Los autores agradecen Tom Robinson para la prueba de lectura del manuscrito, C. Bärtschi y H. Benz para la construcción del sistema de control de presión a medida. También nos gustaría reconocer el uso de las instalaciones de sala limpia primero y el Centro de Microscopía de luz (LMC), tanto en la ETH Zürich. El trabajo fue financiado por Merck Serono y el Consejo Europeo de Investigación (CEI) a través del Programa Marco de séptima (ERC Starting Grant, el proyecto no. 203428, nμLIPIDs).

1. SU-8 de fabricación Maestro Preparar dos moldes maestros para los canales (de fluidos y control, para esquemas y dimensiones ver Figura 2) con el siguiente protocolo pero con diferentes patrones de máscara. El proceso se muestra en la Figura 3a. <ol><li> Comience por calentamiento de una oblea de silicio de 4 pulgadas por 10 min a 180 ° C. Cargue la oblea deshidratado en un spin-revestidor y utilizar el siguiente protocolo para spin-coating SU-8 2015: <ol><li> Haga girar la oblea a 100 rpm durante 20 segundos (tapa abierta de spin-revestidor, dispense SU-8 durante este paso, cierre la tapa después de la dispensación). </li><li> Girar la oblea a 500 rpm durante 10 seg (extendería el resistir sobre toda la oblea). </li><li> Girar la oblea a 1750 rpm durante 30 seg (define la altura de la resistirse a 20 micras). </li></ol></li><li> Eliminar resistir desde el borde de la oblea con acetona (utilizar un hisopo), ya que esto lo contrario se adhieren a la zona de cocción en el siguiente paso. Transfiera la oblea para ahotplate a 95 ° C y el calor durante 4 min. Después de la softbake, exponer el resistirse a través de una fotomáscara pegado a sodalime vidrio en un alineador de la máscara con la luz UV (150 mJ / cm 2, medida a 365 nm). </li><li> Después de la exposición, calentar la oblea de nuevo a 95 ° C durante 5 minutos sobre una placa caliente. Enfriar la oblea a RT y luego sumergirlo en un baño de SU-8 desarrollador durante 4 min. Agitar suavemente para quitar sin impresionar SU-8. Lave la oblea con isopropanol grado de sala limpia y secar con nitrógeno. Revise debajo de un microscopio si el desarrollo se ha realizado correctamente (especialmente las trampas de células). Si las trampas de células están completamente desarrollados, el reflejo de la oblea de silicio debe ser visible. Si es necesario, el desarrollo de la oblea de nuevo durante unos minutos. </li><li> Hornear la oblea en un horno durante 2 horas a 180 ° C para eliminar todo disolvente residual. Compruebe la altura de los canales con un perfilador paso. Si la altura es diferente de la altura deseada, repita este protocolo de comenzar en el paso 1.1 con una nueva oblea ycambiar la velocidad de centrifugado (paso 1.1.3). Finalizar la fabricación del molde maestro por silanizar la oblea con 1H, 1H, 2H, 2H-perfluorodecilo-dimethylchloro-silano en un desecador durante toda la noche. </li></ol> 2. Fabricación Maestro para la impresión por microcontacto <ol><li> Con el fin de preparar los moldes maestros para la impresión por microcontacto, deshidratar una oblea de silicio durante 10 minutos a 180 ° C. Spin-capa de 1 ml HDMS en esta oblea a 7500 rpm durante 30 segundos (el resistir adhiere mejor a una superficie silanizada). Spin-capa 2 ml de AZ1518 positivo resisten con este protocolo: <ol><li> Dispensación estático de la oponga resistencia a la oblea. </li><li> Haga girar la oblea durante 5 segundos a 500 rpm. </li><li> Haga girar la oblea durante 60 segundos a 4000 rpm. </li></ol></li><li> Después de un segundo softbake 50 a 100 ° C sobre una placa caliente, exponer al resistir a la luz ultravioleta (21 mJ / cm 2 a 365 nm) a través de una fotomáscara y en un alineador de la máscara. Desarrollar el resistir en un baño de AZ 726 de 75 seg. Enjuague la oblea desarrollado con DI-agua y golpe dry con nitrógeno. Eliminar el disolvente residual mediante el calentamiento de la oblea a 115 ° C durante 50 seg. Silaniza la oblea al vacío durante la noche. </li></ol> 3. La fabricación del chip de microfluidos Un diseño de dispositivo de dos capas se utiliza para estos experimentos. Las dos capas se preparan por separado y se unen entre sí, antes de que el chip se une finalmente en un portaobjetos de vidrio (Figura 3b). Este paso se describe la producción de las capas de PDMS y el sello de PDMS para la impresión por microcontacto. <ol><li> Preparar una mezcla 10:01 de PDMS y agente de curado. Prepare unos 80 g de PDMS en total (usando nuestros diseños, esto se traducirá en 10 fichas). Mezclar ambas partes vigorosamente y desgasificar la PDMS hasta que la mezcla esté libre de burbujas (~ 30 min). </li><li> Coloque las tabletas con la capa de control dentro de una caja de Petri con cinta adhesiva en la parte inferior. A continuación, vierta ~ 50 g de PDMS en la parte superior y colocar la oblea durante al menos 2 horas en un horno a 80 º C para asegurar la completacurado de los PDMS. Repita el mismo procedimiento para la oblea de la impresión por microcontacto, para esto se necesita ~ 20 g de PDMS. </li><li> Spin-capa de PDMS en la oblea con la capa de fluido a una velocidad de rotación de 2000 rpm para formar una capa de alta PDMS aproximadamente 40 micras. Curar el PDMS en un horno durante al menos 1 hora a 80 ° C. </li><li> Cuando ambas partes se curan, retire la capa de control de la oblea y cortar en pedazos con una cuchilla de afeitar. Hacer agujeros de conexión de presión mediante el uso de un golpeador biopsia 1 mm. Para el almacenamiento, es conveniente poner un pedazo de cinta adhesiva sobre los canales. </li><li> Para unir las dos capas, tome la oblea spin-revestido y la parte superior y colocarlos en un limpiador de plasma 23. Después del tratamiento de plasma, alinear rápidamente dos partes con un microscopio con una gran distancia de trabajo. Agregue un poco de PDMS piezas de alrededor de las partes superiores colocados. Este paso no es obligatorio, sin embargo, facilita la eliminación de los PDMS de la oblea. Coloque la oblea en un horno a 80 ° C durante al menos 1 hr. </li><li> Utilice un bisturí para retirar con cuidado el PDMS de la oblea y reducir los microchips. Hacer agujeros de acceso para las conexiones de fluidos con un golpeador biopsia 1,5 mm. </li><li> El chip de PDMS está terminado y se puede almacenar durante meses. Opcional: Si el chip se utiliza con un depósito, cortar la parte superior de una punta de pipeta de 200 l y utilizar algunos de repuesto, PDMS semicurados para pegar en la parte superior. Ponga el chip en el horno de nuevo a 80 ° C durante al menos 1 h. </li></ol> 4. Vinculación a la diapositiva de cristal Para utilizar el dispositivo para ensayos enzimáticos directos, el único paso necesario después de la unión es el bloqueo de las superficies. Para este protocolo, proceda a A. Sin embargo, para utilizar el chip de microfluidos para inmunoensayos o ELISA, por favor consulte el protocolo B para restringir los sitios de unión sólo en la placa de vidrio (es decir, para la microscopía TIRF o SPR). Si esta restricción no es importante, consulte a A, pero el uso de conjugados con biotina en el paso 4.3 y continúe con el paso 4.8en el protocolo B para crear una superficie completamente funcional. Antes de realizar el protocolo A y B: Se recomienda para filtrar todas las soluciones de proteínas usadas antes de introducirlos en el chip. Escombros y de proteína agregados pueden de otro modo bloquear trampas de células, reduciendo así el número de cámaras que se pueden utilizar para el análisis. Para este fin, utilizar una unidad de filtro de adsorción no proteico para filtrar todas las soluciones antes de su introducción en los canales. Protocolo A (ensayos enzimáticos) <ol><li> Para finalizar el dispositivo de microfluidos, unir las partes de PDMS en un portaobjetos de vidrio. Para ello, primero limpiar un portaobjetos de vidrio con jabón, agua destilada y etanol. Secar el portaobjetos con una corriente de nitrógeno. Limpie la parte PDMS con cinta scotch. </li><li> Ponga la parte PDMS y el portaobjetos de vidrio limpio en el filtro de plasma de 45 segundos a 18 W. Para asegurar una unión fuerte, poner el chip en un plato caliente (100 ° C) durante 5 min. </li><li> Después de la unión, llene el chip con fLUID. Una manera fácil de conseguir esto es utilizar la fuerza centrífuga. Corte la parte inferior de la punta 200 l pipeta. Para los canales fluídicos, llenarlos con la solución de bloqueo (albúmina de suero bovino (4% w / v) o poli-L-lisina) glicol de polietileno injertado (0,05% w / v) y colocar las puntas en las entradas. Rellene las entradas de la capa de control, ya sea con agua o con una solución isosmótico, por ejemplo, PBS. Coloque el chip en la centrífuga (800 xg) durante 5 min. Los canales deben ser ahora llenos de líquido completamente. Si no, repita este paso. </li><li> Incubar la solución de bloqueo durante al menos 30 min a temperatura ambiente. Lavar la solución de la capa de fluido con PBS a un caudal de 10 l / min utilizando una bomba de jeringa. El dispositivo está ahora listo para experimentos de células. </li></ol> Protocolo B (inmunoensayos) Para obtener una visión completa de la modificación de la superficie del paso 4.7 en adelante, por favor consulte la Tabla 1. <ol start="5"><li> EnPDMS Cubate sellos para impresión por microcontacto con una solución BBSA / BSA (por ejemplo, 1-100). Después de 30 min, limpiar los sellos a fondo con agua destilada y secar el sello bajo una corriente de nitrógeno. Colocar rápidamente los sellos en un portaobjetos de vidrio limpio (Figura 4). </li><li> Exponer el portaobjetos de vidrio con el sello junto con la parte superior del chip microfluídico a plasma de oxígeno durante 45 segundos a la máxima potencia (18 W) en un limpiador de plasma. Después del tratamiento de plasma, quitar el sello y alinear la superficie impresa debajo de las microcámaras del dispositivo. Coloque el chip durante 30 min sobre una placa caliente a 50 ° C. </li><li> Para bloquear la superficie restante, introducir solución esterilizada por filtración de BSA (4% (w / v) en PBS) en el chip con una centrífuga (véase el paso 4.2). Incubar durante 1 hora y lavar la solución de la capa de fluido con PBS (véase el paso 4.3). El chip se puede usar entonces directamente o almacenarse durante hasta 2 semanas a 4 ° C en una caja húmeda. </li><li> Para un surfac de unión completamente funcionalE, introducir avidina (0,025% (w / v) en PBS) en el depósito. Utilice una velocidad de flujo de 5 l / min durante 30 min para retirar la solución de avidina a través de los canales de fluido. Después, enjuague PBS durante 10 min. Enjuagar el depósito a fondo. </li><li> Después, añadir la proteína G (0,0025% (w / v) en PBS) y lavando durante otros 30 min. Lavar con PBS durante otros 10 min después. A continuación, añadir el anticuerpo de interés (0,0001% (w / v) en PBS) durante 10 min. Después de 10 min, detener el flujo durante 15 min para permitir la unión. A continuación, lavar con PBS durante 10 min. </li></ol> 5. Experimentos de células El protocolo está escrito en términos generales debido a la variedad de posibles ensayos. A modo de ejemplo se indican los reactivos necesarios para el ensayo de toxicidad G6PDH. La eficiencia de las células atrapando inicial del dispositivo es de alrededor de 2,5%, es decir, 5 de cada 200 células quedarán atrapados. La ocupación final de las trampas de células depende fuertemente de la línea celular utilizada, el protocolo de suspenderla línea celular y el tiempo, las células se lavan a través del canal. Para células que crecen naturalmente en suspensión (tales como U937), células individuales se pueden encontrar en aproximadamente el 75% de las cámaras después de unos pocos minutos. Las otras cámaras, o bien no están llenos, o ocupadas por dos o más células. En general, la ocupación de una sola célula es más pequeño para líneas de células adherentes. Cuando se utiliza el protocolo de suspensión más bien leve que aquí se presenta, el porcentaje disminuye a aproximadamente 30% (HEK, células MLT). La ocupación de una sola célula puede ser mejorada por tratamiento con tripsina de las células, pero esto también puede alterar los resultados de los experimentos. Dependiendo de la molécula diana, adsorción o absorción de PDMS pueden influir en los resultados. La adsorción se puede reducir mediante el bloqueo de las superficies con BSA o PLL-g-PEG. La absorción es poco probable para la mayoría de las biomoléculas hidrófilas, pero debe ser revisado para (pequeñas) componentes celulares lipofílicas. <ol><li> Preparar las células de acuerdo con el protocolo específico (por ejemplo, </em&gt; drogadicción). Para las células en suspensión, añadir las células directamente en el chip. Para las líneas de células adhesivas, utilizar tampón de disociación libre de enzima para producir una suspensión celular. Filtrar las células antes de su introducción en el chip para reducir la cantidad de grupos de células. </li><li> Cargar las células en el chip utilizando una bomba de jeringa y el flujo hacia delante, en lugar de retirar la suspensión de células. Utilice una velocidad de flujo de 5 l / min para las líneas celulares en suspensión y mayores tasas de flujo de 10-20 l / min para células adhesivas ya para reducir de fijación no específica de las células sobre las paredes del canal. </li><li> Cuando se llenan las trampas, cerrar las cámaras. Si muchas células se adhieren de forma no específica a la superficie, tratar de lavarlos con tampón de disociación celular a una velocidad de flujo de 10-30 l / min. </li></ol> Protocolo A (ensayos enzimáticos) <ol start="4"><li> Retirar tampón de lisis a través del chip. Para este ejemplo, este tampón es un tampón de hipoosmolar con adición de Tween 20 (Tris-HCl 10, 10mM de KCl, 1,5 mM de MgCl 2, 1% (v / v) de Tween 20). Para la lisis, las cámaras de abrir y cerrar rápidamente (es decir, 500 ms para caudales de 10 a 50 l / min 7,21). Para el ensayo de G6PDH, añadir 2 mM de glucosa-6-fosfato, NADP 0,5 mM, 0,5 U / ml de diaforasa y 0,3 mM de resazurina al tampón de lisis. Iniciar el seguimiento de la cinética de reacción inmediatamente después de la lisis. </li></ol> Nota: Elija cualquier tampón que es adecuado para el ensayo, sin embargo, ten en mente que los detergentes fuertes (como Triton, SDS) las células lisan inmediatamente y dará lugar a una pérdida del analito durante la apertura de la cámara. Protocolo B (inmunoensayos) Para una breve descripción de los experimentos de ELISA de células (tasas de flujo, el estado de la cámara, etc), por favor consulte la Tabla 1. <ol start="5"><li> Para ELISA, añadir el reactivo de detección requerido (por ejemplo, anticuerpo secundario, antígeno marcado) directamente al tampón de lisis. La invención añadidas Tween 20 reduce la adsorción no específica. Lisar las células según la etapa 5.4. Incubar la mezcla durante 10-15 minutos para permitir la unión (tiempo de incubación dependiendo del antígeno utilizado y el anticuerpo). </li><li> Conjugados de enzima-anticuerpo que adsorbidos no específicamente a las paredes de los canales pueden conducir a una conversión del reactivo de detección ya en el interior del depósito y los canales. Para reducir los problemas de esta adsorción, lave un inhibidor de la permanente de la enzima de detección utilizado a través del chip durante el tiempo de incubación (cámaras cerradas, antes de añadir el reactivo de detección). Para HRP, utilice HCl 20 mM en agua para inactivar permanentemente las enzimas no específicamente adsorbidos. </li><li> Después del tiempo de incubación, introducir el reactivo de detección (por ejemplo, Amplex Red y peróxido de hidrógeno para HRP) al chip. Abra las cámaras de nuevo en breve para lavar el anticuerpo secundario no unido de distancia y añadir el reactivo de detección. Iniciar el seguimiento de la cinética de reacción inmediatamente. </li><li> Calibración: Inmovilizarel anticuerpo contra la diana de interés. Cerrar cámaras. Preparar diferentes concentraciones de analito en tampón o en lisado de células fuera del chip. Aplicar una concentración en el chip y rápidamente cambiar el volumen interior de las cámaras (500 ms de tiempo de apertura). Este tiempo de apertura es suficientemente corto para garantizar que no se produce la acumulación adicional de lavado analito, y sólo un número específico de moléculas desde el volumen de la micro-cámara se detecta. A partir de la concentración conocida de antígeno dentro de la solución y el volumen de la cámara (625 PL), calcular la cantidad dentro de la cámara. Después, continúe con el paso 5.5 e introducir el resto de detección. </li></ol>

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Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Tecnología microfluídica ha abierto nuevas y fascinantes posibilidades para el análisis de una sola célula. En particular, la posibilidad de atrapar e inmovilizar las células individualmente por herramientas microfluídicos ha permitido estudios sistemáticos a corto y largo plazo sobre las propiedades de una sola célula y la respuesta. Además, la encapsulación de células en microgotas de alta frecuencia, generados en un microchip, ha permitido estudios de secreción de células individuales, que no se pueden r...

Muchos estudios en el pasado han revelado diferencias entre células dentro de una población de células grandes 1-3, en particular, la señalización de los procesos 4, o las cantidades de biomoléculas intracelulares tales como proteínas, metabolitos, 5,6 y 7,8 cofactores. Estas heterogeneidades se considera que son de importancia fundamental para la adaptación celular y la evolución 9, sino que también juegan un papel clave en la aparición y el tratamiento de enfermedades como el cáncer 10-13. Por lo tanto, los estudios sobre el nivel de una sola célula son de gran interés en la investigación biológica y farmacológica, en particular si estos estudios revelan las diferentes respuestas de las células después del tratamiento con sustancias químicas bioactivas. En los últimos años, muchas plataformas analíticas se han desarrollado que facilitan el análisis de células vivas individuales o la composición química del contenido de la celda. Mientras que células activadas por fluorescencia (FACS) es el oro StAndard para el análisis de muy alto rendimiento de células vivas individuales, el método no puede ser empleado para la cuantificación de compuestos intracelulares o secretadas. La aparición de plataformas de microfluidos ha prometido estrategias analíticas novedosas para el posicionamiento, el tratamiento y la observación de las células individuales. Un hito en la microfluídica se alcanzó con la integración de las válvulas de PDMS flexibles realizadas por Quake y compañeros de trabajo 14,15. Estas válvulas son útiles ya que pueden aislar a las regiones en el chip, por ejemplo, separar dos culturas 16. Además, son especialmente aplicable para el análisis de células individuales y, por tanto, ayudan a reducir los problemas de dilución del analito. La potencia de este enfoque para el análisis de una sola célula se ha demostrado recientemente por Hansen y compañeros de trabajo, que analizaron la expresión de genes de cientos de células individuales en paralelo 17. Cuando el objetivo proteínas y metabolitos, el análisis es muy difícil debido a la falta de un adecuadométodos mplification, el gran número de diferentes compuestos presentes, y sus variaciones en la naturaleza química. Además, se espera que la mayoría de biomoléculas intracelulares a estar presentes en bajo número de copias en el orden de unos pocos diez miles 18, por lo tanto, el método analítico utilizado debe tener una alta sensibilidad. Ensayos más potentes, como los inmunoensayos y los inmunoensayos ligados a enzimas (ELISA) son difíciles de integrar en los dispositivos de microfluidos, ya que requieren varios pasos de lavado y de incubación, así como la inmovilización de superficie. Debido a estos desafíos, no es sorprendente que sólo unos pocos ejemplos han sido reportados donde las proteínas o metabolitos se cuantificaron en el nivel de una sola célula. Por ejemplo, los estudios sobre la secreción de compuestos fluorescentes han sido reportados 19,20. Recientemente, la aplicación con ELISA se presentó para el análisis de secretadas (no fluorescentes) proteínas a partir de un cultivo de células (THP-1 células) 21 y solo (immune) células 10. Orientación de las proteínas intracelulares, Shi et al. Desarrolló un dispositivo de microfluidos que facilitó la identificación de proteínas intracelulares para el análisis de las vías de señalización en las células tumorales por medio de un inmunoensayo 11. Sin embargo, se determinaron sólo cantidades relativas de las proteínas y no hay amplificación enzimática se utilizan para aumentar la señal para las proteínas de baja abundancia. Recientemente, hemos sido capaces de combinar un microdispositivo captura de una sola célula con ensayos de fluorescencia 8 e inmunoensayos 22 (Figura 1). Las células están atrapados pasivamente en las estructuras de vallas micronizada, que permiten el suministro y el intercambio (rápida) de medio y otros agentes químicos sin ningún movimiento de las células. Una válvula en forma de anillo alrededor de cada trampa permite el aislamiento de la célula en un volumen muy pequeño (&quot;la microcámara&quot;). Esta válvula se acciona inmediatamente después de la introducción de un tampón de lisis celular (hipoosmolar), sena vez que la prevención de moléculas intracelulares o moléculas secretadas a difundir lejos. Lo más importante, debido al pequeño tamaño del volumen (625 PL) se evita gran dilución de las moléculas. Además, puesto que la lisis y análisis se llevan a cabo en en la misma posición en el chip, no hay pérdida de analitos debido al transporte. El diseño de chips descrito aquí tiene 8 filas alternas de 7 ó 8 microcámaras, por un total de 60 microcámaras. Las cámaras son accionados en filas, de manera que se impide la contaminación cruzada a lo largo de una línea. La plataforma se puede utilizar en combinación con ensayos de fluorescencia, así como ensayos inmunológicos (Figura 1D). Para este último, hemos establecido protocolos para la inmovilización de los anticuerpos, que son compatibles con la producción de chips y proceso de montaje. De ahí que la plataforma se abre el camino para ensayos sensibles, fiables y cuantificables a nivel de células individuales. Hasta ahora, se ha utilizado el dispositivo para el análisis de la ienzimas ntracellular y secretadas (cuantificación relativa mediante ensayos enzimáticos), cofactores intracelulares, proteínas y pequeñas moléculas (cuantificación absoluta por ensayos de punto final o ELISA). En lo que sigue, se describe el proceso de fabricación de chips por medio de litografía blanda de múltiples capas y los protocolos para los patrones de los anticuerpos por medio de la impresión por microcontacto y química de superficie. Además, se dan algunos ejemplos de uso de chips y las operaciones.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="884">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:344px;">REAGENTS:</td>
			<td style="width:284px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:153px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:344px;">Name of the Reagent</td>
			<td style="width:284px;">Company</td>
			<td style="width:103px;">Catalogue Number</td>
			<td style="width:153px;">Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:344px;">SU-8 2015</td>
			<td style="width:284px;">MicroChem Corp. (Netwon, MA)</td>
			<td style="width:103px;">n.a.</td>
			<td style="width:153px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:344px;">1H,1H,2H,2H-Perfluorodecyl-dimethylchloro-silane</td>
			<td style="width:284px;">ABCR (Karlsruhe, Germany)</td>
			<td style="width:103px;">AB103608</td>
			<td style="width:153px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:344px;">4-Methylumbelliferyl &#946;-D-N,N&#8242;-diacetylchitobioside hydrate</td>
			<td style="width:284px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:103px;">M9763</td>
			<td style="width:153px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:344px;">Acetone</td>
			<td style="width:284px;">Merck VWR (Darmstadt, Germany)</td>
			<td style="width:103px;">100014</td>
			<td style="width:153px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:344px;">Avidin</td>
			<td style="width:284px;">AppliChem (Axon Lab AG)</td>
			<td style="width:103px;">A-2568</td>
			<td style="width:153px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:344px;">AZ 1518</td>
			<td style="width:284px;">AZ Electronic Materials (Wiesbaden, Germany)</td>
			<td style="width:103px;">n.a.</td>
			<td style="width:153px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:344px;">AZ 726 developer</td>
			<td style="width:284px;">AZ Electronic Materials (Wiesbaden, Germany)</td>
			<td style="width:103px;">n.a.</td>
			<td style="width:153px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:344px;">Bovine serum albumin</td>
			<td style="width:284px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:103px;">A-4503</td>
			<td style="width:153px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:344px;">Bovine serum albumin, biotin</td>
			<td style="width:284px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:103px;">A-8549</td>
			<td style="width:153px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:344px;">Cell dissociation buffer</td>
			<td style="width:284px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:103px;">13151-014</td>
			<td style="width:153px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:344px;">Hexamethyldisilazane (HDMS)</td>
			<td style="width:284px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:103px;">40215</td>
			<td style="width:153px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:344px;">Hydrochloric acid</td>
			<td style="width:284px;">Fluka</td>
			<td style="width:103px;">84422</td>
			<td style="width:153px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:344px;">Isopropanol</td>
			<td style="width:284px;">Merck VWR (Darmstadt, Germany)</td>
			<td style="width:103px;">109634</td>
			<td style="width:153px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:344px;">Magnesium chloride hexahydrate</td>
			<td style="width:284px;">Fluka</td>
			<td style="width:103px;">63068</td>
			<td style="width:153px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:344px;">MR developer 600</td>
			<td style="width:284px;">Microresist technology GmbH (Berlin, Germany)</td>
			<td style="width:103px;">n.a.</td>
			<td style="width:153px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:344px;">PBS</td>
			<td style="width:284px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:103px;">10010-031</td>
			<td style="width:153px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:344px;">PLL-g-PEG grafted</td>
			<td style="width:284px;">SuSoS, (D&#252;bendorf, Switzerland)</td>
			<td style="width:103px;">n.a.</td>
			<td style="width:153px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:344px;">PLL-g-PEG grafted biotin</td>
			<td style="width:284px;">SuSoS, (D&#252;bendorf, Switzerland)</td>
			<td style="width:103px;">n.a.</td>
			<td style="width:153px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:344px;">Potassium chloride</td>
			<td style="width:284px;">Fluka</td>
			<td style="width:103px;">60132</td>
			<td style="width:153px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:344px;">Protein G, biotin</td>
			<td style="width:284px;">Sigma Fine Chemicals</td>
			<td style="width:103px;">41624</td>
			<td style="width:153px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:344px;">Silicon wafer</td>
			<td style="width:284px;">Si-Mat (Kaufering, Germany)</td>
			<td style="width:103px;">n.a.</td>
			<td style="width:153px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:344px;">Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit (PDMS)</td>
			<td style="width:284px;">Dow Corning</td>
			<td>39100000</td>
			<td style="width:153px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:344px;">Tris(hydroxymethyl)-aminomethan</td>
			<td style="width:284px;">Biorad</td>
			<td style="width:103px;">1610716</td>
			<td style="width:153px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:344px;">Tween 20</td>
			<td style="width:284px;">Biorad</td>
			<td style="width:103px;">1706531</td>
			<td style="width:153px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EQUIPMENT:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:344px;">Material Name</td>
			<td style="width:284px;">Company</td>
			<td style="width:103px;">Catalogue Number</td>
			<td style="width:153px;">Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:344px;">0.22 &#181;m PES syringe filter</td>
			<td style="width:284px;">TRP</td>
			<td style="width:103px;">99722</td>
			<td style="width:153px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:344px;">1/1.5 mm biopsy puncher</td>
			<td style="width:284px;">Miltex, York PA</td>
			<td style="width:103px;">33-31AA/33-31A</td>
			<td style="width:153px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:344px;">Cell Trics filter 20 &#181;m</td>
			<td style="width:284px;">Partec</td>
			<td style="width:103px;">04-004-2325</td>
			<td style="width:153px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:344px;">Centrifuge Sigma 3-18K</td>
			<td style="width:284px;">Kuehner</td>
			<td style="width:103px;">n.a.</td>
			<td style="width:153px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:344px;">Hotplate HP 160 III BM</td>
			<td style="width:284px;">Sawatec, Sax, Switzerland</td>
			<td style="width:103px;">n.a.</td>
			<td style="width:153px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:344px;">MA-6 mask aligner</td>
			<td style="width:284px;">Karl Suess</td>
			<td style="width:103px;">n.a.</td>
			<td style="width:153px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:344px;">Multizoom AZ100M microscope</td>
			<td style="width:284px;">Nikon Corporation</td>
			<td style="width:103px;">n.a.</td>
			<td style="width:153px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:344px;">Photomask</td>
			<td style="width:284px;">Microlitho, Essex, U.K.</td>
			<td style="width:103px;">n.a</td>
			<td style="width:153px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:344px;">Plasma Cleaner PDC-32G</td>
			<td style="width:284px;">Harrick</td>
			<td style="width:103px;">n.a.</td>
			<td style="width:153px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:344px;">Spin coater Modell WS-400 BZ-6NPP/LITE</td>
			<td style="width:284px;">Laurell</td>
			<td style="width:103px;">n.a.</td>
			<td style="width:153px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:344px;">Spin Modules SM 180 BM</td>
			<td style="width:284px;">Sawatec, Sax, Switzerland</td>
			<td style="width:103px;">n.a.</td>
			<td style="width:153px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:344px;">Step profiler Dektak XT Advanced</td>
			<td style="width:284px;">Bruker</td>
			<td style="width:103px;">n.a.</td>
			<td style="width:153px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:344px;">Syringe pump neMESYS</td>
			<td style="width:284px;">Cetoni</td>
			<td style="width:103px;">n.a.</td>
			<td style="width:153px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a microfluidic chip for the versatile chemical analysis of single cells

Se presenta un dispositivo de microfluidos que permite la determinación cuantitativa de biomoléculas intracelulares en múltiples células individuales en paralelo. Para este propósito, las células están atrapados pasivamente en el medio de una microcámara. Tras la activación de la capa de control, la célula se aísla del volumen que rodea en una pequeña cámara. El volumen que rodea a continuación, puede ser intercambiado sin afectar a la célula aislada. Sin embargo, al abrirse corta y cierre de la cámara, la solución en la cámara puede ser sustituido dentro de unos pocos cientos de milisegundos. Debido a la reversibilidad de las cámaras, las células pueden ser expuestos a diferentes soluciones secuencialmente de una manera altamente controlable, por ejemplo, para la incubación, el lavado, y finalmente, la lisis celular. Las microcámaras bien cerrados permiten la retención del lisado, minimizar y controlar la dilución después de la lisis celular. Desde la lisis y el análisis se producen en el mismo lugar, se retiene una alta sensibilidad porque no más lejos dilution o pérdida de los analitos se produce durante el transporte. Por tanto, el diseño microcámara permite el análisis fiable y reproducible de un número muy reducido de copias de moléculas intracelulares (attomoles, zeptomoles) liberadas por las células individuales. Además, muchos microcámaras pueden estar dispuestos en un formato de matriz, permitiendo el análisis de muchas células a la vez, dado que los instrumentos ópticos adecuados se utilizan para el seguimiento. Ya hemos utilizado la plataforma para los estudios de prueba de concepto para analizar las proteínas intracelulares, enzimas, cofactores y segundos mensajeros en forma cuantificable, ya sea relativa o absoluta.

Nuestra plataforma es capaz de analizar una variedad de intracelular, así como moléculas secretadas presentes en o producidos por células individuales. Aquí, nos gustaría presentar diferentes estudios ejemplo para subrayar la variedad de posibles ensayos. Daremos un ejemplo para una enzima secretada (Figura 5a), así como una enzima intracelular (Figura 5b) y proteína (Figuras 5C y D). Para más ejemplos, como cofactores o pequeñas moléculas, co...

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A Microfluidic Chip for the Versatile Chemical Analysis of Single Cells

En este artículo se presenta un chip de microfluidos para el análisis de células individuales. Permite la cuantificación de las proteínas intracelulares, enzimas, cofactores, y segundos mensajeros por medio de ensayos fluorescentes o inmunoensayos.

Un chip de microfluidos para el análisis químico versátil de células individuales

We present a microfluidic device that enables the quantitative determination of intracellular biomolecules in multiple single cells in parallel. For this ...

a-microfluidic-chip-for-versatile-chemical-analysis-single

Research

JoVE Journal

Bioengineering

14.8K vistas.  ETH Zurich, Switzerland.  En este artículo se presenta un chip de microfluidos para el análisis de células individuales. Permite la cuantificación de las proteínas intracelulares, enzimas, cofactores, y segundos mensajeros por medio de ensayos fluorescentes o inmunoensayos. 

Video: A Microfluidic Chip for the Versatile Chemical Analysis of Single Cells

Microfluidic Device for Recreating a Tumor Microenvironment in Vitro

We have developed a microfluidic device that mimics the delivery and systemic clearance of drugs to heterogeneous three-dimensional tumor tissues in vitro. Nutrients delivered by vasculature fail to reach all parts of tumors, giving rise to heterogeneous microenvironments consisting of viable, quiescent and necrotic cell types. Many cancer drugs fail to effectively penetrate and treat all types of cells because of this heterogeneity. Monolayers of cancer cells do not mimic this heterogeneity, making it difficult to test cancer drugs with a suitable in vitro model. Our microfluidic devices were fabricated out of PDMS using soft lithography. Multicellular tumor spheroids, formed by the hanging drop method, were inserted and constrained into rectangular chambers on the device and maintained with continuous medium perfusion on one side. The rectangular shape of chambers on the device created linear gradients within tissue. Fluorescent stains were used to quantify the variability in apoptosis within tissue. Tumors on the device were treated with the fluorescent chemotherapeutic drug doxorubicin, time-lapse microscopy was used to monitor its diffusion into tissue, and the effective diffusion coefficient was estimated. The hanging drop method allowed quick formation of uniform spheroids from several cancer cell lines. The device enabled growth of spheroids for up to 3 days. Cells in proximity of flowing medium were minimally apoptotic and those far from the channel were more apoptotic, thereby accurately mimicking regions in tumors adjacent to blood vessels. The estimated value of the doxorubicin diffusion coefficient agreed with a previously reported value in human breast cancer. Because the penetration and retention of drugs in solid tumors affects their efficacy, we believe that this device is an important tool in understanding the behavior of drugs, and developing new cancer therapeutics.

Microfluidic Device for Recreating a Tumor Microenvironment in Vitro

We present the procedure for fabrication and operation of a microfluidic device that recreates heterogeneous tumor microenvironments in vitro. The variability in apoptosis within tumor tissue was quantified using fluorescent stains and the effective diffusion coefficient of the chemotherapeutic drug doxorubicin into tumor tissue was evaluated.

Dispositivo de microfluidos para volver a crear un microambiente tumoral<em&gt; In Vitro</em

We have developed a microfluidic device that mimics the delivery and systemic clearance of drugs to heterogeneous three-dimensional tumor tissues in ...

Investigación

Bioingeniería

A Microfluidic-based Hydrodynamic Trap for Single Particles

The ability to confine and manipulate single particles in free solution is a key enabling technology for fundamental and applied science. Methods for particle trapping based on optical, magnetic, electrokinetic, and acoustic techniques have led to major advancements in physics and biology ranging from the molecular to cellular level. In this article, we introduce a new microfluidic-based technique for particle trapping and manipulation based solely on hydrodynamic fluid flow. Using this method, we demonstrate trapping of micro- and nano-scale particles in aqueous solutions for long time scales. The hydrodynamic trap consists of an integrated microfluidic device with a cross-slot channel geometry where two opposing laminar streams converge, thereby generating a planar extensional flow with a fluid stagnation point (zero-velocity point). In this device, particles are confined at the trap center by active control of the flow field to maintain particle position at the fluid stagnation point. In this manner, particles are effectively trapped in free solution using a feedback control algorithm implemented with a custom-built LabVIEW code. The control algorithm consists of image acquisition for a particle in the microfluidic device, followed by particle tracking, determination of particle centroid position, and active adjustment of fluid flow by regulating the pressure applied to an on-chip pneumatic valve using a pressure regulator. In this way, the on-chip dynamic metering valve functions to regulate the relative flow rates in the outlet channels, thereby enabling fine-scale control of stagnation point position and particle trapping. The microfluidic-based hydrodynamic trap exhibits several advantages as a method for particle trapping. Hydrodynamic trapping is possible for any arbitrary particle without specific requirements on the physical or chemical properties of the trapped object. In addition, hydrodynamic trapping enables confinement of a "single" target object in concentrated or crowded particle suspensions, which is difficult using alternative force field-based trapping methods. The hydrodynamic trap is user-friendly, straightforward to implement and may be added to existing microfluidic devices to facilitate trapping and long-time analysis of particles. Overall, the hydrodynamic trap is a new platform for confinement, micromanipulation, and observation of particles without surface immobilization and eliminates the need for potentially perturbative optical, magnetic, and electric fields in the free-solution trapping of small particles.

In this article, we present a microfluidic-based method for particle confinement based on hydrodynamic flow. We demonstrate stable particle trapping at a fluid stagnation point using a feedback control mechanism, thereby enabling confinement and micromanipulation of arbitrary particles in an integrated microdevice.

Una de microfluidos basada en hidrodinámica trampa para las partículas individuales

The ability to confine and manipulate single particles in free solution is a key enabling technology for fundamental and applied science.  Methods for ...

Fluorescence detection methods for microfluidic droplet platforms

The development of microfluidic platforms for performing chemistry and biology has in large part been driven by a range of potential benefits that accompany system miniaturisation. Advantages include the ability to efficiently process nano- to femoto- liter volumes of sample, facile integration of functional components, an intrinsic predisposition towards large-scale multiplexing, enhanced analytical throughput, improved control and reduced instrumental footprints.1
In recent years much interest has focussed on the development of droplet-based (or segmented flow) microfluidic systems and their potential as platforms in high-throughput experimentation.2-4 Here water-in-oil emulsions are made to spontaneously form in microfluidic channels as a result of capillary instabilities between the two immiscible phases. Importantly, microdroplets of precisely defined volumes and compositions can be generated at frequencies of several kHz. Furthermore, by encapsulating reagents of interest within isolated compartments separated by a continuous immiscible phase, both sample cross-talk and dispersion (diffusion- and Taylor-based) can be eliminated, which leads to minimal cross-contamination and the ability to time analytical processes with great accuracy. Additionally, since there is no contact between the contents of the droplets and the channel walls (which are wetted by the continuous phase) absorption and loss of reagents on the channel walls is prevented.
Once droplets of this kind have been generated and processed, it is necessary to extract the required analytical information. In this respect the detection method of choice should be rapid, provide high-sensitivity and low limits of detection, be applicable to a range of molecular species, be non-destructive and be able to be integrated with microfluidic devices in a facile manner. To address this need we have developed a suite of experimental tools and protocols that enable the extraction of large amounts of photophysical information from small-volume environments, and are applicable to the analysis of a wide range of physical, chemical and biological parameters. Herein two examples of these methods are presented and applied to the detection of single cells and the mapping of mixing processes inside picoliter-volume droplets. We report the entire experimental process including microfluidic chip fabrication, the optical setup and the process of droplet generation and detection.

Droplet-based microfluidic platforms are promising candidates for high throughput experimentation since they are able to generate picoliter, self-compartmentalized vessels inexpensively at kHz rates. Through integration with fast, sensitive and high resolution fluorescence spectroscopic methods, the large amounts of information generated within these systems can be efficiently extracted, harnessed and utilized.

Métodos de detección de fluorescencia para las plataformas de las gotas de microfluidos

The development of microfluidic platforms for performing chemistry and biology has in large part been driven by a range of potential benefits that ...

A Microfluidic Chip for ICPMS Sample Introduction

This protocol discusses the fabrication and usage of a disposable low cost microfluidic chip as sample introduction system for inductively coupled plasma mass spectrometry (ICPMS). The chip produces monodisperse aqueous sample droplets in perfluorohexane (PFH). Size and frequency of the aqueous droplets can be varied in the range of 40 to 60 &#181;m and from 90 to 7,000&#160;Hz, respectively. The droplets are ejected from the chip with a second flow of PFH and remain intact during the ejection. A custom-built desolvation system removes the PFH and transports the droplets into the ICPMS. Here, very stable signals with a narrow intensity distribution can be measured, showing the monodispersity of the droplets. We show that the introduction system can be used to quantitatively determine iron in single bovine red blood cells. In the future, the capabilities of the introduction device can easily be extended by the integration of additional microfluidic modules.

We present a discrete droplet sample introduction system for inductively coupled plasma mass spectrometry (ICPMS). It is based on a cheap and disposable microfluidic chip that generates highly monodisperse droplets in a size range of 40&#8722;60 &#181;m at frequencies from 90 to 7,000 Hz.

Un chip de microfluidos para ICPMS Introducción Muestra

This protocol discusses the fabrication and usage of a disposable low cost microfluidic chip as sample introduction system for inductively coupled plasma ...

The Multi-organ Chip - A Microfluidic Platform for Long-term Multi-tissue Coculture

The ever growing amount of new substances released onto the market and the limited predictability of current in vitro test systems has led to a high need for new solutions for substance testing. Many drugs that have been removed from the market due to drug-induced liver injury released their toxic potential only after several doses of chronic testing in humans. However, a controlled microenvironment is pivotal for long-term multiple dosing experiments,&#160;as even minor alterations in extracellular conditions may greatly influence the cell physiology. We focused within our research program on the generation of a microengineered bioreactor, which can be dynamically perfused by an on-chip pump and combines at least two culture spaces for multi-organ applications. This circulatory system mimics the in vivo conditions of primary cell cultures better and assures a steadier,&#160;more quantifiable extracellular relay of signals to the cells. 
For demonstration purposes, human liver equivalents, generated by aggregating differentiated HepaRG cells with human hepatic stellate cells in hanging drop plates, were cocultured with human skin punch biopsies for up to 28 days inside the microbioreactor. The use of cell culture inserts enables the skin to be cultured at an air-liquid interface, allowing topical substance exposure. The microbioreactor system is capable of supporting these cocultures at near physiologic fluid flow and volume-to-liquid ratios, ensuring stable and organotypic culture conditions. The possibility of long-term cultures enables the repeated exposure to substances. Furthermore, a vascularization of the microfluidic channel circuit using human dermal microvascular endothelial cells yields a physiologically more relevant vascular model.

Here, we present a protocol to coculture primary cells, tissue models and punch biopsies in a microfluidic multi-organ chip for up to 28 days. Human dermal microvascular endothelial cells, liver aggregates and skin biopsies were successfully combined in a common media circulation.

El chip de varios órganos - Una plataforma de microfluidos para el largo plazo co-cultivo de múltiples tejidos

The ever growing amount of new substances released onto the market and the limited predictability of current in vitro test systems has led to a high need ...

Electrotaxis Studies of Lung Cancer Cells using a Multichannel Dual-electric-field Microfluidic Chip

The behavior of directional cell migration under a direct current electric-field (dcEF) is referred to as electrotaxis. The significant role of physiological dcEF in guiding cell movement during embryo development, cell differentiation, and wound healing has been demonstrated in many studies. By applying microfluidic chips to an electrotaxis assay, the investigation process is shortened and experimental errors are minimized. In recent years, microfluidic devices made of polymeric substances (e.g., polymethylmethacrylate, PMMA, or acrylic) or polydimethylsiloxane (PDMS) have been widely used in studying the responses of cells to electrical stimulation. However, unlike the numerous steps required to fabricate a PDMS device, the simple and rapid construction of the acrylic micro&#64258;uidic chip makes it suitable for both device prototyping and production. Yet none of the reported devices facilitate the efficient study of the simultaneous chemical and dcEF effects on cells. In this report, we describe our design and fabrication of an acrylic-based multichannel dual-electric-field (MDF) chip to investigate the concurrent effect of chemical and electrical stimulation on lung cancer cells. The MDF chip provides eight combinations of electrical/chemical stimulations in a single test. The chip not only greatly shortens the required experimental time but also increases accuracy in electrotaxis studies.

Many microfluidic devices have been developed for use in the study of electrotaxis. Yet, none of these chips allows the efficient study of the simultaneous chemical and electric-field (EF) effects on cells. We developed a polymethylmethacrylate-based device that offers better-controlled coexisting EF and chemical stimulation for use in electrotaxis research.

Estudios electrotaxis de pulmón células de cáncer utilizando un Multicanal Dual-campo eléctrico chip de microfluidos

The behavior of directional cell migration under a direct current electric-field (dcEF) is referred to as electrotaxis. The significant role of ...

Co-culture of Living Microbiome with Microengineered Human Intestinal Villi in a Gut-on-a-Chip Microfluidic Device

Here, we describe a protocol to perform long-term co-culture of multi-species human gut microbiome with microengineered intestinal villi in a human gut-on-a-chip microphysiological device. We recapitulate the intestinal lumen-capillary tissue interface in a microfluidic device, where physiological mechanical deformations and fluid shear flow are constantly applied to mimic peristalsis. In the lumen microchannel, human intestinal epithelial Caco-2 cells are cultured to form a &#39;germ-free&#39; villus epithelium and regenerate small intestinal villi. Pre-cultured microbial cells are inoculated into the lumen side to establish a host-microbe ecosystem. After microbial cells adhere to the apical surface of the villi, fluid flow and mechanical deformations are resumed to produce a steady-state microenvironment in which fresh culture medium is constantly supplied and unbound bacteria (as well as bacterial wastes) are continuously removed. After extended co-culture from days to weeks, multiple microcolonies are found to be randomly located between the villi, and both microbial and epithelial cells remain viable and functional for at least one week in culture. Our co-culture protocol can be adapted to provide a versatile platform for other host-microbiome ecosystems that can be found in various human organs, which may facilitate in vitro study of the role of human microbiome in orchestrating health and disease.

We describe an in vitro protocol to co-culture gut microbiome and intestinal villi for an extended period using a human gut-on-a-chip microphysiological system.

Co-cultivo de estar con microbioma intestinal humana microconstruidos Villi en una Gut-on-a-Chip dispositivo de microfluidos

Here, we describe a protocol to perform long-term co-culture of multi-species human gut microbiome with microengineered intestinal villi in a human ...

Designing Microfluidic Devices for Studying Cellular Responses Under Single or Coexisting Chemical/Electrical/Shear Stress Stimuli

Microfluidic devices are capable of creating a precise and controllable cellular micro-environment of pH, temperature, salt concentration, and other physical or chemical stimuli. They have been commonly used for in vitro cell studies by providing in vivo like surroundings. Especially, how cells response to chemical gradients, electrical fields, and shear stresses has drawn many interests since these phenomena are important in understanding cellular properties and functions. These microfluidic chips can be made of glass substrates, silicon wafers, polydimethylsiloxane (PDMS) polymers, polymethylmethacrylate (PMMA) substrates, or polyethyleneterephthalate (PET) substrates. Out of these materials, PMMA substrates are cheap and can be easily processed using laser ablation and writing. Although a few microfluidic devices have been designed and fabricated for generating multiple, coexisting chemical and electrical stimuli, none of them was considered efficient enough in reducing experimental repeats, particular for screening purposes. In this report, we describe our design and fabrication of two PMMA-based microfluidic chips for investigating cellular responses, in the production of reactive oxygen species and the migration, under single or coexisting chemical/electrical/shear stress stimuli. The first chip generates five relative concentrations of 0, 1/8, 1/2, 7/8, and 1 in the culture regions, together with a shear stress gradient produced inside each of these areas. The second chip generates the same relative concentrations, but with five different electric field strengths created within each culture area. These devices not only provide cells with a precise, controllable micro-environment but also greatly increase the experimental throughput.

Micro-fabricated devices integrated with fluidic components provide an in vitro platform for cell studies mimicking the in vivo micro-environment. We developed polymethylmethacrylate-based microfluidic chips for studying cellular responses under single or coexisting chemical/electrical/shear stress stimuli.

El diseño de dispositivos de microfluidos para el estudio de las respuestas celulares en la sección individual o Coexistencia Química / eléctrica / Shear Stress Los estímulos

Microfluidic devices are capable of creating a precise and controllable cellular micro-environment of pH, temperature, salt concentration, and other ...

A Versatile Method of Patterning Proteins and Cells

Substrate and cell patterning techniques are widely used in cell biology to study cell-to-cell and cell-to-substrate interactions. Conventional patterning techniques work well only with simple shapes, small areas and selected bio-materials. This article describes a method to distribute cell suspensions as well as substrate solutions into complex, long, closed (dead-end) polydimethylsiloxane (PDMS) microchannels using negative pressure. This method enables researchers to pattern multiple substrates including fibronectin, collagen, antibodies (Sal-1), poly-D-lysine (PDL), and laminin. Patterning of substrates allows one to indirectly pattern a variety of cells. We have tested C2C12 myoblasts, the PC12 neuronal cell line, embryonic rat cortical neurons, and amphibian retinal neurons. In addition, we demonstrate that this technique can directly pattern fibroblasts in microfluidic channels via brief application of a low vacuum on cell suspensions. The low vacuum does not significantly decrease cell viability as shown by cell viability assays. Modifications are discussed for application of the method to different cell and substrate types. This technique allows researchers to pattern cells and proteins in specific patterns without the need for exotic materials or equipment and can be done in any laboratory with a vacuum.

This report describes a simple, easy to perform technique, using low pressure vacuum, to fill microfluidic channels with cells and substrates for biological research.

Un método versátil de Patterning proteínas y células

Substrate and cell patterning techniques are widely used in cell biology to study cell-to-cell and cell-to-substrate interactions. Conventional patterning ...

Establishing Single-Cell Based Co-Cultures in a Deterministic Manner with a Microfluidic Chip

Cell co-culture assays have been widely used for studying cell-cell interactions between different cell types to better understand the biology of diseases including cancer. However, it is challenging to clarify the complex mechanism of intercellular interactions in highly heterogeneous cell populations using conventional co-culture systems because the heterogeneity of the cell subpopulation is obscured by the average values; the conventional co-culture systems can only be used to describe the population signal, but are incapable of tracking individual cells behavior. Furthermore, conventional single-cell experimental methods have low efficiency in cell manipulation because of the Poisson distribution. Microfabricated devices are an emerging technology for single-cell studies because they can accurately manipulate single cells at high-throughput and can reduce sample and reagent consumption. Here, we describe the concept and application of a microfluidic chip for multiple single-cell co-cultures. The chip can efficiently capture multiple types of single cells in a culture chamber (~46%) and has a sufficient culture space useful to study the cells&#39; behavior (e.g., migration, proliferation, etc.) under cell-cell interaction at the single-cell level. Lymphatic endothelial cells and oral squamous cell carcinoma were used to perform a single-cell co-culture experiment on the microfluidic platform for live multiple single-cell interaction studies.

This report describes a microfluidic chip-based method to set up a single cell culture experiment in which high-efficiency pairing and microscopic analysis of multiple single cells can be achieved.

Establecimiento de coculturas basadas en células únicas de manera determinista con un chip microfluídico

Cell co-culture assays have been widely used for studying cell-cell interactions between different cell types to better understand the biology of diseases ...