Nos gustaría dar las gracias a Jacob Solís por su ayuda en la edición de vídeo. Este trabajo fue financiado en parte por un premio CARRERA NSF DBI-0953902 a MJ Levene.

1. Animal perfusión 5 y Compensación Total de cerebro de ratón <ol><li> La longitud total del procedimiento pueden variar dependiendo de la duración de tiempo utilizado por cada etapa de deshidratación, pero en total todo el proceso puede llevarse a cabo en dos días. </li><li> Pesar ratones YFP y luego profundamente anestesiar con una inyección intraperitoneal de ketamina / xilazina (100 mg / kg: 10 mg / kg). </li><li> Confirmar un plano quirúrgico de anestesia profunda antes de proceder a la cirugía. Entrada del animal cada 5 min para ver si reacciona a un dedo del pie firme o de pinzamiento del rabo. Si el animal reacciona, una dosis suplementaria (1/3 de la dosis original) de ketamina / xilazina se requiere. </li><li> Una vez anestesiados profundamente, restringir el ratón por adhiriendo cada extremidad a un lecho quirúrgico usando una cinta de laboratorio a fin de que el ratón está en una posición supina (recumbancy dorsal), exponiendo su pecho para la cirugía. El lecho quirúrgico se hace generalmente de un metal o malla de plástico y se coloca en un fregadero o en la parte superior de un labio-pan de manera que la sangre y el fijadorresiduos pueden ser fácilmente recogidos. </li><li> Para empezar, haga una incisión debajo de la apófisis xifoides. Corte a lo largo de la base de la caja torácica con unas tijeras y pinzas y tire hacia atrás la piel como se hace el corte. Haga dos cortes a lo largo de cada lado del esternón ratón (a través de las costillas) para crear un colgajo de tejido que se mantiene lejos de la cavidad torácica con una pinza hemostática para dejar expuesto el corazón. </li><li> Insertar una aguja de 23 g en el ventrículo izquierdo del corazón y hacer una pequeña incisión en la pared muscular de la aurícula derecha para permitir que la sangre se escape. Por favor, consulte el artículo Jove 2497 de un vídeo de este procedimiento. 5 </li><li> Inmediatamente después de la aurícula derecha se corta, iniciar una perfusión con 4 ° C salina tamponada con fosfato, PBS, (pH 7,2) hasta que la sangre ya no se observa que sale de la aurícula derecha del corazón (30 - 40 ml a una velocidad de aproximadamente 5 ml / min). </li><li> Una vez que toda la sangre ha sido drenado (fluido que sale de la aurícula derecha es clara), cambia el medio de perfusión a un 4% refrigeradosPFA solución. Perfuse hasta cuerpo del ratón se vuelve notablemente rígida y fría al tacto (aprox. 30 - 40 ml a una velocidad de aproximadamente 5 ml / min). (Concentrado 16% PFA solución se diluye según las instrucciones del fabricante y se añade NaOH hasta pH 7,2 se alcanza. Use guantes y bata de laboratorio y manipular y mezclar sustancias químicas dentro de una campana de extracción). </li><li> Después de la perfusión, quitar el ratón desde el lecho quirúrgico y decapitar a comenzar la escisión del cerebro. </li><li> Con unas pinzas y tijeras iris, retire el cráneo en pequeñas secciones a partir de la parte posterior del cráneo y seguir adelante. Hacer pequeños cortes cada 2 a 4 mm con las tijeras de todo el cráneo durante el uso de los fórceps para tirar cuidadosamente el hueso fuera del cerebro en pequeñas secciones. Hacer esto hasta que toda la superficie superior del cerebro está expuesto. </li><li> Impuestos Especiales del cerebro del cráneo siguiendo una de 5 mm de ancho, espátula plana y coloque en un frasco de vidrio. Sumergir en PFA al 4% durante 6 horas a 4 ° C para posterior a la fijación. </li><li> Después mensajefijación, lavar el cerebro dos veces en PBS temperatura ambiente mediante el vertido de la PFA de la ampolla de vidrio y reemplazándolo con PBS. Agitar el cerebro en solución de PBS antes de verter hacia fuera y sustituir con PBS para un segundo lavado. </li><li> Deshidratar el cerebro a temperatura ambiente por una serie graduada de etanol incubaciones (una vez en 50%, 70%, 95%, y% dos veces en 100) a 2 hr por incubación, y luego 12 h de incubación para el etanol segundo 100%, a extraer el agua del tejido fijado. Para cada incubación, verter la solución de etanol anterior desde el vial de vidrio y reemplazarla con la solución posterior hasta que el cerebro está completamente sumergida. </li><li> Después de la segunda incubación en 100% de etanol, se vierte la solución y sustituir con partes iguales de etanol y la solución de limpieza que contiene alcohol bencílico y benzoato de bencilo (1:2 vol: vol relación). Después de 2 horas de incubación, se decanta la solución y reemplazar con una solución 100% de alcohol bencílico y benzoato de bencilo (1:2 vol: vol relación). El REFRActive índice de la solución de limpieza es n = 1,54. </li><li> Una vez en Babb, el cerebro se vuelven notablemente transparente, dentro de 4 - 5 horas. Para mejores resultados de compensación, dejar el cerebro para borrar durante 6 días a temperatura ambiente mientras se protegieron de la luz brillante. </li></ol> 2. Microscopio de configuración <ol><li> Una vez que el cerebro se borra y listo para la formación de imágenes, fijarlo a la parte inferior de una placa de Petri utilizando cianoacrilato. Permitir que se seque el adhesivo antes de proceder. </li><li> Después de secar, se sumergen en el cerebro BABB y colocar la placa de Petri bajo el objetivo del microscopio para la formación de imágenes. </li><li> Nosotros usamos un microscopio multifotónica que incorpora un Mai Tai titanio zafiro láser ajustable entre 710-990 nm de longitud de onda nm de excitación. La longitud de onda de excitación se utiliza para generar señales de YFP es de 886 nm. Potencia del láser varía de 30 - 100 MW dependiendo de la profundidad de imagen. </li><li> Capturar la señal reflejada fluorescente usando un objetivo Nikon 5X (NA, 0,5) que permite grancampo de visión de imágenes (2 x 2 mm). </li><li> Se filtra la señal reflejada fluorescente utilizando un filtro de 535/50 de paso de banda y recoger usando un PMT GaAsP (H7422PA-40, Hamamatsu, Bridgewater, New Jersey). </li><li> Procesar imágenes utilizando el software ScanImage 6 a una resolución de 2048 x 2048 píxeles con una velocidad de barrido de 2 ms por línea para generar alta resolución, imágenes de YFP. </li><li> Una vez que la imagen es completa, retire el cerebro de la placa de Petri con unas pinzas y guardar en BABB protegidos de la luz para obtener imágenes de futuro. Para las muestras pegadas, eliminar el tejido mediante la ejecución de una hoja de afeitar entre el pegamento y la placa de Petri en un ángulo no mayor de 30 grados. Hemos almacenado las muestras en BABB por hasta 1 año sin deterioro visible. </li></ol> 3. Los resultados representativos Las imágenes representativas y videos mostrados aquí demuestran la alta resolución multifotónica capacidad de imagen posible gracias compensación óptica. Imágenes cerebrales completa permitepara YFP-etiquetados neuronas en las diferentes capas de la corteza y el hipocampo que sea claramente visible a una profundidad de 2 mm por debajo de la superficie del tejido. Figura 1 muestra una imagen representativa de una vista coronal correspondiente a las características anatómicas del hipocampo a 2,92 mm caudal a bregma 7. La profundidad de la formación de imágenes en la muestra fue de 1,94 mm. Parte de esta diferencia se debe a la eliminación del cerebelo en el extremo caudal del cerebro y el resto era debido a la contracción del proceso de deshidratación. Otra imagen de la pila muestra la capa V / VI neuronas piramidales de la neocorteza expresar YFP 2 mm por debajo de la superficie del tejido (Figura 2). Todas las imágenes fueron adquiridas utilizando el objetivo Nikon 5X y amplificación se realizó utilizando la función de zoom digital para adquisición de imágenes en software ScanImage. Al hacer zoom sobre la neocorteza, los axones de neuronas individuales y organismos celulares de las neuronas piramidales de la capa V de la corteza cerebral son clarosLy distinguible de hasta 1,02 mm por debajo de la superficie del tejido (Figura 3). Uso de la pila de imágenes de la Figura 3, una reconstrucción en 3D de la región neurona se realizó utilizando el software ImageJ 8 (Figura 4). La capacidad de alta resolución de MPM también nos permite presentar imágenes de las neuronas enteras e individuales. Aquí se muestra una reconstrucción de una neurona piramidal capa V de la corteza cerebral en la que los procesos individuales dendríticas son claramente visibles (Figura 5). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3848/3848fig1.jpg" /> Figura 1 Imagen representativa de una pila de imágenes 1,2 mm (0,8 - 2 mm por debajo de la superficie del tejido). De cerebro de ratón que muestra toda neocórtex y las diferentes capas del hipocampo. Características del hipocampo son visibles 1,1 mm por debajo de la superficie del tejido y se han etiquetado con el seguimientoing código:. DG = giro dentado, GrDG capa granular de la DG =, = Lmol lacunosum moleculare capa, capa molecular Mol = DG, capa = O Oriens, PoDG = polimorfo capa DG, Py = capa de células piramidales, Rad = estrato radiado 7 La imagen es de 1,8 x 1,8 mm de tamaño, barra de escala = 200 m. El extremo rostral del cerebro se fijó a una placa de Petri con el extremo caudal hacia arriba hacia el objetivo. Esto facilitó formación de imágenes en el plano coronal. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3848/3848fig2.jpg" /> Figura 2 Marco Representante de la pila de imagen de 1,2 mm (0,8 - 2 mm por debajo de la superficie del tejido). Conjunto de cerebro de ratón destacando el neocórtex. Células piramidales y procesos que expresan YFP en la capa V / VI de la corteza son visibles 2 mm por debajo de la superficie del tejido. El grado de etiquetado es consistente con informes anteriores del etiquetado escaso en la corteza cerebral. Recuadro 9 (derecha) se amplía a partir de b<html> oxed área a la izquierda. La imagen es 1,8 x 1,8 mm de tamaño, barra de escala = 200 m (50 micras recuadro). <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3848/3848fig3.jpg" /> Figura 3. Marco representativas tomadas 774 micras debajo de la superficie del tejido de la pila de capa de imagen V neuronas piramidales de la corteza cerebral del cerebro. Stack va desde 700 micras a 1.020 micras por debajo de la superficie del tejido. Un 8x zoom digital se utiliza para capturar detalles como los procesos de calidad. Imagen es de 225 x 225 micras de tamaño, barra de escala = 20 micras. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3848/3848fig4.jpg" /> Figura 4. Imagen representativa de la reconstrucción 3D (225 x 225 x 320 micras) de la pila de la imagen en la Figura 3. Imagen es de 225 x 225 micras de tamaño, barra de escala = 28 micras. s &quot;&gt; <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/3848/3848fig5.jpg" /> Figura 5. Alta resolución de imagen reconstruida de una neurona piramidal de la capa V de la corteza cerebral usando un zoom digital de 10X. Neurona mide 485 m de largo, barra de escala = 25 m. El campo de visión para cada mosaico de imagen es de 180 micras x 180 micras. Cada baldosa está a una profundidad diferente (z-nivel). Las dendritas apicales corticales no lo hacen, en general, YFP expreso, así como el soma. Para tener tanto en el mismo campo de visión, como se muestra aquí, la potencia se redujo para minimizar la saturación de soma, lo que hace que el proceso de dimmer buen aspecto. Nuestro énfasis aquí es en la demostración de campo de vista en lugar de los detalles finos. Para revelar los detalles más finos, utilizar un zoom digital, se centran en una región sin soma, y ​​aumentar la potencia del láser.

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	<li>Parra, S. G., Chia, T. H., Zinter, J. P., Levene, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiphoton+microscopy+of+cleared+mouse+organs.">Multiphoton microscopy of cleared mouse organs.</a> J. Biomed. Opt. 15, 036017 (2010).</li><li>Vesuna, S., Torres, R., Levene, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiphoton+fluorescence,+second+harmonic+generation,+and+fluorescence+lifetime+imaging+of+whole+cleared+mouse+organs.">Multiphoton fluorescence, second harmonic generation, and fluorescence lifetime imaging of whole cleared mouse organs.</a> J. Biomed. Opt. 16, 106009 (2011).</li><li>Zucker, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+insect+and+mammalian+embryo+imaging+with+confocal+microscopy:+Morphology+and+apoptosis.">Whole insect and mammalian embryo imaging with confocal microscopy: Morphology and apoptosis.</a> Cytometry. A69, 1143-1152 (2006).</li><li>Sakhalkar, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+imaging+in+bulk+tissue+specimens+using+optical+emission+tomography:+Fluorescence+preservation+during+optical+clearing.">Functional imaging in bulk tissue specimens using optical emission tomography: Fluorescence preservation during optical clearing.</a> Phys. Med. Biol. 52, 2035-2054 (2007).</li><li>Dazai, J., Spring, S., Cahill, L. S., Henkelman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple-mouse+Neuroanatomical+Magnetic+Resonance+Imaging.">Multiple-mouse Neuroanatomical Magnetic Resonance Imaging.</a> J. Vis. Exp. (48), e2497 (2011).</li><li>Pologruto, T. A., Sabatini, B. L., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ScanImage:+flexible+software+for+operating+laser+scanning+microscopes.">ScanImage: flexible software for operating laser scanning microscopes.</a> Biomed. Eng. Online. 2, (2003).</li><li>Paxinos, G., Franklin, K. B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , (2001).</li><li>Abramoff, M. D., Magelhaes, P. J., Ram, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image+Processing+with+ImageJ.">Image Processing with ImageJ.</a> Biophotonics International. 11, 36-42 (2004).</li><li>Feng, G., Mellor, R. H., Bernstein, M., Keller-Peck, C., Nguyen, Q. T., Wallace, M., Nerbonne, J. M., Lichtman, J. W., Sanes, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Neuronal+Subsets+in+Transgenic+Mice+Expressing+Multiple+Spectral+Variants+of+GFP.">Imaging Neuronal Subsets in Transgenic Mice Expressing Multiple Spectral Variants of GFP.</a> Neuron. 28, 41-51 (2000).</li><li>Hama, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scale:+a+chemical+approach+for+fluorescence+imaging+and+reconstruction+of+transparent+mouse+brain.">Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain.</a> Nat. Neuro. 14, 1481-1488 (2011).</li></ol>

Los experimentos con animales se realizaron de conformidad con las directrices y regulaciones establecidas por el animal de Atención Institucional de la Universidad de Yale y el empleo.

Mientras estándar colorantes orgánicos son compatibles con una amplia gama de disolventes orgánicos, y por lo tanto no suponen un reto particular para la limpieza de los protocolos, las proteínas fluorescentes a menudo son menos tolerantes a los cambios en el disolvente. 4 El objetivo del presente trabajo fue superar una limitación seria de anteriores protocolos de compensación óptica donde se perdió la fluorescencia de XFPs o gravemente degradada. Las imágenes que se presentan demuestran que la fluo...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> El número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> Phosphate Buffered Saline </td><td> Sigma-Aldrich, Inc. </td><td> D8537 </td><td> 500 ml, pH 7,2 </td></tr><tr><td> Paraformaldehído </td><td> Microscopía Electrónica de Ciencias </td><td> 15710 </td><td> 10 x 10 ml, paraformaldehído al 16% </td></tr><tr><td> Alcohol de etilo </td><td> Americana Bioanalytical </td><td> AB00515-00500 </td><td> 500 ml, 200 pruebas </td></tr><tr><td> Alcohol de etilo </td><td> Productos Pharmco, Inc. </td><td> 111000190 </td><td> 1 gal., 190 pruebas </td></tr><tr><td> Alcohol bencílico </td><td> Sigma-Aldrich, Inc. </td><td> 402834 </td><td> 500 ml, 99 +% </td></tr><tr><td> Benzoato de bencilo </td><td> Sigma-Aldrich, Inc. </td><td> B6630-IL </td><td> 500 ml, ≥ 99% </td></tr><tr><td> 5X/0.5 NA objetivo </td><td> Nikon </td><td> AZ Harina Plan de 5X </td><td> 15 WD </td></tr></tbody></table>

multiphoton microscopy of cleared mouse brain expressing yfp

Microscopía multifotónica de generación armónica fluorescencia intrínseca y segundo (SHG) de órganos enteros de ratón se hace posible por ópticamente despejar el órgano antes de formación de imágenes. 1,2 Sin embargo, para los órganos que contienen las proteínas fluorescentes como GFP y YFP, protocolos ópticos de compensación que utilizan metanol deshidratación y clara usando bencil alcohol: benzoato de bencilo (BABB), mientras que no protegido de la luz 3 no preservan la señal fluorescente. El protocolo presentado aquí es una forma novedosa en la que realizar todo el órgano de compensación óptica en cerebro de ratón preservando al mismo tiempo la señal de fluorescencia de YFP expresan en las neuronas. Alterar el protocolo de intercambio de información óptica de tal manera que el órgano se deshidrata mediante una serie de etanol se ha encontrado para reducir el daño a las proteínas fluorescentes y preservar su señal fluorescente para formación de imágenes multifotónica. 4 Usando un método optimizado de compensación óptica con base de etanol y deshidratación cobro por parte BABBmientras protegida de la luz, se muestran imágenes de alta resolución multifotónica de proteína amarilla fluorescente (YFP) de expresión en las neuronas del cerebro de un ratón de más de 2 mm por debajo de la superficie del tejido.

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Multiphoton Microscopy of Cleared Mouse Brain Expressing YFP

Microscopía multifotónica de órganos enteros de ratón es posible por ópticamente despejar el órgano antes de formación de imágenes, pero no todos los protocolos de preservar la señal fluorescente de proteínas fluorescentes. El uso de un método de compensación óptica con base de etanol y alcohol bencílico deshidratación: bencil benzoato de compensación, se muestran imágenes de alta resolución multifotónica de cerebro de ratón que expresa toda YFP.

Microscopía Multiphoton de cerebro de ratón Borrado Expresando YFP

Multiphoton microscopy of intrinsic fluorescence and second harmonic generation (SHG) of whole mouse organs is made possible by optically clearing the ...

multiphoton-microscopy-of-cleared-mouse-brain-expressing-yfp

Research

JoVE Journal

Neuroscience

13.8K vistas.  Yale University. Microscopía multifotónica de órganos enteros de ratón es posible por ópticamente despejar el órgano antes de formación de imágenes, pero no todos los protocolos de preservar la señal fluorescente de proteínas fluorescentes. El uso de un método de compensación óptica con base de etanol y alcohol bencílico deshidratación: bencil benzoato de compensación, se muestran imágenes de alta resolución multifotónica de cerebro de ratón que expresa toda YFP.

Video: Multiphoton Microscopy of Cleared Mouse Brain Expressing YFP

Preparation of Mouse Brain Tissue for Immunoelectron Microscopy

Transmission electron microscopy (TEM) is extremely useful for visualizing microglial, oligodendrocytic, astrocytic, and neuronal subcellular compartments (dendrite, dendritic spine, axon, axon terminal, perikaryon), as well as their intracellular organelles and cytoskeleton, in the central nervous system at high spatial resolution. Combined with TEM, pre-embedding immunocytochemistry allows the discrimination of cellular elements with few distinctive features and identification criteria (e.g., microglial perikarya and processes, when using an antibody against the microglia-specific marker Iba1 (ionized calcium binding adaptor molecule 1; as presented here)), identifying the neurotransmitter contents of cellular elements (e.g., serotonergic) and their ultrastructural localization of soluble or membrane-bound proteins (e.g., 5 HT1A and EphA4 receptors). Here, we describe a protocol for transcardiac perfusion of mice with acrolein fixative, removal and sectioning of the brain, as well as immunoperoxidase-diaminobenzidine (DAB) staining, resin embedding, and ultrathin sectioning of the brain sections. Upon completion of these procedures, the immunostained material is ready for examination with TEM. When rigorously performed, this technique provides an excellent compromise between optimal ultrastructural preservation and immunocytochemical detection.

We describe a protocol for transcardiac perfusion of mice, removal and sectioning of the brain, as well as immunoperoxidase staining, resin embedding, and ultrathin sectioning of the brain sections. Upon completion of these procedures, the immunostained material is ready for examination with transmission electron microscopy.

Preparación del tejido de cerebro de ratón para inmunomicroscopía

Transmission electron microscopy (TEM) is extremely useful for visualizing microglial, oligodendrocytic, astrocytic, and neuronal subcellular compartments ...

Investigación

Neurociencias

Intravital Microscopy of the Mouse Brain Microcirculation using a Closed Cranial Window

This experimental model was designed to assess the mouse pial microcirculation during acute and chronic, physiological and pathophysiological hemodynamic, inflammatory and metabolic conditions, using in vivo fluorescence microscopy. A closed cranial window is placed over the left parieto-occipital cortex of the mice. Local microcirculation is recorded in real time through the window using epi and fluorescence illumination, and measurements of vessels diameters and red blood cell (RBC) velocities are performed. RBC velocity is measured using real-time cross-correlation and/or fluorescent-labeled erythrocytes. Leukocyte and platelet adherence to pial vessels and assessment of perfusion and vascular leakage are made with the help of fluorescence-labeled markers such as Albumin-FITC and anti-CD45-TxR antibodies. Microcirculation can be repeatedly video-recorded over several days. We used for the first time the close window brain intravital microscopy to study the pial microcirculation to follow dynamic changes during the course of Plasmodium berghei ANKA infection in mice and show that expression of CM is associated with microcirculatory dysfunctions characterized by vasoconstriction, profound decrease in blood flow and eventually vascular collapse.

Intravital microscopy to follow temporal and spatial hemodynamic and inflammatory events in the pial microcirculation.

Microscopia intravital de la microcirculación del cerebro del ratón con una ventana craneal cerrado

This experimental model was designed to assess the mouse pial microcirculation during acute and chronic, physiological and pathophysiological hemodynamic, ...

Focussed Ion Beam Milling and Scanning Electron Microscopy of Brain Tissue

This protocol describes how biological samples, like brain tissue, can be imaged in three dimensions using the focussed ion beam/scanning electron microscope (FIB/SEM). The samples are fixed with aldehydes, heavy metal stained using osmium tetroxide and uranyl acetate. They are then dehydrated with alcohol and infiltrated with resin, which is then hardened. Using a light microscope and ultramicrotome with glass knives, a small block containing the region interest close to the surface is made. The block is then placed inside the FIB/SEM, and the ion beam used to roughly mill a vertical face along one side of the block, close to this region. Using backscattered electrons to image the underlying structures, a smaller face is then milled with a finer ion beam and the surface scrutinised more closely to determine the exact area of the face to be imaged and milled. The parameters of the microscope are then set so that the face is repeatedly milled and imaged so that serial images are collected through a volume of the block. The image stack will typically contain isotropic voxels with dimenions as small a 4 nm in each direction. This image quality in any imaging plane enables the user to analyse cell ultrastructure at any viewing angle within the image stack.

This protocol describes how resin embedded brain tissue can be prepared and imaged in the three dimensions in the focussed ion beam, scanning electron microscope.

Haz de iones enfocado fresado y microscopía electrónica de barrido en el tejido cerebral

This protocol describes how biological samples, like brain tissue, can be imaged in three dimensions using the focussed ion beam/scanning electron ...

Isolating LacZ-expressing Cells from Mouse Inner Ear Tissues using Flow Cytometry

Isolation of specific cell types allows one to analyze rare cell populations such as stem/progenitor cells. Such an approach to studying inner ear tissues presents a unique challenge because of the paucity of cells of interest and few transgenic reporter mouse models. Here, we describe a protocol using fluorescence-conjugated probes to selectively label LacZ-positive cells from the neonatal cochleae.
The most common underlying pathology of sensorineural hearing loss is the irreversible damage and loss of cochlear sensory hair cells, which are required to transduce sound waves to neural impulses. Recent evidence suggests that the murine auditory and vestibular organs harbor stem/progenitor cells that may have regenerative potential1,2. These findings warrant further investigation, including identifying specific cell types with stem/progenitor cell characteristics. The Wnt signaling pathway has been demonstrated to play a critical role in maintaining stem/progenitor cell populations in several organ systems3-7. We have recently identified Wnt-responsive Axin2-expressing cells in the neonatal cochlea, but their function is largely unknown8.
To better understand the behavior of these Wnt-responsive cells in vitro, we have developed a method of isolating Axin2-expressing cells from cochleae of Axin2-LacZ reporter mice9. Using flow cytometry to isolate Axin2-LacZ positive cells from the neonatal cochleae, we could in turn execute a variety of experiments on live cells to interrogate their behavior as stem/progenitor cells. Here, we describe in detail the steps for the microdissection of neonatal cochlea, dissociation of these tissues, labeling of the LacZ-positive cells using a fluorogenic substrate, and cell sorting. Techniques for dissociating cochleae into single cells and isolating cochlear cells via flow cytometry have been described2,10-12. We have made modifications to these techniques to establish a novel protocol to isolate LacZ-expressing cells from the neonatal cochlea.

Flow cytometry is a powerful tool allowing for the isolation and study of specific cell populations. This protocol describes steps for isolating LacZ-expressing cells from cochlear tissues from neonatal transgenic mice. Dissociated cochlear cells were labeled using fluorescent-conjugated substrates of &#946;-galactosidase prior to separation via flow cytometry.

Aislar las células que expresan LacZ de tejidos de ratón del oído interno mediante citometría de flujo

Isolation of specific cell types allows one to analyze rare cell populations such as stem/progenitor cells. Such an approach to studying inner ear tissues ...

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains technically challenging. One approach, Activation-Induced Manganese-enhanced MRI (AIM MRI), has been used successfully to map neuronal activity in rodents 1-5. In AIM MRI, Mn2+ acts a calcium analog and accumulates in depolarized neurons 6,7. Because Mn2+ shortens the T1 tissue property, regions of elevated neuronal activity will enhance in MRI. Furthermore, Mn2+ clears slowly from the activated regions; therefore, stimulation can be performed outside the magnet prior to imaging, enabling greater experimental flexibility. However, because Mn2+ does not readily cross the blood-brain barrier (BBB), the need to open the BBB has limited the use of AIM MRI, especially in mice.
One tool for opening the BBB is ultrasound. Though potentially damaging, if ultrasound is administered in combination with gas-filled microbubbles (i.e., ultrasound contrast agents), the acoustic pressure required for BBB opening is considerably lower. This combination of ultrasound and microbubbles can be used to reliably open the BBB without causing tissue damage 8-11.
Here, a method is presented for performing AIM MRI by using microbubbles and ultrasound to open the BBB. After an intravenous injection of perflutren microbubbles, an unfocused pulsed ultrasound beam is applied to the shaved mouse head for 3 minutes. For simplicity, we refer to this technique of BBB Opening with Microbubbles and UltraSound as BOMUS 12. Using BOMUS to open the BBB throughout both cerebral hemispheres, manganese is administered to the whole mouse brain. After experimental stimulation of the lightly sedated mice, AIM MRI is used to map the neuronal response.
To demonstrate this approach, herein BOMUS and AIM MRI are used to map unilateral mechanical stimulation of the vibrissae in lightly sedated mice 13. Because BOMUS can open the BBB throughout both hemispheres, the unstimulated side of the brain is used to control for nonspecific background stimulation. The resultant 3D activation map agrees well with published representations of the vibrissae regions of the barrel field cortex 14. The ultrasonic opening of the BBB is fast, noninvasive, and reversible; and thus this approach is suitable for high-throughput and/or longitudinal studies in awake mice.

A technique is described for broadly opening the blood-brain barrier in the mouse using microbubbles and ultrasound. Using this technique, manganese can be administered to the mouse brain. Because manganese is an MRI contrast agent that accumulates in depolarized neurons, this approach enables imaging of neuronal activity.

Neuroimagen Funcional Utilizando ultrasonidos hematoencefálica perturbación de la barrera y la RM-manganeso mayor

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Micron-scale Resolution Optical Tomography of Entire Mouse Brains with Confocal Light Sheet Microscopy

Understanding the architecture of mammalian brain at single-cell resolution is one of the key issues of neuroscience. However, mapping neuronal soma and projections throughout the whole brain is still challenging for imaging and data management technologies. Indeed, macroscopic volumes need to be reconstructed with high resolution and contrast in a reasonable time, producing datasets in the TeraByte range. We recently demonstrated an optical method (confocal light sheet microscopy, CLSM) capable of obtaining micron-scale reconstruction of entire mouse brains labeled with enhanced green fluorescent protein (EGFP). Combining light sheet illumination and confocal detection, CLSM allows deep imaging inside macroscopic cleared specimens with high contrast and speed. Here we describe the complete experimental pipeline to obtain comprehensive and human-readable images of entire mouse brains labeled with fluorescent proteins. The clearing and the mounting procedures are described, together with the steps to perform an optical tomography on its whole volume by acquiring many parallel adjacent stacks. We showed the usage of open-source custom-made software tools enabling stitching of the multiple stacks and multi-resolution data navigation. Finally, we illustrated some example of brain maps: the cerebellum from an L7-GFP transgenic mouse, in which all Purkinje cells are selectively labeled, and the whole brain from a thy1-GFP-M mouse, characterized by a random sparse neuronal labeling.

In this article we describe the full experimental procedure to reconstruct, with high resolution, the fine brain anatomy of fluorescently labeled mouse brains. The described protocol includes sample preparation and clearing, specimen mounting for imaging, data post-processing and multi-scale visualization.

Micron escala Resolución óptica tomografía de cerebro de ratón enteras con Hoja confocal Microscopía de Luz

Understanding the architecture of mammalian  brain at single-cell resolution is one of the key issues of neuroscience.  However, mapping neuronal soma and ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow for an in-depth characterization to identify pathways involved in these events. Cerebellar granule neurons (CGNs) that are derived from the developing cerebellum are an ideal model system that allows for morphological analyses. Here, we describe a method of how to genetically manipulate CGNs and how to study axono- and dendritogenesis of individual neurons. With this method the effects of RNA interference, overexpression or small molecules can be compared to control neurons. In addition, the rodent cerebellar cortex is an easily accessible in vivo system owing to its predominant postnatal development. We also present an in vivo electroporation technique to genetically manipulate the developing cerebella and describe subsequent cerebellar analyses to assess neuronal morphology and migration.

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Neuronal morphogenesis and migration are crucial events underlying proper brain development. Here, we describe methods to genetically manipulate cultured cerebellar granule neurons and the developing cerebellum for the assessment of morphology and migratory characteristics of neurons.

La manipulación genética de las neuronas cerebelosa gránulo<em&gt; In Vitro</em&gt; Y<em&gt; En Vivo</em&gt; Estudiar Neuronal Morfología y Migración

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of the olfactory epithelium continuously give rise to new sensory neurons that extend their axons into the olfactory bulb, where they face the challenge to integrate into existing circuitry. Because of this particular feature, the olfactory system represents a unique opportunity to monitor axonal wiring and guidance, and to investigate synapse formation. Here we describe a procedure for in vivo labeling of sensory neurons and subsequent visualization of axons in the olfactory system of larvae of the amphibian Xenopus laevis. To stain sensory neurons in the olfactory organ we adopt the electroporation technique. In vivo electroporation is an established technique for delivering fluorophore-coupled dextrans or other macromolecules into living cells. Stained sensory neurons and their axonal processes can then be monitored in the living animal either using confocal laser-scanning or multiphoton microscopy. By reducing the number of labeled cells to few or single cells per animal, single axons can be tracked into the olfactory bulb and their morphological changes can be monitored over weeks by conducting series of in vivo time lapse imaging experiments. While the described protocol exemplifies the labeling and monitoring of olfactory sensory neurons, it can also be adopted to other cell types within the olfactory and other systems.

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

We describe a protocol for in vivo labeling of olfactory sensory neurons by electroporation and subsequent confocal laser-scanning or multiphoton microscopy to visualize neuronal morphology and its development over time.

El sistema olfativo como un modelo para estudiar los patrones de crecimiento axonal y Morfología<em&gt; En Vivo</em

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of ...

Purification of Mouse Brain Vessels

In the brain, most of the vascular system consists of a selective barrier, the blood-brain barrier (BBB) that regulates the exchange of molecules and immune cells between the brain and the blood. Moreover, the huge neuronal metabolic demand requires a moment-to-moment regulation of blood flow. Notably, abnormalities of these regulations are etiological hallmarks of most brain pathologies; including glioblastoma, stroke, edema, epilepsy, degenerative diseases (ex: Parkinson&#8217;s disease, Alzheimer&#8217;s disease), brain tumors, as well as inflammatory conditions such as multiple sclerosis, meningitis and sepsis-induced brain dysfunctions. Thus, understanding the signaling events modulating the cerebrovascular physiology is a major challenge. Much insight into the cellular and molecular properties of the various cell types that compose the cerebrovascular system can be gained from primary culture or cell sorting from freshly dissociated brain tissue. However, properties such as cell polarity, morphology and intercellular relationships are not maintained in such preparations. The protocol that we describe here is designed to purify brain vessel fragments, whilst maintaining structural integrity. We show that isolated vessels consist of endothelial cells sealed by tight junctions that are surrounded by a continuous basal lamina. Pericytes, smooth muscle cells as well as the perivascular astrocyte endfeet membranes remain attached to the endothelial layer. Finally, we describe how to perform immunostaining experiments on purified brain vessels.

We describe a protocol allowing the purification of the mouse brain's vascular compartment. Isolated brain vessels include endothelial cells linked by tight junctions and surrounded by a continuous basal lamina, pericytes, vascular smooth muscle cells, as well as perivascular astroglial membranes.

La purificación de los buques de cerebro de ratón

In the brain, most of the vascular system consists of a selective barrier, the blood-brain barrier (BBB) that regulates the exchange of molecules and ...

High-Resolution 3D Imaging of Rabies Virus Infection in Solvent-Cleared Brain Tissue

The visualization of infection processes in tissues and organs by immunolabeling is a key method in modern infection biology. The ability to observe and study the distribution, tropism, and abundance of pathogens inside of organ tissues provides pivotal data on disease development and progression. Using conventional microscopy methods, immunolabeling is mostly restricted to thin sections obtained from paraffin-embedded or frozen samples. However, the limited 2D image plane of these thin sections may lead to the loss of crucial information on the complex structure of an infected organ and the cellular context of the infection. Modern multicolor, immunostaining-compatible tissue clearing techniques now provide a relatively fast and inexpensive way to study high-volume 3D image stacks of virus-infected organ tissue. By exposing the tissue to organic solvents, it becomes optically transparent. This matches the sample&#8217;s refractive indices and eventually leads to a significant reduction of light scattering. Thus, in combination with long free working distance objectives, large tissue sections up to 1 mm in size can be imaged by conventional confocal laser scanning microscopy (CLSM) at high resolution. Here, we describe a protocol to apply deep-tissue imaging after tissue clearing to visualize rabies virus distribution in infected brains in order to study topics like virus pathogenesis, spread, tropism, and neuroinvasion.

Novel, immunostaining-compatible tissue clearing techniques like the ultimate 3D imaging of solvent-cleared organs allow the 3D visualization of rabies virus brain infection and its complex cellular environment. Thick, antibody-labeled brain tissue slices are made optically transparent to increase imaging depth and to enable 3D analysis by confocal laser scanning microscopy.

Imágenes 3D de alta resolución de la infección por el virus de la rabia en el tejido cerebral con disolventes

The visualization of infection processes in tissues and organs by immunolabeling is a key method in modern infection biology. The ability to observe and ...