Esta metodología combina la mejora del protocolo de aclaramiento con la capacidad ocular de seccionamiento óptico de la tecnología PIM de Mesos permitiéndonos realizar una reconstrucciones mesoscópicas a resolución micrométrica. Proporciona la posibilidad de obtener imágenes de tejidos cardíacos masivos o de una solución completa de corazones de ratón en una sola exploración sin perder la organización tridimensional original del tejido. Después de que el corazón ha sido canulado por la aorta proximal lavada en solución de tiro y fijada en aldehído paraformado al 4% en PBS molar 0,01, está listo para comenzar el protocolo de limpieza.
Lave el corazón tres veces en PBS molar a cuatro grados centígrados durante 15 minutos. Después de este paso, el corazón se puede almacenar en PBS y azida de sodio al 0,01% a cuatro grados centígrados durante varios meses. Incubar el corazón en 20 mililitros de solución de hidrogel en condición de agitación a 15 RPM durante tres días a cuatro grados centígrados.
Desgasifique la muestra a temperatura ambiente utilizando un secador, una bomba de vacío y un sistema de tubos que conecta el secador tanto a la banda de la bomba como a la tubería de nitrógeno. Coloque la muestra en la secadora y abra el vial manteniendo la tapa en ella. Cierre la secadora y retire el oxígeno del tubo abriendo la tubería de nitrógeno.
Encienda la bomba de vacío para eliminar el oxígeno de la secadora durante 10 minutos. Apague la bomba y abra la perilla de la secadora a la tubería de nitrógeno. Luego abra el grifo de nitrógeno.
Una vez que la presión sea igual a la presión atmosférica, abra cuidadosamente el secador y cierre rápidamente el vial. Mantenga el corazón en la solución de hidrogel desgasificado a 37 grados centígrados durante aproximadamente tres horas en reposo. Cuando el hidrogel esté correctamente polimerizado y parezca completamente gelatinoso, retire con cuidado el corazón y colóquelo en una solución de aclaramiento en el vial con solución limpiadora.
Cambie la solución de limpieza en el vial una vez cada tres días para acelerar el procedimiento de clarificación. Una vez que el corazón aparezca completamente aclarado, retírelo del vial y lávelo en 50 mililitros de PBS calentado durante 24 horas en condiciones de agitación. Lavar de nuevo en 50 mililitros de un X PBS T durante 24 horas en condiciones de agitación.
Incubar la muestra en 0,01 miligramos por mililitro de germen de trigo aglutinina Alexa piso 633 en tres mililitros de un X PBS T en condición de agitación a 50 RPM a temperatura ambiente durante siete días. Después de la incubación de siete días, lavar la muestra en 50 mililitros de un X PBS T a temperatura ambiente agitando durante 24 horas. Incubar la muestra en PFA al 4% durante 15 minutos y luego lavarla tres veces en PBS molar al 0,01 durante cinco minutos cada una.
Incubar el corazón sucesivamente en 20 y 47% TDE en 0.01 PBS molar durante ocho horas cada uno. Y finalmente al 68% TDE en PBS molar 0.01 para proporcionar el índice de refracción requerido de 1.46. Llene suavemente aproximadamente el 80% del quvet de cuarzo externo con el medio de índice de refracción.
Rellene el quvet de cuarzo interno con el mismo medio de índice de refracción. Sumerja la muestra dentro del remache interno. Mueva suavemente la muestra hasta el fondo del quvet usando pinzas finas y coloque el corazón con su eje longitudinal paralelo al eje principal del quvet para minimizar la trayectoria de la luz de excitación a través del tejido durante la exploración.
Fije cuidadosamente el tapón a medida sobre el remache interno con dos tornillos. Monte la muestra en la etapa de microscopio usando imanes. Traduzca la etapa de muestra vertical manualmente para sumergir el quvet interno en el externo.
Encienda la fuente de luz de excitación con una longitud de onda de 638 nanómetros y configúrela a baja potencia del orden de tres milivatios. Mueva la muestra utilizando el traductor motorizado para iluminar una placa interna del tejido. Encienda el software de cámara en vivo de imagen HC y configure el disparador de la cámara en el modo de hoja de luz de disparo de borde externo para impulsar el disparador de adquisición de la cámara mediante el software personalizado que controla toda la configuración.
Habilite el guardado automático en el software de la cámara y configure la carpeta de salida donde se deben guardar las imágenes. Ajuste manualmente la posición de la muestra en el plano X Y con los traductores lineales para mover la muestra al centro del campo de visión del sensor de la cámara. Mueva la muestra a lo largo del eje Z utilizando el traductor motorizado lineal para identificar los bordes del corazón para la reconstrucción tomográfica.
Aumente la potencia del láser a aproximadamente 20 milivatios antes de comenzar la sesión de imágenes. Inicie la adquisición tomográfica haciendo clic en el botón de inicio en el panel de captura del software de imágenes y, al mismo tiempo, comience a mover la muestra a lo largo del eje Z a una velocidad constante de seis micrómetros por segundo utilizando el traductor motorizado. La combinación de la metodología de claridad con TDE como medio de índice de refracción no cambia significativamente el volumen final de la muestra ni conduce a una deformación isotrópica de la muestra.
La óptica de excitación produjo una lámina de luz con un desperdicio mínimo de aproximadamente seis micrómetros que divergió hasta 175 micrómetros en el borde del campo de visión. La sincronización del obturador enrollable de la cámara con el escaneo axial de los residuos de la hoja de luz aseguró recoger la señal de emisión solo en la porción de muestra excitada con el desperdicio de la hoja de luz, lo que resultó en un promedio de F W H M de aproximadamente 6.7 micrómetros a lo largo de todo el campo de visión. La función de dispersión del punto Z del microscopio también se estimó mediante una reconstrucción tomográfica de la nanoesfera fluorescente y se estimó un F W H M de 6,4 micrómetros por el ajuste.
También se confirmó la potencialidad del sistema para resolver membranas celulares individuales en tres dimensiones con una relación señal / ruido suficiente en todo el órgano. El procedimiento de desgasificación es el paso más crítico del protocolo. Si no se realiza correctamente el tejido podría encontrarse con daños indicados durante la incubación en una solución limpiadora.
El protocolo presentado se puede combinar con un protocolo de tinción múltiple para lograr una reconstrucción de órganos completos integrando diferentes estructuras biológicas y se puede aplicar para estudiar modelos patológicos.
