Es fundamental combinar eficazmente la eficiencia de la captura con la observación dinámica de imágenes de celdas vivas para comprender el efecto de la interacción celda-célula en los comportamientos de las células. Este tubo puede capturar de manera altamente eficiente varias células individuales en una cámara más grande, y proporcionar una base de cultivos suficiente, para el seguimiento dinámico de múltiples comportamientos de interacción de una sola célula. Comience preparando el dispositivo PDMS.
Coloque un molde de oblea en el plato de pesaje con 100 microlitros de triclorosilano en un desecador y aplique un vacío durante 15 minutos. Detenga el vacío y salinize el molde de obleas en el desecador a 37 grados Celsius durante al menos una hora. Mezcle la base de PDMS y el agente de curado PDMS en una proporción de diez a uno, luego vierta un total de 20 gramos de la mezcla en el molde de obleas en un plato de 15 centímetros.
Coloque el plato de 15 centímetros en un desecador y aplique un aspirador durante un minuto y medio. A continuación, retire el plato del desecador y elimine las burbujas de aire residuales en el PDMS con gas nitrógeno. Curar el PDMS colocando el plato en un horno a 65 grados centígrados durante dos a cuatro horas.
Cuando haya terminado, quite la réplica de PDMS del molde de oblea y golpee una entrada de 1,5 milímetros y una salida de 0,5 milímetros en el PDMS. Limpie la réplica de PDMS y la superficie de la diapositiva con cinta extraíble. Tratar la superficie con plasma de oxígeno.
A continuación, alinee manualmente la réplica de PDMS con la diapositiva y póngalas en contacto entre sí. Deje la diapositiva PDMS en el horno Celsius de 65 grados durante un día. Al día siguiente, sumerja el dispositivo PDMS en un contenedor lleno de PBS.
Colóquelo en el desecador y aplíquelo durante 15 minutos. Mueva el dispositivo a una capucha de cultivo celular y esterilícelo con luz UV durante 30 minutos. Reemplace el búfer del dispositivo PDMS por medio e in incubarlo a cuatro grados centígrados durante un día.
Cuando las células logren entre 70 y 80% de confluencia, retire el medio de cultivo y lávelos suavemente tres veces con cinco mililitros de PBS. Añadir un mililitro de medio DMEM/F-12 que contenga un tinte fluorescente micromolar a las células WNT5B sh4 y pLKO-GFP, e incubarlas durante 30 minutos a temperatura ambiente. Después de la incubación, lave suavemente las células tres veces con cinco mililitros de PBS estéril, retire el PBS y agregue dos mililitros de 0.25%Trypsin-EDTA.
Incubar las células durante cuatro minutos a temperatura ambiente, luego toque suavemente el plato de cultivo para promover el desprendimiento celular. Añadir cuatro mililitros de medio DMEM/F-12 para dispersar las células WNT5B sh4 y pLKO-GFP, transferir las células a un tubo de 15 mililitros y centrifugarlas a 300 xg durante tres minutos. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender suavemente el pellet celular en un mililitro de DMEM/F-12 medio.
Preparar un mililitro de suspensión celular a una concentración de tres veces diez a quintas células por mililitro y mantenerlo en hielo para evitar la agregación celular. Conecte el tubo de politetrafluoroetileno entre la salida del dispositivo y la bomba de la jeringa. Retire el medio y agregue un microlitro de la suspensión de celda preparada en la entrada del dispositivo PDMS.
A continuación, cargue la suspensión celular en el dispositivo utilizando una bomba de jeringa a un caudal de 0,3 microlitros por minuto. Agregue un microlitro de medio DMEM/F-12 en la entrada del dispositivo y, a continuación, cargue el medio en el dispositivo con una bomba de jeringa. Cargue 0,3 microlitros de medio DMEM/F12 en el dispositivo con la bomba de jeringa a un caudal de 10 microlitros por minuto.
Después de cargar las células, retire el tubo y selle la entrada y salida con cinta de poliolefina para crear un sistema de cultivo cerrado. Mueva el dispositivo PDMS a un plato de cultivo de 10 centímetros y agregue 10 mililitros de PBS estéril alrededor del dispositivo para evitar la evaporación del medio. Transfiera el plato de cultivo a una incubadora para el cultivo de triple célula.
El dispositivo PDMS tiene una estructura de tres capas con un sitio de captura que se conecta a la cámara de referencia cultural y al canal de derivación. La diferencia en la resistencia al flujo entre la cámara de cultivo y el canal de derivación permite que la celda fluya hacia la posición de captura, lo que hace que la siguiente celda pase a través del canal de derivación al siguiente sitio de captura. El paso de reflujo se utiliza para liberar la celda del sitio de captura y enviarla a la cámara de cultivo.
La eficiencia de captura de celdas de este protocolo se evaluó en tres tipos de células diferentes. Células endoteliales linfáticas humanas, o LECs, células T2.6 de carcinoma de células escamosas orales humanas que expresan ARN de horquilla corto específico de WNT5B y células de control vectorial pLKO-GFP. Las eficiencias de captura de una sola célula de las tres células demostradas fueron aproximadamente del 71% para los LEC, del 74% para las células WNT5B sh4 y del 78% para las células pLKO-GFP.
La eficiencia de captura de tres células individuales fue del 48%Este método se puede utilizar para múltiples co-cultivos de una sola célula de células endoteliales linfáticas y células cancerosas escamosas, y la proliferación y morfología de la célula se puede observar bajo un microscopio. Es importante asegurarse de que las suspensiones de celda preparadas tengan agregados de celda mínimos, ya que los agregados de celda no solo reducen la eficiencia de emparejamiento único, sino que también pueden obstruir los microprocesos. La interacción celda-célula entre celdas individuales desempeña un papel importante en el control de los comportamientos de las células.
Nuestro método puede proporcionar una herramienta eficiente para ayudar a los investigadores a estudiar la interacción célula-célula a un solo nivel celular, lo que puede conducir al descubrimiento de nuevos mecanismos que no se pueden obtener fácilmente de estudios basados en la población.
