La metodología fue desarrollada originalmente en el laboratorio del Dr. Hongjun canción en el Instituto de Ingeniería Celular, Departamento de Neurología de la Escuela de Medicina Johns Hopkins. Este trabajo fue financiado por el NIMH (R00MH090115), NARSAD, la Orden Fraternal de la Fundación para la Investigación del Cáncer Mayo de águilas, y un paquete de puesta en marcha de la Fundación Mayo adjudicado a MHJ y Ciencia Investigación Básica del Programa a través de la Fundación Nacional de Investigación de Corea (NRF), financiado por el Ministerio de Educación, Ciencia y Tecnología (A3014385) otorgados a WRK

1. Pre-inmunohistoquímica: Perfusión e Histología <ol><li> Perfundir ratones según un protocolo transcardial generales adaptados para los ratones y extraer los cerebros en paraformaldehído al 4% (PFA) 9. </li><li> Agregar los cerebros en PFA durante la noche a 4 ° C (por ejemplo, un tubo cónico de 10 ml llena con PFA). Tenga en PFA durante al menos 12 a 24 horas, no más de 36 horas para el pleno fijación. Después de la fijación durante la noche, vaciar PFA de tubo cónico, pero dejan el cerebro por dentro. Verter 30% de sacarosa en el tubo y lavar los cerebros durante un breve 5 segundos para eliminar cualquier PFA residual. Finalmente, el tubo de llenado que contiene cerebros con 30% de sacarosa de nuevo. Mantener el cerebro en sacarosa a 4 ° C hasta que el cerebro se hunden hasta el fondo del tubo. </li><li> Cortar 40 micras secciones del cerebro en un micrótomo. Consulte a un atlas de cerebro de ratón para iniciar la recogida de las secciones desde el principio del giro dentado hasta su extremo. Preservar secciones de solución anticongelante (una receta simple es de 300 g de sacarosa en 500 ml de 0,1 M PBS y 300 ml ethileno glicol) hasta que esté listo para inmunohistoquímica. </li><li> Monte el tejido cortado en portaobjetos de microscopio específicamente diseñadas para adherirse fuertemente a los tejidos. Estas diapositivas proporcionan una fuerte influencia en el tejido durante la fase de ebullición. Después de montar el tejido, por favor, dejar secar diapositivas durante 10 min o hasta que esté completamente seco. El secado puede ser acelerado si el portaobjetos se apoyó en una superficie vertical con el borde inferior de la diapositiva en una toalla de papel. Si se está montando más de una diapositiva, el otro carro (s) se puede dejar secar durante ese tiempo (1-2 horas está bien) hasta que esté listo para proceder con el siguiente paso. </li><li> Una vez que la diapositiva está seca, lavar con PBS tres veces durante 5 minutos cada uno y seco otra vez (tampón PBS = M NaCl 0,137, 0,0027 M KCl, 0,0119 M Na 2 PO 4). Esto garantiza que la química anterior (tales como glicerol a partir de solución de almacenamiento anticongelante) se elimina suficientemente y no puede perjudicar la adherencia del tejido a la diapositiva. </li></ol> 2. Preparación de los reactivos y Minor Equipos <ol><li> Preparar Solución A (0,1 M o ácido cítrico 19,21 g / l) y la solución B (0,1 M o 24,9 g l de citrato / Tris-sodio) en la que se pueden hervir secciones de tejido. </li><li> En un cilindro graduado, combinar 9 ml de la solución A y 41 ml de la solución B. Añadir 450 ml de ddH2O a esta mezcla. </li><li> Vierta esta mezcla en un recipiente vacío (por ejemplo, una caja de puntas de pipeta de vacío) que es apto para microondas. </li></ol> 3. Inducida por calor La recuperación del antígeno <ol><li> Hervir la solución hecha en el paso 2 durante 5 minutos a la elaboración de normas en el microondas estándar. La solución se iniciará de ebullición a o por encima de 100 ° C. </li><li> Una vez que hierva, retire con cuidado el recipiente del horno de microondas y coloque las diapositivas secas en él, lo que garantiza la diapositiva-cara con secciones de hipocampo está mirando hacia abajo y totalmente expuesta al líquido. Si es posible, coloque los portaobjetos en un ángulo contra las paredes de la caja y la pila otras diapositivas que les rodean. Asegurar su &quot;encajar&quot; dentro de la caja de is apretado para las diapositivas no tienen espacio para moverse en la parte superior de uno al otro. </li><li> Hierva esta mezcla con diapositivas durante 7 minutos a los ajustes estándar en el microondas. La solución se hierve durante este tiempo en o por encima de 100 ° C. </li><li> Durante esta etapa de ebullición, llenar dos cubos de hielo hasta la mitad con hielo. </li><li> Una vez que hierva en el paso 3.3, retire el recipiente del horno de microondas y colocarlo dentro de uno de los cubos de hielo. Verter el resto del hielo desde el otro cubo de todo el recipiente y cubrir por completo. Dejar reposar durante 1 hora. </li></ol> 4. Primaria y Secundaria tinción de anticuerpos <ol><li> Al final del período de espera de 1 hora, eliminar las diapositivas desde el recipiente y lavar con TBS-T 3x tampón durante 5 min cada uno. Cualquier aparato puede ser utilizado para llevar a cabo estos lavados básicos. (Tampón TBS = Tris HCl 50 mM, NaCl 150 mM, TBS-T = 0,05% de Triton X-100 tampón TBS, TBS-TT = 4% de suero de burro tampón TBS-T). </li><li> Después del lavado, deje que los portaobjetos se sequen en un lugar oscuro ( <em&gt; Por ejemplo, dentro de un cajón de banco, coloque una toalla de papel en el interior del cajón y la inclinación de la diapositiva en contra de ella) durante 5-10 minutos o hasta que la diapositiva es totalmente seco. Durante este período, preparar una cámara para la tinción de anticuerpo primario durante la noche. Una cámara de tinción simple puede incluir un recipiente con un área superficial grande lleno de ddH2O y una etapa en el interior del recipiente, en la parte superior de la cual la corredera puede apoyarse por encima de la ddH 2 O. </li><li> Una vez que el carro se haya secado, dibuja un contorno alrededor de las secciones de tejido utilizando una pluma repelente al agua. Durante el paso 4.5, este esquema actúa como una barrera que impida la mezcla de anticuerpo que fluye sobre. </li><li> Preparar la mezcla de anticuerpo primario en TBS-TT. Por lo menos 500 l se requiere para cubrir toda una diapositiva, por ejemplo, si el anticuerpo de valores es en 1:500 concentración, añadir 1 l de anticuerpo particular, para 500 l de TBS-TT). Utilizar anticuerpos primarios como se menciona en la tabla reactivos. </li><li> Colocar el portaobjetos secos en la parte superior de la etapa en la víaaining cámara. Añadir 500 l de los anticuerpos primarios lentamente y cubrir toda la superficie. Cubra el aparato entero y envolver en papel de aluminio para bloquear la luz externa. Dejar reposar durante toda la noche a temperatura ambiente. </li><li> El día siguiente, lavar el portaobjetos tres veces durante 5 minutos cada uno con tampón TBS-T. Deje que se seque en un lugar oscuro, como se describe en el paso 4.2. </li><li> Preparar la mezcla de anticuerpo secundario similar a la etapa 4.4. Consulte la tabla de reactivos para anticuerpos secundarios. </li><li> Colocar el portaobjetos en la cámara de secado tinción como se describe en los puntos 4.2 y 4.5. Añadir 500 l de los anticuerpos secundarios lentamente y cubrir toda la superficie. Envuelva la cámara de tinción en papel de aluminio para protegerlo de la luz externa. Dejar reposar cubierto y protegido de la luz exterior durante al menos 2 horas a temperatura ambiente. </li><li> Después de la terminación de la tinción secundaria, lavar el portaobjetos tres veces durante 5 minutos cada uno con tampón TBS-T. Deje que el portaobjetos seco en una zona oscura. Después del secado, ponga solución de montaje y cubrir la diapositiva won un cubreobjetos evitando cuidadosamente toda introducción de burbujas. Deje que el portaobjetos se sientan en una zona oscura durante al menos 2 horas antes de su análisis posterior. </li><li> Realice time-lapse o análisis confocal en el tejido manchado. </li></ol>

<ol>
	<li>Ming, G. L., Song, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+neurogenesis+in+the+mammalian+central+nervous+system.">Adult neurogenesis in the mammalian central nervous system.</a> Annual Reviews of Neuroscience. 28, 223-250 (2005).</li><li>Santarelli, L., Saxe, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirement+of+hippocampal+neurogenesis+for+the+behavioral+effects+of+antidepressants.">Requirement of hippocampal neurogenesis for the behavioral effects of antidepressants.</a> Science. 301 (5634), 805-809 (2003).</li><li>Sahay, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increasing+adult+hippocampal+neurogenesis+is+sufficient+to+improve+pattern+separation.">Increasing adult hippocampal neurogenesis is sufficient to improve pattern separation.</a> Nature. 472 (7344), 466-4670 (2011).</li><li>Clelland, C. D., Choi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+functional+role+for+adult+hippocampal+neurogenesis+in+spatial+pattern+separation.">A functional role for adult hippocampal neurogenesis in spatial pattern separation.</a> Science. 325 (5937), 210-213 (2009).</li><li>Wang, J. W., David, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+fluoxetine+stimulates+maturation+and+synaptic+plasticity+of+adult-born+hippocampal+granule+cells.">Chronic fluoxetine stimulates maturation and synaptic plasticity of adult-born hippocampal granule cells.</a> Journal of Neuroscience. 28 (6), 1374-1384 (2008).</li><li>D'Amico, F., Skarmoutsou, E., Stivala, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=State+of+the+art+in+antigen+retrieval+for+immunohistochemistry.">State of the art in antigen retrieval for immunohistochemistry.</a> Journal of Immunological Methods. 341 (1-2), 1-18 (2009).</li><li>Daneshtalab, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Troubleshooting+tissue+specificity+and+antibody+selection:+Procedures+in+immunohistochemical+studies.">Troubleshooting tissue specificity and antibody selection: Procedures in immunohistochemical studies.</a> Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 61 (2), 127-135 (2010).</li><li>Jang, M. H., Bonaguidi, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secreted+frizzled-related+protein+3+regulates+activity-dependent+adult+hippocampal+neurogenesis.">Secreted frizzled-related protein 3 regulates activity-dependent adult hippocampal neurogenesis.</a> Cell Stem Cell. 12 (2), 215-223 (2013).</li><li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+Animal+Perfusion+Fixation+for+Rodents.">Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents.</a> J. Vis. Exp. (65), e3564 (2012).</li><li>Porcelli, M., Cacciapuoti, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-thermal+effects+of+microwaves+on+proteins:+Thermophilic+enzymes+as+model+system.">Non-thermal effects of microwaves on proteins: Thermophilic enzymes as model system.</a> FEBS Letters. 402 (2-3), 102-106 (1997).</li><li>Stone, J. R., Walker, S. A., Povlishock, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+visualization+of+a+new+class+of+traumatically+injured+axons+through+the+use+of+a+modified+method+of+microwave+antigen+retrieval.">The visualization of a new class of traumatically injured axons through the use of a modified method of microwave antigen retrieval.</a> Acta Neuropathologica. 97 (4), 335-346 (1999).</li></ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Los pasos más importantes para el éxito de la recuperación de antígeno y la tinción de tipos de células progenitoras son: 1) la utilización de buena perfusión y tejido fijado del espesor coronal óptima; 2) con tiempo suficiente para la ebullición y posterior enfriamiento durante la recuperación de antígenos, y 3) la destreza manual en montaje secciones coronales fijos y prevenir su daño al hacerlo. Es crítico para IHC usar tejido perfundido que ha sufrido suficiente fijación p...

La neurogénesis, la generación de nuevas neuronas a partir de células madre neurales, ahora se sabe que se producen constantemente en la edad adulta en dos regiones especializadas en el cerebro. Estos incluyen la zona subventricular (SVZ) de el bulbo olfativo y la zona subgranular (SGZ) de la circunvolución dentada en el hipocampo. Durante la última década, el campo de la neurogénesis del hipocampo adulto ha visto un trabajo importante. La región ha atraído mucho interés ya que las neuronas recién nacidas en la SGZ contribuyen a la plasticidad neuronal mejorada que puede mantener las funciones cerebrales específicas 1-5. Neurogénesis del hipocampo adulto se ha implicado a desempeñar un papel importante en la regulación del estado de ánimo, la regeneración y el aprendizaje y la memoria. Por lo tanto, ha habido un esfuerzo concertado para entender el desarrollo y la regulación de las neuronas en este rico nicho neurogénico. Un aspecto inevitable e importante de estudiar neurogénesis del hipocampo adulto es la identificación de sta separadobios que una célula madre neural activado atraviesa en su camino a convertirse en una neurona completamente funcional. En este proceso, la célula madre neural de reposo se activa y procede a través de una serie de principios activos y finales de los tipos de células progenitoras activas (Figura 1). Estas poblaciones distintas de progenitores neurales pueden ser identificadas por la morfología y su expresión de marcadores moleculares tales como MCM2, nestina, tbr2 y Doublecortin (DCX) y NeuN que guían la conversión de RGLs en sus respectivos tipos de células progenitoras. La nestina es una proteína de filamento intermedio que se expresa a través de las células de la glia-como radiales y algunos tipos de células progenitoras tempranas. Otro marcador es tbr2 que se expresa específicamente en las células progenitoras de amplificación. La expresión del transgén tbr2 está inicialmente apagada en las células de tipo 1 (radial-glia similares), activado a través de los Type-2a, progenitores-Type 2ab y Type-2b y apagó entre los más diferenciado Type-3 e inmaduroneuronas (Figura 1). DCX es un marcador de la migración neuronal que se expresa en el Tipo-2ab, Tipo-2b y Tipo-3 progenitores neurales. El uso de esta combinación de tres marcadores, podemos etiquetar subtipos distintos de progenitores neurales. Estos incluyen el tipo 1 (MCM2 + nestin + tbr2-), Tipo-2a (MCM2 + nestin + tbr2 +), Tipo-2ab (MCM2 parcial + nestin-tbr2 + y parcial MCM2 + tbr2 + DCX-), Tipo-2b ( MCM2 + + tbr2 DCX +) y Tipo-3 (MCM2 + tbr2-DCX +). Células post-mitóticas tales como las neuronas inmaduras y funcionalmente integrados pueden ser identificados mediante la utilización de DCX y el marcador neuronal maduro, NeuN. Los métodos tradicionales de IHC utilizan anticuerpos para identificar antígenos para tipos de células específicas en función de su expresión génica. La visualización posterior a través de técnicas de formación de imágenes de alta resolución tales como la microscopía confocal se puede utilizar para su identificación. Sin embargo, actualmente hay problemas que existen con estos métodos que no permiten la identificación eficaz delos tipos de células de células glia-como radiales y progenitoras tempranas. Es difícil identificar estos tipos de células particulares debido a que el anticuerpo aplicado no es capaz de penetrar y unir la proteína nestina de manera eficiente. La nestina es la proteína de filamento intermedio que comprende los procesos radiales producidas por la célula-glía como radial. La ineficiente de unión de un anticuerpo al antígeno puede ser el resultado de muchos factores, incluyendo tiempo de fijación, la temperatura y la técnica utilizada 6-7. Para ayudar a resolver estos problemas, hemos desarrollado un antígeno de recuperación o método de &quot;ebullición&quot;. Además de nestina, este método de recuperación de antígeno también mejora la tinción para otros marcadores tales como Ki67, BrdU, la proteína ácida fibrilar glial (GFAP), tbr2 y MCM2. Nuestro método combina junto enfoques químicos y físicos. Se trata de la fijación química del tejido en paraformaldehído y la posterior alta temperatura de ebullición de secciones de hipocampo coronales delgadas en un tampón de un desnaturalizante y chaotroptratamiento IC. Esto mejora la accesibilidad del antígeno al anticuerpo, mejora la especificidad del anticuerpo y permite una mejor identificación de los tipos de células progenitoras. Nuestro enfoque es simple de usar que requiere herramientas y reactivos en su mayoría ya están disponibles en el laboratorio. Hemos utilizado extensivamente para estudiar el desarrollo de las células madre neurales y su regulación a través de factores ambientales o genéticos intrínsecos extrínsecos 8.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of the reagent</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number</td>
 <td>Comments (optional)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>SuperFrost Plus Slide</td>
 <td>Fisherbrand</td>
 <td>12-550-15</td>
 <td>Provides strong adherence to hippocampal tissue during boiling</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PVA/DABCO Mounting Media</td>
 <td>Sigma Aldrich</td>
 <td>10981-100 ml</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Nestin (chicken) </td>
 <td>Aves Lab</td>
 <td>NES</td>
 <td>Neural stem cell marker</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>GFAP (rabbit)</td>
 <td>Dako North America</td>
 <td>Z033401-2</td>
 <td>Astrocyte and neural stem cell marker</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MCM2 (mouse)</td>
 <td>BD Transduction Laboratory</td>
 <td>610701</td>
 <td>Proliferation marker</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DCX (goat)</td>
 <td>Santa Cruz Biotechnology</td>
 <td>SC8066</td>
 <td>Immature neuron marker</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tbr2 (rabbit)</td>
 <td>Abcam</td>
 <td>Ab23345</td>
 <td>Amplifying progenitor marker</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NeuN (mouse)</td>
 <td>Millipore</td>
 <td>MAB377</td>
 <td>Mature neuron marker</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Cy2 (anti-rabbit)</td>
 <td>Jackson Immunoresearch</td>
 <td>111-226-047</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Cy2 (anti-chicken)</td>
 <td>Jackson Immunoresearch</td>
 <td>303-165-006</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Cy5 (anti-mouse)</td>
 <td>Jackson Immunoresearch</td>
 <td>315-175-047</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Cy5 (anti-goat)</td>
 <td>Jackson Immunoresearch</td>
 <td>305-165-047</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DAPI</td>
 <td>Life Technologies Corporation</td>
 <td>D1306</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dako Pen</td>
 <td>S2002</td>
 <td>Dako</td>
 <td>Water-repellant pen</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

heat-induced antigen retrieval: an effective method to detect and identify progenitor cell types during adult hippocampal neurogenesis

Los métodos tradicionales de inmunohistoquímica (IHC) siguientes de fijación del tejido permiten la visualización de varios tipos de células. Estos suelen proceder a la aplicación de anticuerpos para unirse a antígenos e identificar células con características que son una función de la biología y el desarrollo inherente. Neurogénesis en el hipocampo de adultos es un proceso secuencial en la que una célula madre neural de reposo puede convertirse en activa y proceder a través de las etapas de la proliferación, la diferenciación, la maduración y la integración funcional. Cada fase es distinta con una morfología característica y la regulación positiva de genes. La identificación de estas fases es importante entender los mecanismos de regulación en el juego y cualquier alteración en este proceso que subyacen en la fisiopatología de los trastornos debilitantes. Nuestro enfoque de recuperación de antígeno inducida por el calor mejora la intensidad de la señal que se detecta y permite la correcta identificación del tipo de células progenitoras. Como se discutió en estepapel, sobre todo, nos permite evitar los problemas actuales en la detección de ciertos tipos de células progenitoras.

Neurogénesis en el hipocampo de adultos es un proceso secuencial en el que el tipo de células progenitoras representante en cada etapa puede ser identificado con una combinación de marcadores. Fijación química cuidadosa y antígeno de recuperación mejora la eficacia y la accesibilidad de los marcadores que son difíciles de detectar. Uno de ellos es nestina que se expresa entre las células madre radiales-gliales como neuronales y algunos tipos de células progenitoras tempranas activos. Nestin puede ser una prote...

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Heat-Induced Antigen Retrieval: An Effective Method to Detect and Identify Progenitor Cell Types during Adult Hippocampal Neurogenesis

Durante la neurogénesis del hipocampo adulto, un conjunto distinto de marcadores genéticos se expresan cuando un reposo neuronal secuencial de células madre progresa y se desarrolla en una neurona funcionalmente integrado en el circuito. El uso de la recuperación de antígeno inducida por calor, tipos de células progenitoras que son de otro modo difíciles de detectar se identifican con una eficacia mejorada.

Heat-inducida por antígenos de recuperación: un método eficaz para detectar e identificar tipos de células progenitoras durante la neurogénesis del hipocampo adulto

Traditional  methods of immunohistochemistry (IHC) following tissue fixation allow visualization  of various cell types. These typically proceed with the ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

12.4K vistas.  Mayo Clinic College of Medicine.  Durante la neurogénesis del hipocampo adulto, un conjunto distinto de marcadores genéticos se expresan cuando un reposo neuronal secuencial de células madre progresa y se desarrolla en una neurona funcionalmente integrado en el circuito. El uso de la recuperación de antígeno inducida por calor, tipos de células progenitoras que son de otro modo difíciles de detectar se identifican con una eficacia mejorada. 

Video: Heat-Induced Antigen Retrieval: An Effective Method to Detect and Identify Progenitor Cell Types during Adult Hippocampal Neurogenesis

Growth and Differentiation of Adult Hippocampal Arctic Ground Squirrel Neural Stem Cells

Arctic ground squirrels (Urocitellus parryii, AGS) are unique in their ability to hibernate with a core body temperature near or below freezing 1. These animals also resist ischemic injury to the brain in vivo 2,3 and oxygen-glucose deprivation in vitro 4,5. These unique qualities provided the impetus to isolate AGS neurons to examine inherent neuronal characteristics that could account for the capacity of AGS neurons to resist injury and cell death caused by ischemia and extremely cold temperatures. Identifying proteins or gene targets that allow for the distinctive properties of these cells could aid in the discovery of effective therapies for a number of ischemic indications and for the study of cold tolerance. Adult AGS hippocampus contains neural stem cells that continue to proliferate, allowing for easy expansion of these stem cells in culture. We describe here methods by which researchers can utilize these stem cells and differentiated neurons for any number of purposes. By closely following these steps the AGS neural stem cells can be expanded through two passages or more and then differentiated to a culture high in TUJ1-positive neurons (~50%) without utilizing toxic chemicals to minimize the number of dividing cells. Ischemia induces neurogenesis 6 and neurogenesis which proceeds via MEK/ERK and PI3K/Akt survival signaling pathways contributes to ischemia resistance in vivo7 and in vitro 8 (Kelleher-Anderson, Drew et al., in preparation). Further characterization of these unique neural cells can advance on many fronts, using some or all of these methods.

Neural stem cells were prepared from the hippocampus of adult non-hibernating yearling Arctic ground squirrels (AGS). These neural stem cells can be expanded through numerous passages, differentiated and maintained as a nearly 50:50 neuron to glial culture.

Crecimiento y diferenciación de las células del hipocampo adulto ardilla de tierra del Ártico troncales nerviosas

Arctic ground squirrels (Urocitellus parryii, AGS) are unique in their ability to hibernate with a core body temperature near or below freezing 1. These ...

Investigación

Neurociencias

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding fundamental biological mechanisms. Striking progress has been particularly evident in Drosophila, whose extensive toolkit of mutants and transgenic lines provides a convenient model to study evolutionarily-conserved developmental and cell biological mechanisms. We are interested in understanding the mechanisms that control cell fate specification in the adult peripheral nervous system (PNS) in Drosophila. Bristles that cover the head, thorax, abdomen, legs and wings of the adult fly are individual mechanosensory organs, and have been studied as a model system for understanding mechanisms of Notch-dependent cell fate decisions. Sensory organ precursor (SOP) cells of the microchaetes (or small bristles), are distributed throughout the epithelium of the pupal thorax, and are specified during the first 12 hours after the onset of pupariation. After specification, the SOP cells begin to divide, segregating the cell fate determinant Numb to one daughter cell during mitosis. Numb functions as a cell-autonomous inhibitor of the Notch signaling pathway.
Here, we show a method to follow protein dynamics in SOP cell and its progeny within the intact pupal thorax using a combination of tissue-specific Gal4 drivers and GFP-tagged fusion proteins 1,2.This technique has the advantage over fixed tissue or cultured explants because it allows us to follow the entire development of an organ from specification of the neural precursor to growth and terminal differentiation of the organ. We can therefore directly correlate changes in cell behavior to changes in terminal differentiation. Moreover, we can combine the live imaging technique with mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) system to assess the dynamics of tagged proteins in mitotic SOPs under mutant or wildtype conditions. Using this technique, we and others have revealed novel insights into regulation of asymmetric cell division and the control of Notch signaling activation in SOP cells (examples include references 1-6,7 ,8).

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

In this video, we describe a method for live cell imaging of asymmetrically dividing sensory organ progenitor cells and epidermal cells in intact Drosophila pupae

Células vivas imágenes de células de los órganos sensoriales Precursor en Intacto Drosophila Las pupas

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

Functional Interrogation of Adult Hypothalamic Neurogenesis with Focal Radiological Inhibition

The functional characterization of adult-born neurons remains a significant challenge. Approaches to inhibit adult neurogenesis via invasive viral delivery or transgenic animals have potential confounds that make interpretation of results from these studies difficult. New radiological tools are emerging, however, that allow one to noninvasively investigate the function of select groups of adult-born neurons through accurate and precise anatomical targeting in small animals. Focal ionizing radiation inhibits the birth and differentiation of new neurons, and allows targeting of specific neural progenitor regions. In order to illuminate the potential functional role that adult hypothalamic neurogenesis plays in the regulation of physiological processes, we developed a noninvasive focal irradiation technique to selectively inhibit the birth of adult-born neurons in the hypothalamic median eminence. We describe a method for Computer tomography-guided focal irradiation (CFIR) delivery to enable precise and accurate anatomical targeting in small animals. CFIR uses three-dimensional volumetric image guidance for localization and targeting of the radiation dose, minimizes radiation exposure to nontargeted brain regions, and allows for conformal dose distribution with sharp beam boundaries. This protocol allows one to ask questions regarding the function of adult-born neurons, but also opens areas to questions in areas of radiobiology, tumor biology, and immunology. These radiological tools will facilitate the translation of discoveries at the bench to the bedside.

The function of adult-born mammalian neurons remains an active area of investigation. Ionizing radiation inhibits the birth of new neurons. Using computer tomography-guided focal irradiation (CFIR), three-dimensional anatomical targeting of specific neural progenitor populations can now be used to assess the functional role of adult neurogenesis.

Interrogatorio funcional de adultos hipotalámica neurogénesis con focal Radiológica Inhibición

The functional characterization of adult-born neurons remains a significant challenge. Approaches to inhibit adult neurogenesis via invasive viral ...

Methods for the Modulation and Analysis of NF-&#954;B-dependent Adult Neurogenesis

The hippocampus plays a pivotal role in the formation and consolidation of episodic memories, and in spatial orientation. Historically, the adult hippocampus has been viewed as a very static anatomical region of the mammalian brain. However, recent findings have demonstrated that the dentate gyrus of the hippocampus is an area of tremendous plasticity in adults, involving not only modifications of existing neuronal circuits, but also adult neurogenesis. This plasticity is regulated by complex transcriptional networks, in which the transcription factor NF-&#954;B plays a prominent role. To study and manipulate adult neurogenesis, a transgenic mouse model for forebrain-specific neuronal inhibition of NF-&#954;B activity can be used.
In this study, methods are described for the analysis of NF-&#954;B-dependent neurogenesis, including its structural aspects, neuronal apoptosis and progenitor proliferation, and cognitive significance, which was specifically assessed via a dentate gyrus (DG)-dependent behavioral test, the spatial pattern separation-Barnes maze (SPS-BM). The SPS-BM protocol could be simply adapted for use with other transgenic animal models designed to assess the influence of particular genes on adult hippocampal neurogenesis. Furthermore, SPS-BM could be used in other experimental settings aimed at investigating and manipulating DG-dependent learning, for example, using pharmacological agents.

Methods for the Modulation and Analysis of NF-&amp;#954;B-dependent Adult Neurogenesis

Methods for the manipulation and analysis of NF-&#954;B-dependent adult hippocampal neurogenesis are described. A detailed protocol is presented for a dentate gyrus-dependent behavioral test (termed the spatial pattern separation-Barnes maze) for the investigation of cognitive outcome in mice. This technique should also help enable investigations in other experimental settings.

Los métodos para la modulación y Análisis de NF-KB dependiente de la neurogénesis adulta

The hippocampus plays a pivotal role in the formation and consolidation of episodic memories, and in spatial orientation. Historically, the adult ...

Stab Wound Injury of the Zebrafish Adult Telencephalon: A Method to Investigate Vertebrate Brain Neurogenesis and Regeneration

Adult zebrafish have an amazing capacity to regenerate their central nervous system after injury. To investigate the cellular response and the molecular mechanisms involved in zebrafish adult central nervous system (CNS) regeneration and repair, we developed a zebrafish model of adult telencephalic injury.
In this approach, we manually generate an injury by pushing an insulin syringe needle into the zebrafish adult telencephalon. At different post injury days, fish are sacrificed, their brains are dissected out and stained by immunohistochemistry and/or in situ hybridization (ISH) with appropriate markers to observe cell proliferation, gliogenesis, and neurogenesis. The contralateral unlesioned hemisphere serves as an internal control. This method combined for example with RNA deep sequencing can help to screen for new genes with a role in zebrafish adult telencephalon neurogenesis, regeneration, and repair.

To shed light on the cellular and molecular mechanisms of zebrafish adult neurogenesis and regeneration, we developed a protocol for invasive surgery causing mechanical injuries in the zebrafish adult telencephalon and subsequent monitoring of changes in the stabbed hemisphere by immunohistochemistry or in situ hybridization.

Puñalada de Lesiones de la herida del pez cebra Telencéfalo adultos: un método para investigar Vertebrados Cerebro neurogénesis y Regeneración

Adult zebrafish have an amazing capacity to regenerate their central nervous system after injury. To investigate the cellular response and the molecular ...

Flow Cytometry Protocols for Surface and Intracellular Antigen Analyses of Neural Cell Types

Flow cytometry has been extensively used to define cell populations in immunology, hematology and oncology. Here, we provide a detailed description of protocols for flow cytometric analysis of the cluster of differentiation (CD) surface antigens and intracellular antigens in neural cell types. Our step-by-step description of the methodological procedures include: the harvesting of neural in vitro cultures, an optional carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)-labeling step, followed by surface antigen staining with conjugated CD antibodies (e.g., CD24, CD54), and subsequent intracellar antigen detection via primary/secondary antibodies or fluorescently labeled Fab fragments (Zenon labeling). The video demonstrates the most critical steps. Moreover, principles of experimental planning, the inclusion of critical controls, and fundamentals of flow cytometric analysis (identification of target population and exclusion of debris; gating strategy; compensation for spectral overlap) are briefly explained in order to enable neurobiologists with limited prior knowledge or specific training in flow cytometry to assess its utility and to better exploit this powerful methodology.

We provide a detailed description of a protocol for flow cytometric analysis of surface antigens and/or intracellular antigens in neural cell types. Critical aspects of experimental planning, step-by-step methodological procedures, and fundamental principles of flow cytometry are explained in order to enable neurobiologists to exploit this powerful technology.

Citometría de Flujo Protocolos de superficie y intracelular de antígenos Los análisis de los tipos de células neuronales

Flow cytometry has been extensively used to define cell populations in immunology, hematology and oncology. Here, we provide a detailed description of ...

Immunohistochemistry and Multiple Labeling with Antibodies from the Same Host Species to Study Adult Hippocampal Neurogenesis

Adult neurogenesis is a highly regulated, multi-stage process in which new neurons are generated from an activated neural stem cell via increasingly committed intermediate progenitor subtypes. Each of these subtypes expresses a set of specific molecular markers that, together with specific morphological criteria, can be used for their identification. Typically, immunofluorescent techniques are applied involving subtype-specific antibodies in combination with exo- or endogenous proliferation markers. We herein describe immunolabeling methods for the detection and quantification of all stages of adult hippocampal neurogenesis. These comprise the application of thymidine analogs, transcardial perfusion, tissue processing, heat-induced epitope retrieval, ABC immunohistochemistry, multiple indirect immunofluorescence, confocal microscopy and cell quantification. Furthermore we present&#160;a sequential multiple immunofluorescence protocol which circumvents problems usually arising from the need of using primary antibodies raised in the same host species. It allows an accurate identification of all hippocampal progenitor subtypes together with a proliferation marker within a single section. These techniques are a powerful tool to study the regulation of different progenitor subtypes in parallel, their involvement in brain pathologies and their role in specific brain functions.

This video article illustrates a comprehensive protocol to detect and quantify all stages of adult hippocampal neurogenesis within the same tissue section. We elaborated a method to overcome the limitations of indirect multiple immunofluorescence that arise when suitable antibodies from different host species are unavailable.

La inmunohistoquímica y Etiquetado múltiple con anticuerpos de la misma especie anfitrión para adultos estudio del hipocampo neurogénesis

Adult neurogenesis is a highly regulated, multi-stage process in which new neurons are generated from an activated neural stem cell via increasingly ...

Derivation of Adult Human Fibroblasts and their Direct Conversion into Expandable Neural Progenitor Cells

Generation of&#160;induced pluripotent stem cell (iPSCs) from adult skin fibroblasts and subsequent differentiation into somatic cells provides fascinating prospects for the derivation of autologous transplants that circumvent histocompatibility barriers. However, progression through a pluripotent state and subsequent complete differentiation into desired lineages remains a roadblock for the clinical translation of iPSC technology because of the associated neoplastic potential and genomic instability. Recently, we and others showed that somatic cells cannot only be converted into iPSCs but also into different types of multipotent somatic stem cells by using defined factors, thereby circumventing progression through the pluripotent state. In particular, the direct conversion of human fibroblasts into induced neural progenitor cells (iNPCs) heralds the possibility of a novel autologous cell source for various applications such as cell replacement, disease modeling and drug screening. Here, we describe the isolation of adult human primary fibroblasts by skin biopsy and their efficient direct conversion into iNPCs by timely restricted expression of Oct4, Sox2, Klf4, as well as c-Myc. Sox2-positive neuroepithelial colonies appear after 17 days of induction and iNPC lines can be established efficiently by monoclonal isolation and expansion. Precise adjustment of viral multiplicity of infection and supplementation of leukemia inhibitory factor during the induction phase represent critical factors to achieve conversion efficiencies of up to 0.2%. Thus far, patient-specific iNPC lines could be expanded for more than 12 passages and uniformly display morphological and molecular features of neural stem/progenitor cells, such as the expression of Nestin and Sox2. The iNPC lines can be differentiated into neurons and astrocytes as judged by staining against TUJ1 and GFAP, respectively. In conclusion, we report a robust protocol for the derivation and direct conversion of human fibroblasts into stably expandable neural progenitor cells that might provide a cellular source for biomedical applications such as autologous neural cell replacement and disease modeling.

Generation of induced pluripotent stem cells provides fascinating prospects for the derivation of autologous transplants. However, progression through a pluripotent state and laborious re-differentiation still hinders clinical translation. Here we describe the derivation of adult human fibroblasts and their direct conversion into induced neural progenitor cells and the subsequent differentiation into neural lineages.

Derivación de adultos fibroblastos humanos y de su conversión directa en células progenitoras neurales expandible

Generation of&#160;induced pluripotent stem cell (iPSCs) from adult skin fibroblasts and subsequent differentiation into somatic cells provides ...

Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method

This protocol is a practical guide to the N-methyl-D-glucamine (NMDG) protective recovery method of brain slice preparation. Numerous recent studies have validated the utility of this method for enhancing neuronal preservation and overall brain slice viability. The implementation of this technique by early adopters has facilitated detailed investigations into brain function using diverse experimental applications and spanning a wide range of animal ages, brain regions, and cell types. Steps are outlined for carrying out the protective recovery brain slice technique using an optimized NMDG artificial cerebrospinal fluid (aCSF) media formulation and enhanced procedure to reliably obtain healthy brain slices for patch clamp electrophysiology. With this updated approach, a substantial improvement is observed in the speed and reliability of gigaohm seal formation during targeted patch clamp recording experiments while maintaining excellent neuronal preservation, thereby facilitating challenging experimental applications. Representative results are provided from multi-neuron patch clamp recording experiments to assay synaptic connectivity in neocortical brain slices prepared from young adult transgenic mice and mature adult human neurosurgical specimens. Furthermore, the optimized NMDG protective recovery method of brain slicing is compatible with both juvenile and adult animals, thus resolving a limitation of the original methodology. In summary, a single media formulation and brain slicing procedure can be implemented across various species and ages to achieve excellent viability and tissue preservation.

Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method

This protocol demonstrates the implementation of an optimized N-methyl-D-glucamine (NMDG) protective recovery method of brain slice preparation. A single media formulation is used to reliably obtain healthy brain slices from animals of any age and for diverse experimental applications.

Preparación de rebanadas cerebrales agudas mediante un optimizado N-metil-D-glucamine recuperación protección método

This protocol is a practical guide to the N-methyl-D-glucamine (NMDG) protective recovery method of brain slice preparation. Numerous recent studies have ...

Assessing Primary Neurogenesis in Xenopus Embryos Using Immunostaining

Primary neurogenesis is a dynamic and complex process during embryonic development that sets up the initial layout of the central nervous system. During this process, a portion of neural stem cells undergo differentiation and give rise to the first populations of differentiated primary neurons within the nascent central nervous system. Several vertebrate model organisms have been used to explore the mechanisms of neural cell fate specification, patterning, and differentiation. Among these is the African clawed frog, Xenopus, which provides a powerful system for investigating the molecular and cellular mechanisms responsible for primary neurogenesis due to its rapid and accessible development and ease of embryological and molecular manipulations. Here, we present a convenient and rapid method to observe the different populations of neuronal cells within Xenopus central nervous system. Using antibody staining and immunofluorescence on sections of Xenopus embryos, we are able to observe the locations of neural stem cells and differentiated primary neurons during primary neurogenesis.

Assessing Primary Neurogenesis in Xenopus Embryos Using Immunostaining

This article presents a convenient and rapid method for visualizing different neuronal cell populations in the central nervous system of Xenopus embryos using immunofluorescent staining on sections.

La neurogénesis en la evaluación primaria<em&gt; Xenopus</em&gt; Los embriones Usando Inmunoticción

Primary neurogenesis is a dynamic and complex process during embryonic development that sets up the initial layout of the central nervous system. During ...