin+ligands+on+circulating+tumor+cells:+cross-regulation+with+cancer+stem+cell+regulatory+pathways?.">Expression of E-selectin ligands on circulating tumor cells: cross-regulation with cancer stem cell regulatory pathways?.</a> Front. Oncol. 2, 103 (2012).</li><li>Hoffman, G. E., Le, W. W., Sita, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Importance+of+Titrating+Antibodies+for+Immunocytochemical+Methods.">The Importance of Titrating Antibodies for Immunocytochemical Methods.</a> Current Protocols in Neuroscience. , (2001).</li><li>Weinberg, S., Lipke, E. A., Tung, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+electrophysiological+mapping+of+stem+cells.">In vitro electrophysiological mapping of stem cells.</a> Methods Mol. Biol. 660, 215-237 (2010).</li><li>Kong, K. V., Leong, W. K., Lim, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osmium+carbonyl+clusters+containing+labile+ligands+hyperstabilize+microtubules.">Osmium carbonyl clusters containing labile ligands hyperstabilize microtubules.</a> Chem. Res. Toxicol. 22 (6), 1116-1122 (2009).</li><li>Vermot, J., Fraser, S. E., Liebling, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+fluorescence+microscopy+for+imaging+the+dynamics+of+embryonic+development.">Fast fluorescence microscopy for imaging the dynamics of embryonic development.</a> HFSP J. 2 (3), 143-155 (2008).</li><li>Bullen, A., Friedman, R. S., Krummel, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+imaging+of+the+immune+system:+a+custom+technology+platform+for+high-speed,+multicolor+tissue+imaging+of+immune+responses.">Two-photon imaging of the immune system: a custom technology platform for high-speed, multicolor tissue imaging of immune responses.</a> Curr. Top. Microbiol. Immunol. 334, 1-29 (2009).</li><li>Worth, D. C., Parsons, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+imaging+cell-matrix+adhesions.">Advances in imaging cell-matrix adhesions.</a> J. Cell Sci. 123, 3629-3638 (2010).</li><li>Xiao, Z., Visentin, G. P., Dayananda, K. M., Neelamegham, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+complexes+formed+following+the+binding+of+anti-platelet+factor+4+(CXCL4)+antibodies+to+CXCL4+stimulate+human+neutrophil+activation+and+cell+adhesion.">Immune complexes formed following the binding of anti-platelet factor 4 (CXCL4) antibodies to CXCL4 stimulate human neutrophil activation and cell adhesion.</a> Blood. 112 (4), 1091-1100 (2008).</li></ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

El sistema de fraccionamiento de emisiones de doble cámara tiene la resolución espacial, temporal y óptica necesaria para capturar imágenes de alta calidad en aplicaciones en las células o el movimiento molecular es rápida. En la generación de los resultados representativos, los parámetros del sistema de división de la emisión de la cámara dual, incluida la configuración de software y configuración de la cámara, fueron optimizados para obtener una secuencia de imagen combinada en el que a la rodadura y las...

Métodos para el análisis de moléculas en la superficie celular, tales como la inmunotinción, emplean sondas que se conjugan químicamente a fluoróforos, que permite la detección de moléculas diana. Imágenes de células en vivo y ensayos de adhesión celular basados ​​en el flujo hidrodinámico se registran de cámaras CCD monocromo diseñadas para capturar los procesos fisiológicos a nivel celular y / o molecular de nivel 1, 2. Estas cámaras son muy sensibles, entregar velocidades de cuadro rápidas (más de 30 cuadros por segundo), y proporciona una resolución temporal excepcional (debido a velocidades de cuadro rápidas y tiempos de exposición cortos). Sin embargo, las cámaras monocromas sólo pueden capturar un solo canal de emisión (la detección de un solo fluoróforo) para recoger imágenes. Sistemas individuales de división de emisión de la cámara se pueden incorporar para capturar múltiples canales de emisión, pero a menudo reducen el campo de visión y requieren el mismo tiempo de exposición para obtener imágenes de todos los canales. Para capturar el espectro de color de las células marcadas con multíparaLe fluoróforos, una cámara de color se puede utilizar como una alternativa. Sin embargo, las cámaras en color generalmente no son capaces de proporcionar la resolución temporal deseado para imágenes de células vivas en ciertas aplicaciones. Se necesita otro dispositivo de formación de imágenes para aplicaciones en las que es ventajosa para las células vivas de la imagen en múltiples longitudes de onda al tiempo que conserva una alta resolución temporal. Una aplicación experimental principal es el ensayo de adhesión cámara de flujo de placas paralelas, en el que las células se sometieron a perfusión en condiciones fisiológicamente relevantes sobre un sustrato potencialmente reactivo 1, 3. Las células en el flujo que expresan moléculas de superficie celular específicos pueden adherirse y rodillo sobre el sustrato, tal como una monocapa de células que expresan moléculas de adhesión o las proteínas de la matriz extracelular adsorbido en la superficie 4, 5. Células rodantes pueden experimentar el movimiento de rotación y traslación en fracciones de segundo. Características moleculares en la rodadura y las células adherentes, tales como grupos de moléculas de superficie celular, también tienen el potenciómetroAl someterse a la reorganización activa en la superficie celular. Por lo tanto, los sistemas de imágenes deben proporcionar una resolución temporal excepcional (30 cuadros por segundo o superior y &quot;cerca de cero&quot; tiempos de exposición) para generar una secuencia de imágenes que ilustra la progresión paso a paso de la celda de rodadura 6, 7. Sistemas que dividen las emisiones cámara dual son capaces de satisfacer estas demandas de imágenes de células marcadas con múltiples fluoróforos. Sistemas de división de emisión dual de la cámara se separaron y canales de fluorescencia del filtro en dos cámaras similares para capturar simultáneamente dos imágenes espacialmente idénticos pero fluoróforo específica al tiempo que conserva el campo de visión completo. Esta tecnología permite la comparación directa de la imagen capturada en tiempo real en cada canal y permite al usuario cambiar rápidamente entre los modelos de cámara con diferentes capacidades de imagen. Esta característica es útil para realizar ajustes en la configuración de captura de imágenes en una cámara que mejor permitir que el sistema para capturarfluoróforos con diferentes intensidades, tiempos de vida, y los coeficientes de extinción 8. Junto con el software de imágenes, sistemas de división de emisión de cámaras duales permiten la grabación en tiempo real de análisis de imágenes de células vivas en múltiples longitudes de onda y pueden mejorar los ensayos in vitro que utilizan la fluorescencia para estudiar el comportamiento celular.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Reagent/Material</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>BT-20 cells</td>
 <td>ATCC</td>
 <td>HTB-19</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>CHO-E cells</td>
 <td>Gift from Dr. R. Sackstein (Brigham and Women's Hospital, Harvard Medical School)</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MEM </td>
 <td>Thermo Scientific</td>
 <td>SH30024.01</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>FBS</td>
 <td>Thermo Scientific</td>
 <td>SH30396.03</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Penicillin-streptomycin</td>
 <td>Thermo Scientific</td>
 <td>SV30010</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>0.25% Trypsin / 0.1% EDTA</td>
 <td>Thermo Scientific</td>
 <td>SV30031.01</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DPBS</td>
 <td>Thermo Scientific </td>
 <td>SH30028.02</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DPBS+</td>
 <td>Life Technologies</td>
 <td>14080-055</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>BSA</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>A9647</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HECA-452 monoclonal antibody</td>
 <td>BD Biosciences</td>
 <td>555946</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Anti-human CD24 monoclonal antibody</td>
 <td>BD Biosciences</td>
 <td>555426</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Anti-rat IgM AlexaFluor 488</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>A21212</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Anti-mouse IgG AlexaFluor 568</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>A11004</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>[header]</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Equipment</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>EXi Blue Fluorescence Microscopy Digital CCD Camera</td>
 <td>Q Imaging</td>
 <td>EXI-BLU-R-F-M-14-C</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Retiga EXi FAST 1394 Digital CCD Camera</td>
 <td>Q Imaging</td>
 <td>RET-EXi-F-M-12-C</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DC2 Emission Splitter</td>
 <td>Photometrics</td>
 <td>DC2 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Inverted Fluorescence Microscope</td>
 <td>Leica</td>
 <td> DMI6000 B</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Streampix 5 software</td>
 <td>Norpix</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

simultaneously capturing real-time images in two emission channels using a dual camera emission splitting system: applications to cell adhesion

Multi-color de inmunofluorescencia microscopía para detectar moléculas específicas en la membrana celular se puede acoplar con ensayos de cámara de flujo de placas paralelas para investigar los mecanismos que regulan la adhesión celular en condiciones de flujo dinámico. Por ejemplo, las células cancerosas etiquetado con múltiples fluoróforos pueden ser perfundidos sobre un sustrato potencialmente reactivo para modelar los mecanismos de la metástasis del cáncer. Sin embargo, los sistemas de cámara única de múltiples canales y cámaras de color presentan deficiencias en la adquisición de imágenes para el análisis de células vivas en tiempo real. Para superar estas limitaciones, se utilizó un sistema de división de las emisiones de doble cámara para capturar simultáneamente secuencias de imágenes en tiempo real de las células marcadas con fluorescencia en la cámara de flujo. Longitud de onda de emisión de la división de sistemas de filtro de la cámara dual definido oscila en dos cámaras CCD monocromo, capturando con ello simultáneamente dos imágenes idénticas pero espacialmente fluoróforo específico. Posteriormente, psuedocolored imágenes de un canal se combinan en un soloen tiempo real se fusionó secuencia que puede revelar múltiples moléculas diana en las células que se mueve rápidamente a través de una región de interés.

Un ensayo de adhesión cámara de flujo de placas paralelas se utilizó para demostrar un sistema de división de emisiones de doble cámara que captura simultáneamente secuencias de imágenes en tiempo real en los dos canales de emisión (Figura 1). El sistema de fraccionamiento de emisiones de doble cámara detecta BT-20 células que se marcado con fluorescencia con CD24 anti-humano y HECA-452 (detección de antígenos sialofucosylated) anticuerpos monoclonales y anticuerpos secundarios apropiados <s...

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Simultaneously Capturing Real-time Images in Two Emission Channels Using a Dual Camera Emission Splitting System: Applications to Cell Adhesion

Sistemas que dividen las emisiones de cámara dual para dos colores microscopía de fluorescencia generan secuencias de imágenes en tiempo real con una resolución óptica excepcional y temporal, una exigencia de ciertos ensayos de células en vivo, incluyendo ensayos de adhesión cámara de flujo de placas paralelas. Cuando se emplea software para fusionar las imágenes de los canales de emisión adquiridos simultáneamente, se producen secuencias de imágenes pseudocoloreada.

La captura simultánea imágenes en tiempo real en los dos canales de emisión mediante un sistema de división de doble cámara de emisiones: Las solicitudes de adhesión de células

Multi-color immunofluorescence microscopy to detect specific molecules in the cell membrane can be coupled with parallel plate flow chamber assays to ...

simultaneously-capturing-real-time-images-two-emission-channels-using

Research

JoVE Journal

Bioengineering

9.5K vistas.  Ohio University.  Sistemas que dividen las emisiones de cámara dual para dos colores microscopía de fluorescencia generan secuencias de imágenes en tiempo real con una resolución óptica excepcional y temporal, una exigencia de ciertos ensayos de células en vivo, incluyendo ensayos de adhesión cámara de flujo de placas paralelas. Cuando se emplea software para fusionar las imágenes de los canales de emisión adquiridos simultáneamente, se producen secuencias de imágenes pseudoco...

Video: Simultaneously Capturing Real-time Images in Two Emission Channels Using a Dual Camera Emission Splitting System: Applications to Cell Adhesion

Creating Two-Dimensional Patterned Substrates for Protein and Cell Confinement

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1 While microcontact printing can be employed to directly print a large number of molecules, including proteins,2 DNA,3 and silanes,4 the formation of self-assembled monolayers (SAMs) from long chain alkane thiols on gold provides a simple way to confine proteins and cells to specific patterns containing adhesive and resistant regions. This confinement can be used to control cell morphology and is useful for examining a variety of questions in protein and cell biology. Here, we describe a general method for the creation of well-defined protein patterns for cellular studies.5 This process involves three steps: the production of a patterned master using photolithography, the creation of a PDMS stamp, and microcontact printing of a gold-coated substrate. Once patterned, these cell culture substrates are capable of confining proteins and/or cells (primary cells or cell lines) to the pattern.
The use of self-assembled monolayer chemistry allows for precise control over the patterned protein/cell adhesive regions and non-adhesive regions; this cannot be achieved using direct protein stamping. Hexadecanethiol, the long chain alkane thiol used in the microcontact printing step, produces a hydrophobic surface that readily adsorbs protein from solution. The glycol-terminated thiol, used for backfilling the non-printed regions of the substrate, creates a monolayer that is resistant to protein adsorption and therefore cell growth.6 These thiol monomers produce highly structured monolayers that precisely define regions of the substrate that can support protein adsorption and cell growth. As a result, these substrates are useful for a wide variety of applications from the study of intercellular behavior7 to the creation of microelectronics.8
While other types of monolayer chemistry have been used for cell culture studies, including work from our group using trichlorosilanes to create patterns directly on glass substrates,9 patterned monolayers formed from alkane thiols on gold are straight-forward to prepare. Moreover, the monomers used for monolayer preparation are commercially available, stable, and do not require storage or handling under inert atmosphere. Patterned substrates prepared from alkane thiols can also be recycled and reused several times, maintaining cell confinement.10

Self-assembled monolayers (SAMs) formed from long chain alkane thiols on gold provide well-defined substrates for the formation of protein patterns and cell confinement. Microcontact printing of hexadecanethiol using a polydimethylsiloxane (PDMS) stamp followed by backfilling with a glycol-terminated alkane thiol monomer produces a pattern where protein and cells adsorb only to the stamped hexadecanethiol region.

La creación de dos dimensiones con dibujos sustratos para el confinamiento de proteínas y células

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1  While microcontact printing ...

Investigación

Bioingeniería

Study of Cell Migration in Microfabricated Channels

The method described here allows the study of cell migration under confinement in one dimension. It is based on the use of microfabricated channels, which impose a polarized phenotype to cells by physical constraints. Once inside channels, cells have only two possibilities: move forward or backward. This simplified migration in which directionality is restricted facilitates the automatic tracking of cells and the extraction of quantitative parameters to describe cell movement. These parameters include cell velocity, changes in direction, and pauses during motion. Microchannels are also compatible with the use of fluorescent markers and are therefore suitable to study localization of intracellular organelles and structures during cell migration at high resolution. Finally, the surface of the channels can be functionalized with different substrates, allowing the control of the adhesive properties of the channels or the study of haptotaxis. In summary, the system here described is intended to analyze the migration of large cell numbers in conditions in which both the geometry and the biochemical nature of the environment are controlled, facilitating the normalization and reproducibility of independent experiments.

A quantitative method to study spontaneous migration of cells in a one-dimensional confined microenvironment is described. This method takes advantage of microfabricated channels and can be used to study migration of large number of cells under different conditions in single experiments.

Estudio de la Migración celular en Canales Microfabricated

The method described here allows the study of cell migration under confinement in one dimension. It is based on the use of microfabricated channels, which ...

A Novel Stretching Platform for Applications in Cell and Tissue Mechanobiology

Tools that allow the application of mechanical forces to cells and tissues or that can quantify the mechanical properties of biological tissues have contributed dramatically to the understanding of basic mechanobiology. These techniques have been extensively used to demonstrate how the onset and progression of various diseases are heavily influenced by mechanical cues. This article presents a multi-functional biaxial stretching (BAXS) platform that can either mechanically stimulate single cells or quantify the mechanical stiffness of tissues. The BAXS platform consists of four voice coil motors that can be controlled independently. Single cells can be cultured on a flexible substrate that can be attached to the motors allowing one to expose the cells to complex, dynamic, and spatially varying strain fields. Conversely, by incorporating a force load cell, one can also quantify the mechanical properties of primary tissues as they are exposed to deformation cycles. In both cases, a proper set of clamps must be designed and mounted to the BAXS platform motors in order to firmly hold the flexible substrate or the tissue of interest. The BAXS platform can be mounted on an inverted microscope to perform simultaneous transmitted light and/or fluorescence imaging to examine the structural or biochemical response of the sample during stretching experiments. This article provides experimental details of the design and usage of the BAXS platform and presents results for single cell and whole tissue studies. The BAXS platform was used to measure the deformation of nuclei in single mouse myoblast cells in response to substrate strain and to measure the stiffness of isolated mouse aortas. The BAXS platform is a versatile tool that can be combined with various optical microscopies in order to provide novel mechanobiological insights at the sub-cellular, cellular and whole tissue levels.

We present in this article a novel stretching platform that can be used to investigate single cell responses to complex anisotropic biaxial mechanical deformation and quantify the mechanical properties of biological tissues.

Una Plataforma Novela Estiramiento para Aplicaciones en Celular y Tisular Mecanobiología

Tools that allow the application of mechanical forces to cells and tissues or that can quantify the mechanical properties of biological tissues have ...

Using Cell-substrate Impedance and Live Cell Imaging to Measure Real-time Changes in Cellular Adhesion and De-adhesion Induced by Matrix Modification

Cell-matrix adhesion plays a key role in controlling cell morphology and signaling. Stimuli that disrupt cell-matrix adhesion (e.g., myeloperoxidase and other matrix-modifying oxidants/enzymes released during inflammation) are implicated in triggering pathological changes in cellular function, phenotype and viability in a number of diseases. Here, we describe how cell-substrate impedance and live cell imaging approaches can be readily employed to accurately quantify real-time changes in cell adhesion and de-adhesion induced by matrix modification (using endothelial cells and myeloperoxidase as a pathophysiological matrix-modifying stimulus) with high temporal resolution and in a non-invasive manner. The xCELLigence cell-substrate impedance system continuously quantifies the area of cell-matrix adhesion by measuring the electrical impedance at the cell-substrate interface in cells grown on gold microelectrode arrays. Image analysis of time-lapse differential interference contrast movies quantifies changes in the projected area of individual cells over time, representing changes in the area of cell-matrix contact. Both techniques accurately quantify rapid changes to cellular adhesion and de-adhesion processes. Cell-substrate impedance on microelectrode biosensor arrays provides a platform for robust, high-throughput measurements. Live cell imaging analyses provide additional detail regarding the nature and dynamics of the morphological changes quantified by cell-substrate impedance measurements. These complementary approaches provide valuable new insights into how myeloperoxidase-catalyzed oxidative modification of subcellular extracellular matrix components triggers rapid changes in cell adhesion, morphology and signaling in endothelial cells. These approaches are also applicable for studying cellular adhesion dynamics in response to other matrix-modifying stimuli and in related adherent cells (e.g., epithelial cells).

Here, we present a protocol to continuously quantify cell adhesion and de-adhesion processes with high temporal resolution in a non-invasive manner by cell-substrate impedance and live cell imaging analyses. These approaches reveal the dynamics of cell adhesion/de-adhesion processes triggered by matrix modification and their temporal relationship to adhesion-dependent signaling events.

Utilizando Impedancia Cell-sustrato y imágenes de células vivas para medir los cambios en tiempo real en la adhesión celular y De-adhesión inducidas por Matrix Modificación

Cell-matrix adhesion plays a key role in controlling cell morphology and signaling. Stimuli that disrupt cell-matrix adhesion (e.g., myeloperoxidase and ...

Electrotaxis Studies of Lung Cancer Cells using a Multichannel Dual-electric-field Microfluidic Chip

The behavior of directional cell migration under a direct current electric-field (dcEF) is referred to as electrotaxis. The significant role of physiological dcEF in guiding cell movement during embryo development, cell differentiation, and wound healing has been demonstrated in many studies. By applying microfluidic chips to an electrotaxis assay, the investigation process is shortened and experimental errors are minimized. In recent years, microfluidic devices made of polymeric substances (e.g., polymethylmethacrylate, PMMA, or acrylic) or polydimethylsiloxane (PDMS) have been widely used in studying the responses of cells to electrical stimulation. However, unlike the numerous steps required to fabricate a PDMS device, the simple and rapid construction of the acrylic micro&#64258;uidic chip makes it suitable for both device prototyping and production. Yet none of the reported devices facilitate the efficient study of the simultaneous chemical and dcEF effects on cells. In this report, we describe our design and fabrication of an acrylic-based multichannel dual-electric-field (MDF) chip to investigate the concurrent effect of chemical and electrical stimulation on lung cancer cells. The MDF chip provides eight combinations of electrical/chemical stimulations in a single test. The chip not only greatly shortens the required experimental time but also increases accuracy in electrotaxis studies.

Many microfluidic devices have been developed for use in the study of electrotaxis. Yet, none of these chips allows the efficient study of the simultaneous chemical and electric-field (EF) effects on cells. We developed a polymethylmethacrylate-based device that offers better-controlled coexisting EF and chemical stimulation for use in electrotaxis research.

Estudios electrotaxis de pulmón células de cáncer utilizando un Multicanal Dual-campo eléctrico chip de microfluidos

The behavior of directional cell migration under a direct current electric-field (dcEF) is referred to as electrotaxis. The significant role of ...

Real Time Monitoring of Intracellular Bile Acid Dynamics Using a Genetically Encoded FRET-based Bile Acid Sensor

F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) has become a powerful tool for monitoring protein folding, interaction and localization in single cells. Biosensors relying on the principle of FRET have enabled real-time visualization of subcellular signaling events in live cells with high temporal and spatial resolution. Here, we describe the application of a genetically encoded Bile Acid Sensor (BAS) that consists of two fluorophores fused to the farnesoid X receptor ligand binding domain (FXR-LBD), thereby forming a bile acid sensor that can be activated by a large number of bile acids species and other (synthetic) FXR ligands. This sensor can be targeted to different cellular compartments including the nucleus (NucleoBAS) and cytosol (CytoBAS) to measure bile acid concentrations locally. It allows rapid and simple quantitation of cellular bile acid influx, efflux and subcellular distribution of endogenous bile acids without the need for labeling with fluorescent tags or radionuclei. Furthermore, the BAS FRET sensors can be useful for monitoring FXR ligand binding. Finally, we show that this FRET biosensor can be combined with imaging of other spectrally distinct fluorophores. This allows for combined analysis of intracellular bile acid dynamics and i) localization and/or abundance of proteins of interest, or ii) intracellular signaling in a single cell.

We provide a detailed protocol to study bile acid dynamics in living cells using a genetically encoded BAS FRET sensor. This Bile Acid Sensor represents a unique tool to study (regulation of) bile acid transport and FXR activation in a wide range of cell types.

Monitoreo en tiempo real de intracelular del ácido biliar Dinámica El uso de un sensor de ácido biliar basada FRET-codificados genéticamente

F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) has become a powerful tool for monitoring protein folding, interaction and localization in single cells. ...

Hand-held Clinical Photoacoustic Imaging System for Real-time Non-invasive Small Animal Imaging

Translation of photoacoustic imaging into the clinic is a major challenge. Handheld real-time clinical photoacoustic imaging systems are very rare. Here, we report a combined photoacoustic and clinical ultrasound imaging system by integrating an ultrasound probe with light delivery for small animal imaging. We demonstrate this by showing sentinel lymph node imaging in small animals along with minimally invasive real-time needle guidance. A clinical ultrasound platform with access to raw channel data allows the integration of photoacoustic imaging leading to a handheld real-time clinical photoacoustic imaging system. Methylene blue was used for sentinel lymph node imaging at 675 nm wavelength. Additionally, needle guidance with dual modal ultrasound and photoacoustic imaging was shown using the imaging system. Depth imaging of up to 1.5 cm was demonstrated with a 10 Hz laser at a photoacoustic imaging frame rate of 5 frames per second.

A clinical handheld photoacoustic imaging system will be demonstrated for real-time non-invasive small animal imaging.

Fotoacústica clínica mano sistema de imagen por imagen no invasiva en tiempo real de Animal pequeño

Translation of photoacoustic imaging into the clinic is a major challenge. Handheld real-time clinical photoacoustic imaging systems are very rare. Here, ...

A Protocol for Real-time 3D Single Particle Tracking

Real-time three-dimensional single particle tracking (RT-3D-SPT) has the potential to shed light on fast, 3D processes in cellular systems. Although various RT-3D-SPT methods have been put forward in recent years, tracking high speed 3D diffusing particles at low photon count rates remains a challenge. Moreover, RT-3D-SPT setups are generally complex and difficult to implement, limiting their widespread application to biological problems. This protocol presents a RT-3D-SPT system named 3D Dynamic Photon Localization Tracking (3D-DyPLoT), which can track particles with high diffusive speed (up to 20 &#181;m2/s) at low photon count rates (down to 10 kHz). 3D-DyPLoT employs a 2D electro-optic deflector (2D-EOD) and a tunable acoustic gradient (TAG) lens to drive a single focused laser spot dynamically in 3D. Combined with an optimized position estimation algorithm, 3D-DyPLoT can lock onto single particles with high tracking speed and high localization precision. Owing to the single excitation and single detection path layout, 3D-DyPLoT is robust and easy to set up. This protocol discusses how to build 3D-DyPLoT step by step. First, the optical layout is described. Next, the system is calibrated and optimized by raster scanning a 190 nm fluorescent bead with the piezoelectric nanopositioner. Finally, to demonstrate real-time 3D tracking ability, 110 nm fluorescent beads are tracked in water.

This protocol details the construction and operation of a real-time 3D single particle tracking microscope capable of tracking nanoscale fluorescent probes at high diffusive speeds and low photon count rates.

Un protocolo para el seguimiento en tiempo real 3D sola partícula

Real-time three-dimensional single particle tracking (RT-3D-SPT) has the potential to shed light on fast, 3D processes in cellular systems. Although ...

In Situ Microscopy for Real-time Determination of Single-cell Morphology in Bioprocesses

In situ monitoring in microbial bioprocesses is mostly restricted to chemical and physical properties of the medium (e.g.,pH value and the dissolved oxygen concentration). Nevertheless, the morphology of cells can be a suitable indicator for optimal conditions, since it changes with dependence on the growth state, product accumulation and cell stress. Furthermore, the single-cell size distribution provides not only information about the cultivation conditions, but also about the population heterogeneity. To gain such information, a photo-optical in situ microscopy device1 was developed to enable the monitoring of the single-cell size distribution directly in the cell suspension in bioreactors. An automated image analysis is coupled to the microscopy based on a neural network model, which is trained with user-annotated images. Several parameters, which are gained from the captures of the microscope, are correlated to process relevant features of the cells, like their metabolic activity. Until now, the presented in situ microscopy probe series was applied to measure the pellet size in filamentous fungi suspensions. It was used to distinguish the single-cell size in microalgae cultivation and relate it to lipid accumulation. The shape of cellular particles was related to budding in yeast cultures. The microscopy analysis can be generally split into three steps: (i) image acquisition, (ii) particle identification, and (iii) data analysis, respectively. All steps have to be adapted to the organism, and therefore specific annotated information is required in order to achieve reliable results. The ability to monitor changes in cell morphology directly in line or on line (in a by-pass) enables real-time values for monitoring and control, in process development as well as in production scale. If the off line data correlates with the real-time data, the current tedious off line measurements with unknown influences on the cell size become needless.

In Situ Microscopy for Real-time Determination of Single-cell Morphology in Bioprocesses

A photo-optical in situ microscopy device was developed to monitor the size of single cells directly in the cell suspension. The real-time measurement is conducted by coupling the photo-optical sterilizable probe to an automated image analysis. Morphological changes appear with dependence on the growth state and cultivation conditions.

In Situ Microscopía para la determinación en tiempo real de la morfología de una sola célula en bioprocesos

In situ monitoring in microbial bioprocesses is mostly restricted to chemical and physical properties of the medium (e.g.,pH value and the dissolved ...

Manufacturing of a Nafion-coated, Reduced Graphene Oxide/Polyaniline Chemiresistive Sensor to Monitor pH in Real-time During Microbial Fermentation

Here, we report the engineering of a solid-state micro pH sensor based on polyaniline-functionalized, electrochemically reduced graphene oxide (ERGO-PA). Electrochemically reduced graphene oxide acts as the conducting layer and polyaniline acts as a pH-sensitive layer. The pH-dependent conductivity of polyaniline occurs by doping of holes during protonation and by the dedoping of holes during deprotonation. We found that an ERGO-PA solid-state electrode was not functional as such in fermentation processes. The electrochemically active species that the bacteria produce during the fermentation process interfere with the electrode response. We successfully applied Nafion as a proton-conducting layer over ERGO-PA. The Nafion-coated electrodes (ERGO-PA-NA) show a good sensitivity of 1.71 &#937;/pH (pH 4 - 9) for chemiresistive sensor measurements. We tested the ERGO-PA-NA electrode in real-time in the fermentation of Lactococcus lactis. During the growth of L. lactis, the pH of the medium changed from pH 7.2 to pH 4.8 and the resistance of the ERGO-PA-NA solid-state electrode changed from 294.5 &#937; to 288.6 &#937; (5.9 &#937; per 2.4 pH unit). The pH response of the ERGO-PA-NA electrode compared with the response of a conventional glass-based pH electrode shows that reference-less solid-state microsensor arrays operate successfully in a microbiological fermentation.

Here, we report the protocol for the fabrication of a Nafion-coated, polyaniline-functionalized, electrochemically reduced graphene oxide chemiresistive micro pH sensor. This chemiresistor-based, solid-state micro pH sensor can detect pH changes in real-time during a Lactococcus lactis fermentation process.

Fabricación de una cubierta de Nafion, reduce el óxido/polianilina Chemiresistive Sensor de pH Monitor en tiempo real durante la fermentación microbiana

Here, we report the engineering of a solid-state micro pH sensor based on polyaniline-functionalized, electrochemically reduced graphene oxide (ERGO-PA). ...