Los autores desean agradecer a Cui Chao, Piso de Kort, Stoop Esther y Carvalho para las imágenes de Ralph en la Figura 4, Nehrdich Ulrike y Davy de Witt para el cuidado de los peces, y otros miembros del laboratorio útil para los debates. Este trabajo es apoyado por el Programa Smart Mix del Ministerio holandés de Asuntos Económicos y el Ministerio de Educación, Cultura y Ciencia, la Comisión Europea séptimo proyecto marco ZF-SALUD (SALUD-F4-2010-242048), la Unión Europea Marie Curie- Red de Formación Inicial FishForPharma (PITN-GA-2011 a 289209), y por el NHMRC Australia (637.394). El australiano Instituto de Medicina Regenerativa con el apoyo de subvenciones del Gobierno del Estado de Victoria y el Gobierno de Australia.

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N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+tolerance+in+replicating+mycobacteria+mediated+by+a+macrophage-induced+efflux+mechanism.">Drug tolerance in replicating mycobacteria mediated by a macrophage-induced efflux mechanism.</a> Cell. 145, 39-53 (2011).</li><li>Ellett, F. L., Lieschke, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computational+quantification+of+fluorescent+leukocyte+numbers+in+zebrafish+embryos.">Computational quantification of fluorescent leukocyte numbers in zebrafish embryos.</a> Methods in Enzymology. , (2011).</li><li>Yuan, S., Sun, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+of+mRNA+and+Morpholino+Antisense+Oligonucleotides+in+Zebrafish+Embryos.">Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos.</a> J. Vis. Exp. (27), e1113-e1113 (2009).</li><li>Mathias, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolution+of+inflammation+by+retrograde+chemotaxis+of+neutrophils+in+transgenic+zebrafish.">Resolution of inflammation by retrograde chemotaxis of neutrophils in transgenic zebrafish.</a> J. Leukoc. Biol. 80, 1281-1288 (2006).</li><li>Hall, C., Flores, M. V., Storm, T., Crosier, K., Crosier, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+lysozyme+C+promoter+drives+myeloid-specific+expression+in+transgenic+fish.">The zebrafish lysozyme C promoter drives myeloid-specific expression in transgenic fish.</a> BMC Dev. Biol. 7, 42-42 (2007).</li><li>Gray, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+intravital+imaging+of+macrophage+and+neutrophil+behaviour+during+inflammation+using+a+novel+transgenic+zebrafish.">Simultaneous intravital imaging of macrophage and neutrophil behaviour during inflammation using a novel transgenic zebrafish.</a> Thromb. Haemost. 105, 811-819 (2011).</li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Los métodos de infección se describen en este artículo se utilizan con frecuencia para estudiar la función de los genes receptores de inmunidad innata o de los genes de virulencia bacteriana 1. Los micro-inyección por vía intravenosa métodos (protocolos 5 y 6.1) se utilizan con mayor frecuencia para este tipo de estudios. La vena caudal en la isla sangre posterior es el lugar más conveniente para la inyección intravenosa de 1-día-embriones. Como la vena caudal se vuelve más difícil de penetrar en las etapas posteriores, se prefiere que el conducto de Cuvier como sitio de la inyección intravenosa de embriones en 2-3 fdd. En todos los casos es crítico para inyectar a los embriones con números consistentes de las bacterias, los cuales deben ser controlados por los inóculos de siembra de la inyección para el conteo de ufc. Los siguientes aspectos deben ser considerados para lograr inyecciones reproducibles. En primer lugar, es esencial disponer de alta calidad agujas de vidrio microcapilares inyección. Si la punta de la aguja es demasiado grande, la inyección creará un agujero punción suficientemente grande para que se produzca sangrado ylas bacterias inyectadas fluirá hacia fuera de la circulación sanguínea. En segundo lugar, las bacterias debe ser inyectado directamente en la circulación sanguínea. Si la punta de la aguja no está dentro de la vena o si se propaga de inyección de fluidos en la extensión del saco vitelino, el embrión debe ser desechado en el experimento. En tercer lugar, usando PVP40 como un portador para inyectar M. marinum ayudará en la prevención de las bacterias que se hunda en la aguja de vidrio. PVP40 mejora la homogeneidad de la suspensión, lo que resulta en inóculos más reproducible a lo largo de la duración de las inyecciones. PVP40 también puede ser usada para S. inyecciones typhimurium, pero aquí es menos importante porque el tamaño más grande y brillante de fluorescencia de las bacterias permite un control visual sobre el inóculo de la inyección durante los experimentos. Para la práctica de las inyecciones se recomienda el uso de tinte rojo de fenol (1% v / v) o 1 m esferas fluorescentes disponibles en diferentes colores (Invitrogen). Una vez que la técnica se domina, se tarda aproximadamente 30 minutES para inyectar 50-100 embriones, incluyendo el tiempo requerido para alinear los embriones en placas de agarosa y ajustando el volumen de inyección bacteriana. Mientras que las inyecciones por vía intravenosa en la isla de sangre (protocolo 5) o en el conducto de Cuvier (protocolo 6.1) son los más utilizados, las vías alternativas de infección se describen en este artículo de vídeo han demostrado ser útiles para estudiar los macrófagos y la quimiotaxis de neutrófilos (protocolos 6.2, 6.3 y 6.4), para estudiar el crecimiento de cepas bacterianas atenuadas (protocolo 6.5), y para adaptar el modelo de infección pez cebra para aplicaciones de alto rendimiento (protocolo 6.6) 4-8. Los descritos micro-inyección métodos también se pueden aplicar para las inyecciones de virus 18, 19, esporas de hongos 14, 20 o parásitos protozoarios (Maria Forlenza, comunicación personal). Una adición útil a los procedimientos de inyección descritas en este artículo de vídeo es un procedimiento descrito recientemente para la inyección subcutánea de bacterias en zebrembriones afish 21. Este procedimiento fue utilizado para estudiar la fagocitosis de las bacterias por los neutrófilos, los cuales fueron encontrados a las bacterias eficientemente engullen en las superficies del tejido pero, en contraste con los macrófagos, eran virtualmente incapaz de fagocitar bacterias después de la inyección en la sangre o en las cavidades corporales llenas de líquido. Para subcutáneos embriones inyecciones se colocan similar al de las inyecciones de cola musculares descritos en este artículo de vídeo, pero se inserta la aguja justo debajo de la piel para inyectar las bacterias sobre un somito. Es importante considerar que la microinyección es esencialmente una vía artificial de la infección. Sin embargo, los primeros embriones son altamente resistentes a la exposición externa a los patógenos bacterianos. De hecho, los ensayos de inmersión, donde los embriones se bañan en una suspensión bacteriana, no se pueden reproducir en nuestras manos 22. Mientras que algunos embriones pueden infectarse tras la inmersión, se ha observado una gran variación en las tasas de mortalidad y en el expresoión de los genes marcadores inflamatorios entre embriones individuales en dichos ensayos. Los métodos de inyección de micro-descritos en este artículo conseguir infecciones reproducibles y son particularmente útiles para estudiar las interacciones bacterianas con las células inmunes del huésped innatas. Un enfoque eficaz para cuantificar la infección bacteriana en los embriones individuales es el de analizar las imágenes fluorescentes de embriones infectados con el encargo, el software dedicado cuantificación pixel 17, 23. Este enfoque se ha demostrado que se correlaciona bien con los resultados de los recuentos cfu después de placas de embriones infectados. Del mismo modo, los cambios relativos en el número de leucocitos por embrión han sido cuantificados por análisis digital de imágenes en las líneas transgénicas de leucocitos fluoróforo reportero, este enfoque sería aplicable a la cuantificación de la respuesta del huésped a la infección leukopoietic 24. La función de los genes receptores inmunes innatas puede ser investigado eficazmente in vivo mediante la combinación de los modelos de infección descritoscon la caída morfolino. Morpholinos son oligonucleótidos sintéticos que se dirigen a los ARN antisentido específicos y reducir la expresión de los productos génicos cuando se inyectan en embriones de pez cebra 1-celulares etapa como se muestra en artículos de vídeo otros en esta revista 10, 25. En estudios desmontables morfolino, es de gran importancia que todos los grupos de embrión a comparar se realizaron correctamente antes de las inyecciones bacterianas. Esto es especialmente importante porque los embriones tienen un desarrollo del sistema inmune que hace cada vez más competente en el tiempo. Hay varias líneas de reportero transgénicos actualmente disponibles para distinguir los principales subconjuntos de inmunidad innata, los macrófagos y los neutrófilos, en embriones de pez cebra. El MPX y promotores Lyz se han utilizado para generar líneas de neutrófilos reportero 16, 26, 27, y el CSF1R (FMS) y promotores mpeg1 se utilizaron para producir reporteros macrófagos 14, 28. Mientras CSF1R (FMS) es, además, se expresa en xantóforos, mpeg1 expresión es exclusivamente en los macrófagos. Como se muestra en este artículo de vídeo, las líneas se han desarrollado recientemente mpeg1 reporteros son muy útiles para la fagocitosis por los macrófagos de imagen bacteriana.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reactivo </td><td> Proveedor </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> Rojo fenol </td><td> Sigma </td><td> P0290 </td></tr><tr><td> Glicerol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 228210 </td></tr><tr><td> Middlebrook 7H10 agar Difco </td><td> Becton, Dickinson y Compañía </td><td> 262710 </td></tr><tr><td> BBL Middlebrook OADC Enriquecimiento </td><td> Becton, Dickinson y Compañía </td><td> 211886 </td></tr><tr><td> Difco caldo Middlebrook 7H9 </td><td> Becton, Dickinson y Compañía </td><td> 271310 </td></tr><tr><td> BBL Middlebrook ADC Enriquecimiento </td><td> Becton, Dickinson y Compañía </td><td> 211887 </td></tr><tr><td> Tween 80 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P1754 </td></tr><tr><td> Polivinilpirrolidona (PVP40) </td><td> Calbiochem, Merck KGaA </td><td> 529504 </td></tr><tr><td> N &lt;/ Em&gt;-feniltiourea (PTU) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P7629 </td></tr><tr><td> Etilo 3-aminobenzoato metanosulfonato sal (tricaína) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A5040 </td></tr><tr><td> Metil celulosa </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M0387 </td></tr><tr><td> SeaPlaque agarosa (bajo punto de fusión de agarosa) </td><td> Lonza Inc. </td><td> 50100 </td></tr><tr><td> FluoSpheres (1,0 micras, rojo fluorescente (580/605)) </td><td> Invitrogen </td><td> F8821 </td></tr><tr><td> FluoSpheres (1.0 m, de color amarillo-verde fluorescente (505/515)) </td><td> Invitrogen </td><td> F8823 </td></tr></tbody></table>

infection of zebrafish embryos with intracellular bacterial pathogens

Pez cebra (Danio rerio), los embriones se utiliza cada vez más como un modelo para estudiar la función de los vertebrados del sistema inmune innato en las interacciones huésped-patógeno 1. Los principales tipos de células del sistema inmune innato, los macrófagos y neutrófilos, se desarrollan durante los primeros días de la embriogénesis antes de la maduración de los linfocitos que se requieren para las respuestas inmunitarias adaptativas. La facilidad de obtener un gran número de embriones, su accesibilidad debido a la externa para el desarrollo, la transparencia óptica de estadios embrionario y larval, una amplia gama de herramientas genéticas, los amplios recursos y colecciones de mutantes de las líneas transgénicas, el reportero se suman a la versatilidad del pez cebra modelo. Salmonella enterica serovar Typhimurium (S. typhimurium) y Mycobacterium marinum puede residir de manera intracelular en los macrófagos y se utilizan con frecuencia para estudiar las interacciones huésped-patógeno en embriones de pez cebra. Los procesos de infección de estas dospatógenos bacterianos son interesantes para comparar ya que S. la infección es aguda typhimurium y letal en un día, mientras que M. la infección es crónica marinum y se puede exponer a la etapa de larva 2, 3. El sitio de micro-inyección de bacterias en el embrión (Figura 1) determina si la infección rápidamente se convertirá sistémica o inicialmente permanecerá localizada. Una infección sistémica rápida puede ser establecido por micro-inyección de bacterias directamente en la circulación sanguínea a través de la vena caudal en la isla posterior o sangre a través del conducto de Cuvier, un canal de circulación de ancho en el saco vitelino conecta el corazón a la vasculatura tronco. En un DPF, cuando los embriones en esta etapa tienen los macrófagos phagocytically activos, pero los neutrófilos aún no han madurado, la inyección en la isla de sangre se prefiere. Para las inyecciones en el 2-3 fdd, cuando los embriones también se han desarrollado funcionales (mieloperoxidasa que produce) los neutrófilos, el conducto de Cuvier se prefiere como tque el sitio de inyección. Para estudiar la migración dirigida de las células mieloides hacia infecciones locales, las bacterias pueden ser inyectados en el músculo cola, vesícula ótica, o rombencéfalo ventrículo 4-6. Además, la notocorda, una estructura que parece ser normalmente inaccesible a las células mieloides, es altamente susceptible a la infección local 7. Una alternativa útil para aplicaciones de alto rendimiento es la inyección de bacterias en la yema de los embriones en las primeras horas después de la fecundación 8. La combinación de bacterias fluorescentes y las líneas de transgénicos de pez cebra con los macrófagos fluorescentes o neutrófilos crea condiciones ideales para la multi-color de imágenes de las interacciones huésped-patógeno. Este artículo video describe protocolos detallados para la infección por vía intravenosa y locales de los embriones de pez cebra con S. typhimurium o M. marinum bacterias y para la imagen posterior de fluorescencia de la interacción con las células del sistema inmune innato.

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Infection of Zebrafish Embryos with Intracellular Bacterial Pathogens

Embriones de pez cebra transparentes han demostrado ser útiles los ejércitos de modelo para visualizar y las interacciones funcionales de estudio entre las células inmunes y los patógenos bacterianos intracelulares, tales como<em&gt; Salmonella typhimurium</em&gt; Y<em&gt; Mycobacterium marinum</em&gt;. Micro-inyección de bacterias y multi-color de imagen de fluorescencia son técnicas esenciales que intervienen en la aplicación de pez cebra modelos embrión infección.

La infección de embriones de pez cebra con patógenos bacterianos intracelulares

Zebrafish (Danio rerio) embryos are increasingly used as a model for studying the function of the vertebrate innate immune system in host-pathogen ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

43.4K vistas.  Leiden University. Embriones de pez cebra transparentes han demostrado ser útiles los ejércitos de modelo para visualizar y las interacciones funcionales de estudio entre las células inmunes y los patógenos bacterianos intracelulares, tales como Salmonella typhimurium Y Mycobacterium marinum. Micro-inyección de bacterias y multi-color de imagen de fluorescencia son técnicas esenciales que intervienen en la aplicación de pez cebra modelos embrión infecci...