ברצוננו להודות לד&quot;ר ג&#39;ולי גורדון וד&quot;ר ננסי מנלי לעצות מועילות שלהם עם טכניקת התרבות. עבודה זו נתמכה על ידי הגלאוקומה הקרן לילדים ושרון-סטיוארט Aniridia אמון מחקר.

תרבות עובר עכבר: כל הליכי הניסוי נערכו בהתאם קפדן עם המכון הלאומי לבריאות ההנחיות הבאה # פרוטוקול A2010 07-119, שנבדק ואושר על ידי אוניברסיטת ג&#39;ורג&#39;יה המוסדית טיפול בבעלי חיים ועדת שימוש, השומר על פיקוח רגולטורים המשיך. 1. הכנת תרבות מדיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את מדיום תרבות באמצעות תקשורת בתאי גזע זמינה באופן מסחרי ותוספים בסכומים הבאים: נוקאאוט DMEM, החלפה בנוקאאוט סרום (KSR) (10%), N-2 מוסף (1x), אלבומין, משור הסרום (2%), פניצילין ( 50 IU / ml), סטרפטומיצין (50 מיקרוגרם / מיליליטר) וAmphotericin-B (1.25 מיקרוגרם / מיליליטר). מדיום התרבות הכין דומה לזה שתואר קודם לכן 15 עם השינויים הבאים: תוספת של אנטי mycotics ובאמצעות פעמיים הריכוז של אנטיביוטיקה (לפרטים של חומרים כימיים וציוד מסוימים, ראה ליst של חומרים). שים לב: ריכוז אנטיביוטיקה כהשתמש בעבר (. מור-סקוט, et al 15) היה מספיק לתרבויות עובר ביצעו עד 24 תקופת זמן שעה. עם זאת, כאשר התרבות נמשכה מעבר 24 שעות, שחווינו זיהום של התרבות וזה היה בשליטה בהצלחה על ידי הכפלת ריכוז האנטיביוטיקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחסן את רכיבי תקשורת על 4 מעלות צלזיוס או ב-20 מעלות צלזיוס בהתאם להמלצות יצרן. יש לאחסן KSR ו-N-2 מוסף בaliquots ב -20 מעלות צלזיוס, כדי למנוע הקפאה והפשרה חוזרות ונשנות. נוקאאוט DMEM פתח פעם אחת צריך להיות מנוצל בתוך 30 ימים לפי המלצת יצרן. לפני השימוש, לחמם את המרכיבים באמבט מים עד 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את התקשורת בתנאים סטריליים. לחטא את פני השטח של כל הציוד והבקבוקים המכילים את מרכיבי תקשורת עם 70% ספריי אלכוהול לפני הצבתי במכסת המנוע בתרבית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתן לערבב את רכיבי התקשורת או בכוס סטרילית או ישירות במערכת הסינון (קורנינג). ראשון מוסיף את אבקת אלבומין לDMEM נוקאאוט. מערבבים היטב על ידי בעדינות רועדת עד אלבומין מתמוסס לחלוטין. לאחר מכן להוסיף את תוספת N-2, KSR ואנטיביוטיקה ומערבבים היטב באמצעות pipettor. ואז לסנן לעקר את התקשורת באמצעות מסנן גודל נקבובית 0.22 מיקרומטר עם שאיבת ואקום. לוותר מדיה לתוך 50 צינורות מ&quot;ל ולאחסן בצורת חרוט על 4 מעלות צלזיוס עד לשימוש. יש להשתמש באמצעי התקשורת מוכן פעם אחת בתוך 4-5 ימים לתרבות. </li></ol> 2. הכנה של תרבות ציוד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקר את בקבוקי תרבות זכוכית ופקקי גומי. לעטוף את בקבוקי התרבות ברדיד אלומיניום ומניח את פקקי בקבוק גומי בכוס מים ולעקר ידי מעוקר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקר את חדר התרבות (Precision חממת יחידה) עם 70% ספריי אלכוהול וחם 37 מעלות צלזיוס לפני שמתחיל התרבות. חדר התרבות הוא דוארהתלוצץ עם דיסק מתגלגל במרכז שמחזיק את בקבוקי התרבות. זרימת גז לתוך התא מוסדרת על ידי מד לחץ וקצב הזרימה יכול להיות מותאם על ידי התבוננות יצוא של בועות אוויר במים בצינור זכוכית בסוף. מנגנון תרבות זו מתגלגל בקבוק הוא גרסה שונה של המכשיר המקורי שהוצג על ידי בניו וCockroft 17. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר בלון גז המכיל תערובת גז של 95% O 2/5% CO 2 לחדר התרבות ולהתאים את זרימת הגז ל&quot; בועת אוויר אחת לשנייה &quot;, שנותנת קצב זרימה של 50 סמ&quot;ק / דקה ומבטיחה אספקת חמצן נאותה לעוברי התרבות. </li></ol> 3. עובר אוסף מאוס והכנה לתרבות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לקבל עוברי עכברי סוג בר, אנחנו מנוצלים עכברים של C57BL/6J ו-CD-1 (Charles River Laboratories) זני רקע גנטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את נקבות העכברים לתקעים בנרתיק בכל יום בבוקר. בצהריים ביום של מציאת הדואר תקע נרתיק צריך להיחשב כE0.5 DPC (ימים שלאחר משגל). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף עובר עכבר בE10.5 DPC ידי הרדמת חסד העכברים בהריון הבא פרוטוקולים סטנדרטיים. עכברים מורדמים באמצעות מכשיר משאיפת CO 2 כמו שצוין על ידי האגודה האמריקנית לרפואת וטרינרית (AVMA) הנחיות להמתת החסד של בעלי חיים (2013). כדי להבטיח את המוות, נקע בצוואר הרחם בוצע לאחר החשיפה ל-CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ריסוס 70% אתנול על פני בטן הגחון, כדי למנוע הידבקות של שיער בבטן למכשירים. לאחר מכן פתח את חלל בטן ventrally באמצעות מספריים הפעלה חדים בוטים וזוג 4-3/4 בmicrodissecting מלקחיים כדי לאתר את הרחם. באמצעות 4 במלקחי microdissecting להרים את הרחם כולו ולהפריד אותו מהגוף על ידי חיתוך עם מספריים הפעלה אור בגוף הרחם ובטיפים של קרן הרחם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מהר לשטוף את הרחם כולו ב1x PBS חימם ל37 מעלות צלזיוסכדי להסיר כל דבק דם אל הרחם ואת המקום באופן מיידי בDMEM לחמם 37 מעלות צלזיוס בצלחת פטרי. לעקר את המכשירים על ידי 70% תרסיס אתנול לפני שימוש נוסף. הערה: Preheating הפתרונות כוללים PBS, DMEM ובינוני התרבות ושמירתם על 37 מעלות צלזיוס במהלך ההליך כולו מומלץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת מיקרוסקופ לנתח, הרחם צריך להיות גזור segmentally עם מספריים הפעלת אור. התוצאה היא פתחים קטנים בכל צד של הרחם המפולח דרכו פינצטה microdissecting שונה (קצוות קהה) יכולה להיות מוכנסת בעדינות כדי להרחיב את הפתח. זה מאפשר החשיפה של decidua השליה, אשר לאחר מכן ניתן להסיר בעדינות על ידי קריעה עם פינצטה microdissecting לחשוף את שק החלמון הקודקודית (פיז) עם הקרום של רייכרט. שימוש בקצה אחד של פינצטה בעדינות לנקב את הקרום של רייכרט יחד עם פיז ונפרד מן הדואר בסיסי שק חלמון קרביים (VYS) שכבה לחשוף את העוברים עם VYS ללא פגע. קונוס ectoplacental ונגזרי trophoectoderm ניתן להסיר גם עם decidua השליה או עם הקרום של רייכרט. יש להקפיד להימנע מקרע של VYS כעוברים קופצים החוצה באופן מיידי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עובר עם VYS שלם אמורים להיות מועבר לצלחת פטרי שמכילה את מדיום תרבות לחמם 37 מעלות צלזיוס באמצעות פיפטה העברה פלסטיק. הערה: העברה למדיום תרבות מייד לאחר פרידה מרחם מסייעת להתפתחות טובה יותר של העובר בתרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח קטן צריכה להתבצע בצק החלמון עם פינצטה microdissecting הימנעות כלי דם גדולים. זוג חד של פינצטה יכול לשמש כדי להפוך את הפתיחה בעדינות על ידי הפירסינג באזור סמוך לאזור הראש. לחלופין שני זוגות של פינצטה הבוטה יכולים לשמש כדי להחזיק את שק החלמון ועדינות לקרוע כדי להפוך את פתח קטן.ואז בעדינות להרחיב את הפתח על ידי הרחבת עם פינצטה לגודל פשוט מספיק כדי להתאים את הראש העוברי. הקרום השפיר העוטף את העובר באופן הדוק צריך להתנהל בעדינות מהגוף וקרוע באמצעות פינצטה. הראש העוברי ולאחר מכן את כל העובר צריך להיות exteriorized עדינות מצק החלמון, תוך שמירה על שלמות כלי הדם העוברי עם זה של שק החלמון 15. הערה: כל פגיעה בכלי דם שק החלמון עלול להשפיע על התפתחותו של העובר בתרבות. אין להשתמש בעוברים כזה עם כלי דם שניזוקו לתרבות ויכולים לשמש לאחסון הזמני העוברים אשר מאוחר יותר יכול להיות מושלך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קריטריוני היערכות עובריים: בדוק את העוברים תחת מיקרוסקופ לנתח וקבוצתי על ידי קריטריונים מורפולוגיים, כולל גוף וגודל הראש, גפיים ומורפולוגיה העין ובמה על ידי ספירת מספר somite (ות) עבור לפחות שני עוברים מכל קבוצה. &lt;strong&gt; הערה: בדרך כלל עוברים המתקבלים מהבדלי מופע ההמלטה זהים בפיתוח ברחם ושונה בגודל הגוף, תכונות מורפולוגיות ומספר somites. עם זאת, מצאנו כי עוברי מקובצים לפי הקריטריונים מורפולוגיים שלנו בדרך כלל הציגו מספר דומה somite (± 1). מסיבה זו, היא אינה נדרשת לספור somites לכל עובר כמו זה יעכב את הזמן להתחלת התרבות. שים לב: אין להשתמש בעוברים ששמשו לספור somites לתרבות. ספירת somites לאחר תחילת התרבות לעוברים אחרים על מנת למנוע את השהיית הזמן במתחיל התרבות. העוברים שעוכבו לתרבות אחרי פרידה מהרחם בדרך כלל תערוכת פיתוח עני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעביר את העוברים מייד לצלחת פטרי עם תרבות טרי בינוני לחמם 37 מעלות צלזיוס ולקחת אותו למכסת מנוע התרבות שבה עובר שוב צריך להיות מועבר לצלחת פטרי עם cultur סטריליתקשורת דואר לפני שמכניסה אותם לבקבוקי התרבות עם מדיום כדי להתחיל את התרבות. הערה: העברות תקשורת מרובות עבור העוברים לפני התרבות מסייעת במניעת זיהום כצעדים השונים של אוסף עובר ונתיחה בוצעו תחת מיקרוסקופ לנתח שלא הותקן במכסת המנוע בתרבית. הערה: כאשר גודל ההמלטה הוא גדול (&gt; 12 עוברים), חצי מעוברי התהליך ולהתחיל את התרבות או לשים אותם בצלחת עם מדיום התרבות ולמקם אותו בCO 2 באינקובטור ב 37 ° C. כאשר עוברים הושארו מחוץ לתקופות ארוכות יותר (&gt; דקות 35-40) שנצפינו קצב הלב להאט את קצב וזה ישפיע על ההתפתחות המאוחרת יותר בתרבות. </li></ol> 4. Culturing עוברי עכברים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את בקבוקי תרבות autoclaved בשכונה התרבות ולתייג אותם כמו שצריך. העברת 3 מיליליטר של מדיום תרבות לחמם 37 ° C לכל אחד tהוא בקבוקים ולאחר מכן את עוברי העכבר צריכים להיות מועברים בעדינות לתוך בקבוקי התרבות באמצעות טפטפות העברת פלסטיק סטרילית. בקבוקי התרבות אמורים להיות כתרים עם פקקי בקבוק גומי המסייעים להחזיק את בקבוקי התרבות לדיסק מתגלגל במנגנון התרבות. הערה: אפשר להכין בקבוקי התרבות עם התקשורת והניחו על הדיסק מתגלגל של מנגנון התרבות לפני והרדמת חסד העכברים. זה מקצר את הזמן להעברת עוברים לתוך בקבוקי התרבות. שימו לב: יכול להיות מתורבת עוברי עכבר בנפרד או כcocultures עם שניים או שלושה עוברים באותו בקבוק התרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בקבוקי התרבות צריכים להתבצע סביבה נקיה מחיידקים למנגנון התרבות על 37 מעלות צלזיוס והדוקות חבר אותם לחורים שבדיסק מתגלגל עם פקקי הגומי. הפעל את הדיסק מתגלגל כדי לסובב במהירות קבועה של 35 סיבובים לדקה (סל&quot;ד), המאפשרת ציפה החופשית של embryos בתקשורת וגם מסייע בחילוף גזים בחינם על ידי הרקמה העוברית. הגז מהצילינדר המחובר לחדר התרבות זורם דרך הדיסק מתגלגל ופקקי גומי לבקבוקי התרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התרבות עובר ל16-40 שעה ובאופן קבוע לבדוק את יצוא הגז וטמפרטורת חדר התרבות. הערה: מניפולציה עובר מאוס בתרבות: בואו לקבל העוברים מותאמים לתנאי התרבות לפחות 30 דקות. לאחר מכן עובר עם ביצועים נמוכים ומראה דופק חלש יכול להיות מושלך ואת העוברים שנותרו יכולים להיות מנוצל עבור מחקרי מניפולציה נוספים. ניתן לבצע מניפולציות עובר כגון 5,9,16 electroporation, microinjections 18, השתלת חרוז 16, טיפול תרופתי והליכים אחרים בשלב זה. אנחנו ביצענו בהצלחה השתלה של חרוזים agarose Affi ג&#39;ל שטופלו במולקולות איתות מסוימות כדי ללמוד את תפקידם בפיתוח העין מוקדם. העוברים לאחרניתן להחזיר מניפולציות בחזרה במדיום חדש והמשיכו בתרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף את התקשורת והתרבות לגמרי עם מדיה חדשה במרווחי זמן מסוימים לאחר שעות 9-10 ו18-19 שעות של התרבות שבה התרבות הייתה נמשכה 40 שעה. הערה: החלפת מדיה תרבות לא ייתכן שתידרש אם התרבות הוא נעצרה על ידי 16-18 שעה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדדי הצלחה בתרבות של: הישרדות עוברי בתרבות צריכה להיקבע על ידי קצב לב גלוי וזרימת דם בגוף, תוך צמיחה עוברית בתרבות צריכה להיות מוערכת על ידי עלייה בגודל גוף, מספר somite ופיתוח הצורני של ראש, גפיים, לב ועיניים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעוברים ברחם שפותח בE11.0 DPC (~ 40-41 ים) וE12.0 DPC (~ 49-50 ים) אמורים לשמש כבקרה להשוואה בין עוברים בתרבית למשך 16-18 שעות ו38-40 שעות, בהתאמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התפתחות עוברי בנקודות זמן שונות במהלך תרבות ובשלבי רחם יכולה להיות קפטןured תחת מיקרוסקופ לנתח. תוכנת ההדמיה ספוט נוצלה כדי ללכוד את התמונות ולאחר מכן תעובד באמצעות תוכנת עיבוד תמונה. </li></ol>

<ol>
	<li>Behesti, H., Holt, J. K., Sowden, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+level+of+BMP4+signaling+is+critical+for+the+regulation+of+distinct+T-box+gene+expression+domains+and+growth+along+the+dorso-ventral+axis+of+the+optic+cup.">The level of BMP4 signaling is critical for the regulation of distinct T-box gene expression domains and growth along the dorso-ventral axis of the optic cup.</a> BMC Dev. Biol. 6, 62 (2006).</li><li>Gray, J., Ross, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+tube+closure+in+mouse+whole+embryo+culture.">Neural tube closure in mouse whole embryo culture.</a> J. Vis. Exp. , (2011).</li><li>Tam, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postimplantation+mouse+development:+whole+embryo+culture+and+micro-manipulation.">Postimplantation mouse development: whole embryo culture and micro-manipulation.</a> Int. J. Dev. Biol. 42, 895-902 (1998).</li><li>Miura, S., Mishina, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-embryo+culture+of+E5.5+mouse+embryos:+development+to+the+gastrulation+stage.">Whole-embryo culture of E5.5 mouse embryos: development to the gastrulation stage.</a> Genesis. 37, 38-43 (2003).</li><li>Osumi, N., Inoue, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+transfer+into+cultured+mammalian+embryos+by+electroporation.">Gene transfer into cultured mammalian embryos by electroporation.</a> Methods. 24, 35-42 (2001).</li><li>Yokoo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+mesenchymal+stem+cells+in+rodent+whole-embryo+culture+are+reprogrammed+to+contribute+to+kidney+tissues.">Human mesenchymal stem cells in rodent whole-embryo culture are reprogrammed to contribute to kidney tissues.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 3296-3300 (2005).</li><li>Sadler, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+of+early+somite+mouse+embryos+during+organogenesis.">Culture of early somite mouse embryos during organogenesis.</a> J. Embryol. Exp. Morphol. 49, 17-25 (1979).</li><li>Kitchin, K. T., Ebron, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Further+development+of+rodent+whole+embryo+culture:+solvent+toxicity+and+water+insoluble+compound+delivery+system.">Further development of rodent whole embryo culture: solvent toxicity and water insoluble compound delivery system.</a> Toxicology. 30, 45-57 (1984).</li><li>Takahashi, M., Nomura, T., Osumi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transferring+genes+into+cultured+mammalian+embryos+by+electroporation.">Transferring genes into cultured mammalian embryos by electroporation.</a> Dev. Growth Different. 50, 485-497 (2008).</li><li>Cuthbertson, R. A., Beck, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postimplantation+whole+embryo+culture:+a+new+method+for+studying+ocular+development.">Postimplantation whole embryo culture: a new method for studying ocular development.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 31, 1653-1656 (1990).</li><li>New, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+explanted+rat+embryos+in+circulating+medium.">Development of explanted rat embryos in circulating medium.</a> J. Embryol. Exp. Morphol. 17, 513-525 (1967).</li><li>Chung, K. C., Park, J. H., Kim, C. H., Ahn, Y. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+necrosis+factor-alpha+and+phorbol+12-myristate+13-acetate+differentially+modulate+cytotoxic+effect+of+nitric+oxide+generated+by+serum+deprivation+in+neuronal+PC12+cells.">Tumor necrosis factor-alpha and phorbol 12-myristate 13-acetate differentially modulate cytotoxic effect of nitric oxide generated by serum deprivation in neuronal PC12 cells.</a> J. Neurochem. 72, 1482-1488 (1999).</li><li>Sasaoka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+a+functional+role+of+Shc+proteins+in+mitogenic+signaling+induced+by+insulin,+insulin-like+growth+factor-1,+and+epidermal+growth+factor.">Evidence for a functional role of Shc proteins in mitogenic signaling induced by insulin, insulin-like growth factor-1, and epidermal growth factor.</a> J. Biol. Chem. 269, 13689-13694 (1994).</li><li>Chotani, M. A., Mitra, S., Eid, A. H., Han, S. A., Flavahan, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+cAMP+signaling+pathways+differentially+regulate+alpha2C-adrenoceptor+expression:+role+in+serum+induction+in+human+arteriolar+smooth+muscle+cells.">Distinct cAMP signaling pathways differentially regulate alpha2C-adrenoceptor expression: role in serum induction in human arteriolar smooth muscle cells.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 288, 69-76 (2005).</li><li>Moore-Scott, B. A., Gordon, J., Blackburn, C. C., Condie, B. G., Manley, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+serum-free+in+vitro+culture+technique+for+midgestation+mouse+embryos.">New serum-free in vitro culture technique for midgestation mouse embryos.</a> Genesis. 35, 164-168 (2003).</li><li>Gordon, J., Moore, B. A., Blackburn, C. C., Manley, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum-Free+Culture+of+Mid-gestation+Mouse+Embryos:+A+Tool+for+the+Study+of+Endoderm-Derived+Organs.">Serum-Free Culture of Mid-gestation Mouse Embryos: A Tool for the Study of Endoderm-Derived Organs.</a> Methods Mol. Biol. 1092, 183-194 (2014).</li><li>New, D. A., Cockroft, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rotating+bottle+culture+method+with+continuous+replacement+of+the+gas+phase.">A rotating bottle culture method with continuous replacement of the gas phase.</a> Experientia. 35, 138-140 (1979).</li><li>Cockroft, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+in+culture+of+rat+foetuses+explanted+at+12.5+and+13.5+days+of+gestation.">Development in culture of rat foetuses explanted at 12.5 and 13.5 days of gestation.</a> J. Embryol. Exp. Morphol. 29, 473-483 (1973).</li><li>Zeeb, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacological+manipulation+of+blood+and+lymphatic+vascularization+in+ex+vivo-cultured+mouse+embryos.">Pharmacological manipulation of blood and lymphatic vascularization in ex vivo-cultured mouse embryos.</a> Nat. Protoc. 7, 1970-1982 (2012).</li><li>Wawersik, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BMP7+acts+in+murine+lens+placode+development.">BMP7 acts in murine lens placode development.</a> Dev. Biol. 207, 176-188 (1999).</li><li>Thut, C. J., Rountree, R. B., Hwa, M., Kingsley, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+large-scale+in+situ+screen+provides+molecular+evidence+for+the+induction+of+eye+anterior+segment+structures+by+the+developing+lens.">A large-scale in situ screen provides molecular evidence for the induction of eye anterior segment structures by the developing lens.</a> Dev. Biol. 231, 63-76 (2001).</li><li>Greenfield, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrogen+lowers+Alzheimer+beta-amyloid+generation+by+stimulating+trans-Golgi+network+vesicle+biogenesis.">Estrogen lowers Alzheimer beta-amyloid generation by stimulating trans-Golgi network vesicle biogenesis.</a> J. Biol. Chem. 277, 12128-12136 (2002).</li><li>Cheng, J., Dutra, A., Takesono, A., Garrett-Beal, L., Schwartzberg, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+generation+of+C57BL/6J+mouse+embryonic+stem+cells+in+a+defined+serum-free+media.">Improved generation of C57BL/6J mouse embryonic stem cells in a defined serum-free media.</a> Genesis. 39, 100-104 (2004).</li><li>Kim, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+reprogramming+of+human+neural+stem+cells+by+OCT4.">Direct reprogramming of human neural stem cells by OCT4.</a> Nature. 461, 649-643 (2009).</li><li>Totonchi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feeder-+and+serum-free+establishment+and+expansion+of+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Feeder- and serum-free establishment and expansion of human induced pluripotent stem cells.</a> Int. J. Dev. Biol. 54, 877-886 (2010).</li></ol>

אין לנו שום אינטרסים כלכליים מתחרים.

עוברי עכברים בשלב אמצע הריון היו בתרבית בתקשורת ותרבות בסרום ללא באווירה של 95% O 2/5% CO 2 במנגנון תרבות בקבוק מתגלגל על 37 ° C. הרחם לשעבר התפתחות עובר היה תלוי באופן קריטי במספר גורמים: בכל שלב במהלך ההליך מרגע שהרחם בודד מהעכברים מורדמים ועד לסיומה של התר...

במבחנה שיטות תרבות ניצול כל העוברים מתאימות גם ללמוד איתות מנגנונים המעורבים בorganogenesis העוברי שקשים אחרת לגישה ברחם. עוברים שלמים לספק את שלמות הרקמות ותמיכה מתאימה לאינטראקציות רקמות, כי הם חיוניים להתרחשות בזמן של איתות מנגנונים חיוניים לתהליכים תאיים שונים במהלך organogenesis. בעוד תרבויות עובר כולו לתת במה לשפע של יישומים, כגון לימודי השתלה, מניפולציות גנטיות ורקמות, מחקרי השתלת חרוז, מחקרי טוקסיקולוגי, וכו &#39;., מערכות תרבות עובר מנוצלים כיום הן בעיקר תלויות בסרום לצמיחה ולתחזוקה נאותות של העוברים בתרבות 1-9. הסרום נוצל כאחד המרכיבים העיקריים הנעים 10-100% מהתקשורת והתרבות 6-8, 10, 11.; עם זאת, ההרכב של סרום אינו מוגדר היטב והוא יכול להיות שונה מבעלי החיים לבעלי חיים ובכל פעם הסרום נאסף. בזמן הכנת מעבדה של סרום היא זמן רב וכרוכה בנהלים מחמירים, סרום רכש מסחרי מציג שונות רבות בקרב הרבה שונים ומעלה את עלויות ניסוי. נוסף על אלה, בסרום עשוי להכיל גורמים בלתי ידועים כגון גורמי גדילה, הורמונים, או חלבונים אחרים, אשר יכול להשפיע על התוצאה של ניסויים מסוימים, בעיקר אלה הכרוכות במחקר של מולקולות איתות חשובות באינטראקציות רקמות. מחקרים הראו כי תוספת של סרום לתרבות עלולה לשנות את הרמות תאית של מולקולות איתות מסוימות, כגון monophosphate המחזורי אדנוזין (cAMP) וחלבונים מעורבים איתות וphosphoinositide 3 mitogenic (PI 3)-kinase איתות מסלולים 12-14. בניגוד לאלה, מערכת תרבות סרום ללא מספקת את היתרונות של סביבת אנטיגן חופשי,התנזרות מאנזימים פעילים ביולוגי, שיכול לשנות את התהליכים התאיים ומאפשרת עקביות בין ניסויים. במחקר הנוכחי, אנו מנוצלים מדיום סרום ללא תרבות שהוכן מתוספי תקשורת תאי גזע זמינים באופן מסחרי לעוברי כל שלב אמצע הריון התרבות באווירה של 95% O 2/5% CO 2 במנגנון תרבות בקבוק מתגלגל על 37 ° C 15,16. עוברי עכבר בתרבית למשך 16-40 שעות בתנאים המוגדרים אלה הציגו התקדמות בפיתוח צורני של גוף ושונה מבנים עובריים הכלליים כגון לב, גפיים, מוח ועיניים המצביעים על הרמות המתאימות של התרבות תאים, נדידה, התמיינות ואינטראקציות רקמות. ניתוח מולקולרי של ההתפתחות העוברית בתרבות לאחת ממערכות האיברים מורכבות כמו העין חשף את הפיתוח העיני להיות עקבי עם זה שנצפה ברקמת העין בembryos מתפתח ברחם (Kalaskar ולודרדייל, בהכנה). כך אנו מראים כי עוברי עכבר בתרבית בשלב אמצע הריון, מפגינים צמיחה מתקדמת ופיתוח מורפולוגיים דומה לזה שנצפה בעוברים מתפתחים ברחם.

<table><tbody><tr><td>KnockOut DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>10829-018</td><td></td></tr><tr><td>KnockOut Serum Replacement</td><td>Invitrogen</td><td>10828-028</td><td></td></tr><tr><td>N-2 Supplement</td><td>Invitrogen</td><td>17502-048</td><td>Stock: 100x</td></tr><tr><td>Albumin, from Bovine Serum</td><td>Sigma</td><td>A9418-50G</td><td>Stock: 100%</td></tr><tr><td>Antibiotic - Antimycotic Solution</td><td>Cellgro</td><td>30-004-Cl</td><td>Stock: Penicillin (10,000 IU/ml); Streptomycin (10,000 &amp;micro;g/ml; Amphotericin (250 &amp;micro;g/ml)&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>DMEM&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Cellgro</td><td>15-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>Precision Incubator Unit</td><td>B.T.C. Engineering Milton Cambridge England</td><td>Id.No. 840-374</td><td></td></tr><tr><td>Glass Bottles for Rotating Unit</td><td>B.T.C. Engineering</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Silicone Rubber Cork</td><td>B.T.C. Engineering</td><td></td><td></td></tr><tr><td>95% O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;/5% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; Cylinder</td><td>AirGas Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stemi SV11 Apo Dissecting Microscope</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stemi SV6 Microscope</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; Water Jacketed Incubator</td><td>Forma Scientific</td><td>Model: 3110</td><td></td></tr><tr><td>Culture Hood</td><td>Nuaire Biological Safety Cabinets Class II TypeA2</td><td>Model: Nu-425-600</td><td></td></tr><tr><td>Water Bath</td><td>Fisher Scientific</td><td>IsoTemp205</td><td></td></tr><tr><td>Weigh Balance</td><td>Mettler Toledo</td><td>AG285</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge Tube, 50 ml</td><td>Corning</td><td>430291</td><td></td></tr><tr><td>Light Operating Scissors</td><td>Roboz</td><td>RS-6702</td><td></td></tr><tr><td>Operating Sharp-Blunt Scissors&amp;nbsp;</td><td>Roboz</td><td>RS-6812</td><td></td></tr><tr><td>Microdissecting Forceps, 4 in</td><td>Roboz</td><td>RS-5211</td><td></td></tr><tr><td>Microdissecting Forceps - Hudson (cWALD), 4-3/4 in</td><td>Roboz</td><td>RS-5237</td><td></td></tr><tr><td>Microdissecting Tweezers (5/45)</td><td>Roboz</td><td>RS-5005</td><td>Modified - Sharp ends were made blunt</td></tr><tr><td>Microdissecting Tweezers (5)</td><td>Roboz</td><td>RS-5060</td><td>Modified - Sharp ends were made blunt</td></tr><tr><td>Microdissecting Tweezers (55)</td><td>Roboz</td><td>RS-5063</td><td>Modified - Sharp ends were made blunt</td></tr><tr><td>Instrument Tray</td><td>Roboz</td><td>RT-1401S</td><td></td></tr><tr><td>Instrument Tray Lid</td><td>Roboz</td><td>RT-1401L</td><td></td></tr><tr><td>Petri Dish-100 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>087571Z</td><td></td></tr><tr><td>Petri Dish-60 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>0875713A</td><td></td></tr><tr><td>Petri Dish-35 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>0875711YZ</td><td></td></tr><tr><td>Filter System ( 0.22 &amp;micro;m Cellulose Acetate)-150 ml</td><td>Corning</td><td>431153</td><td></td></tr><tr><td>Filter System (0.22 &amp;micro;m Cellulose Acetate)-250 ml</td><td>Corning</td><td>430756</td><td></td></tr><tr><td>Filter System (0.22 &amp;micro;m Cellulose Acetate)-500 ml</td><td>Corning</td><td>430758</td><td></td></tr><tr><td>Pipet-aid Pipettor</td><td>Drummond Scientific Co.</td><td>D57849</td><td></td></tr><tr><td>Serological Pipette-10 ml</td><td>VWR</td><td>89130-898</td><td></td></tr><tr><td>Disposable Serological Pipette-25 ml</td><td>Corning</td><td>4251</td><td></td></tr><tr><td>Transfer Pipette - 7.7 ml</td><td>Thermo Scientific</td><td>202-20S</td><td></td></tr></tbody></table>

mouse embryonic development in a serum-free whole embryo culture system

עוברי עכברים בשלב אמצע הריון היו בתרבית ניצול מדיום סרום ללא תרבות שהוכן מתוספי תקשורת תאי גזע זמינים באופן מסחרי במערכת תרבות בקבוק מתגלגל מחומצן. עוברי עכברים בE10.5 בודדו בקפידה מתוך הרחם עם שק חלמון בשלמות ובתהליך כרוך תמרון כירורגית מדויק עוברי exteriorized עדינות מצק החלמון, תוך שמירה על ההמשכיות וכלי הדם של העובר עם שק החלמון. בהשוואה לעוברים מוכנים עם שק חלמון ללא פגע או עם שק החלמון הוסר, עובר אלה הוצגו שיעור הישרדות מעולה והתקדמות התפתחותית כאשר בתרבית בתנאים דומים. אנו מראים כי עוברי עכברים אלה, כאשר בתרבית במדיום מוגדר באווירה של 95% O 2/5% CO 2 במנגנון תרבות בקבוק מתגלגל ב37 מעלות צלזיוס במשך שעה 16-40, מפגינים צמיחה והתפתחות מורפולוגית להשוות העוברים מתפתחים ברחם. אנו מאמינים ההשיטה תהיה שימושית עבור חוקרי צורך לנצל תרבות עובר שלמה כדי לחקור אינטראקציות איתות חשובות בorganogenesis העוברי.

פיתוח של עוברי עכברים תלויים לשעבר רחם בגורמים רבים החל מרגע שהרחם הוא מבודד מהגוף לזמן את העוברים בתרבית. כמתואר באיור 1, ההליך כרוך בשורה של צעדים ביניהם, הפרדה של הרחם הרה להולדת מהגוף (איור 1 א), בידודו של עובר עם שק חלמון בשלמותה (איור 1),</s...

Watch this Scientific Journal Video about Mouse Embryonic Development in a Serum-free Whole Embryo Culture System at JoVE.com

Mouse Embryonic Development in a Serum-free Whole Embryo Culture System

סרום מנוצל בתרבויות עובר מכיל מרכיבים לא ידועים שיכול להשפיע על התוצאה של ניסויים במיוחד במחקרים שכלל אינטראקציות איתות. כאן אנו מנוצלים מערכת תרבות מחומצן בסרום ללא ולהראות שעוברי עכברים באמצע ההריון תרבותי ל16-40 שעה להפגין פיתוח מורפולוגיים דומה לעוברים המתפתחים ברחם.

עכבר עוברי פיתוח במערכת סרום ללא תרבות שלמה עובר

Mid-gestation stage mouse embryos were cultured utilizing a serum-free culture medium prepared from commercially available stem cell media supplements in ...

mouse-embryonic-development-serum-free-whole-embryo-culture

Research

JoVE Journal

Biology

25.8K Views.  University of Georgia.  סרום מנוצל בתרבויות עובר מכיל מרכיבים לא ידועים שיכול להשפיע על התוצאה של ניסויים במיוחד במחקרים שכלל אינטראקציות איתות. כאן אנו מנוצלים מערכת תרבות מחומצן בסרום ללא ולהראות שעוברי עכברים באמצע ההריון תרבותי ל16-40 שעה להפגין פיתוח מורפולו...

Video: Mouse Embryonic Development in a Serum-free Whole Embryo Culture System

Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Serum-free Monolayer Culture

The ability to differentiate mouse embryonic stem cells (ESC) to neural progenitors allows the study of the mechanisms controlling neural specification as well as the generation of mature neural cell types for further study. In this protocol we describe a method for the differentiation of ESC to neural progenitors using serum-free, monolayer culture. The method is scalable, efficient and results in production of ~70% neural progenitor cells within 4 - 6 days. It can be applied to ESC from various strains grown under a variety of conditions. Neural progenitors can be allowed to differentiate further into functional neurons and glia or analyzed by microscopy, flow cytometry or molecular techniques. The differentiation process is amenable to time-lapse microscopy and can be combined with the use of reporter lines to monitor the neural specification process. We provide detailed instructions on media preparation and cell density optimization to allow the process to be applied to most ESC lines and a variety of cell culture vessels.

This protocol describes in detail the method for generating neural progenitors from embryonic stem cells using a serum-free monolayer method. These progenitors can be used to derive mature neural cell types or to study the process of neural specification and is amenable to multiwell format scaling for compound screening.

בידול עצבי של תאי עכבר גזע עובריים בסרום ללא חד שכבתי תרבות

The ability to differentiate mouse embryonic stem cells (ESC) to neural progenitors allows the study of the mechanisms controlling neural specification as ...

Developmental Biology

Neural Tube Closure in Mouse Whole Embryo Culture

Genetic mouse models are an important tool in the study of mammalian neural tube closure (Gray &amp; Ross, 2009; Ross, 2010). However, the study of mouse embryos in utero is limited by our inability to directly pharmacologically manipulate the embryos in isolation from the effects of maternal metabolism on the reagent of interest. Whether using a small molecule, recombinant protein, or siRNA, delivery of these substances to the mother, through the diet or by injection will subject these unstable compounds to a variety of bodily defenses that could prevent them from reaching the embryo. Investigations in cultures of whole embryos can be used to separate maternal from intrinsic fetal effects on development.
Here, we present a method for culturing mouse embryos using highly enriched media in a roller incubator apparatus that allows for normal neural tube closure after dissection (Crockett, 1990). Once in culture, embryos can be manipulated using conventional in vitro techniques that would not otherwise be possible if the embryos were still in utero. Embryo siblings can be collected at various time points to study different aspects of neurulation, occurring from E7-7.5 (neural plate formation, just prior to the initiation of neurulation) to E9.5-10 (at the conclusion of cranial fold and caudal neuropore closure, Kaufman, 1992). In this protocol, we demonstrate our method for dissecting embryos at timepoints that are optimal for the study of cranial neurulation. Embryos will be dissected at E8.5 (approx. 10-12 somities), after the initiation of neural tube closure but prior to embryo turning and cranial neural fold closure, and maintained in culture till E10 (26-28 somities), when cranial neurulation should be complete.

A method allowing for direct pharmacological manipulation of mouse embryos during neurulation that bypasses maternal metabolism is described. The technique can be adapted to study different aspects of neurulation by varying the time point and pharmacological agent.

Tube סגירת עצבית בתרבות העובר שלם עכבר

Genetic mouse models are an important tool in the study of mammalian neural tube closure (Gray &amp; Ross, 2009; Ross, 2010).  However, the study of mouse ...

Neuroscience

Collection of Serum- and Feeder-free Mouse Embryonic Stem Cell-conditioned Medium for a Cell-free Approach

The capacity of embryonic stem cells (ESCs) and induced pluripotent stem cells (iPSCs) to generate various cell types has opened new avenues in the field of regenerative medicine. However, despite their benefits, the tumorigenic potential of ESCs and iPSCs has long been a barrier for clinical applications. Interestingly, it has been shown that ESCs produce several soluble factors that can promote tissue regeneration and delay cellular aging, suggesting that ESCs and iPSCs can also be utilized as a cell-free intervention method. Therefore, the method for harvesting mouse embryonic stem cell (mESC)-conditioned medium (mESC-CM) with minimal contamination of serum components (fetal bovine serum, FBS) and feeder cells (mouse embryonic fibroblasts, MEFs) has been highly demanded. Here, the present study demonstrates an optimized method for the collection of mESC-CM under serum- and feeder-free conditions and for the characterization of mESC-CM using senescence-associated multiple readouts. This protocol will provide a method to collect pure mESC-specific secretory factors without serum and feeder contamination.

This protocol provides a method for the collection of mouse embryonic stem cell (mESC)-conditioned medium (mESC-CM) derived from serum (fetal bovine serum, FBS)- and feeder (mouse embryonic fibroblasts, MEFs)-free conditions for a cell-free approach. It may be applicable for the treatment of aging and aging-associated diseases.

אוסף של Serum- ומזין ללא עכבר גזע עובריים בינוני מותנה-Cell לגישה Cell-חינם

The capacity of embryonic stem cells (ESCs) and induced pluripotent stem cells (iPSCs) to generate various cell types has opened new avenues in the field ...

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  the formation and patterning of brain, neural tube, somite and heart primordia. Applications of chick embryo culture include electroporation of DNA or RNA constructs in order to analyze gene function, grafts of growth factor coated beads such as FGFs and BMPs , as well as whole mount in situ hybridization and immunohistochemistry. This video demonstrates the different steps in chick embryo culture; First, the embryo is explanted in saline. Then, the embryo is centered on a glass ring. The membranes surrounding the embryo are lifted along the walls of the ring. The ring is then placed in a culture dish containing a pool of albumine. The culture dish is sealed and placed in a humid chamber, where the embryo is cultured for up to 24 hrs. Finally, the embryo is removed from the ring, fixed and processed for further applications. A troubleshooting guide is also presented.

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo New Culture

This video demonstrates New culture, a method by which chick embryos are cultured outside the egg for up to 24 hr. This method enables one to study early development (primitive streak to 14 som.), a period corresponding to E7-9 in mouse. Applications of this technique include electroporation, in situ hybridization and immunohistochemistry.

שיטת לתרבות מוקדם של עוברים צ&#39;יק לשעבר vivo (תרבות חדש)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Microinjection-based System for In Vivo Implantation of Embryonic Cardiomyocytes in the Avian Embryo

Interpreting the relative impact of cell autonomous patterning versus extrinsic microenvironmental influence on cell lineage determination represents a general challenge in developmental biology research. In the embryonic heart, this can be particularly difficult as regional differences in the expression of transcriptional regulators, paracrine/juxtacrine signaling cues, and hemodynamic force are all known to influence cardiomyocyte maturation. A simplified method to alter a developing cardiomyocyte's molecular and biomechanical microenvironment would, therefore, serve as a powerful technique to examine how local conditions influence cell fate and function. To address this, we have optimized a method to physically transplant juvenile cardiomyocytes into ectopic locations in the heart or the surrounding embryonic tissue. This allows us to examine how microenvironmental conditions influence cardiomyocyte fate transitions at single cell resolution within the intact embryo. Here, we describe a protocol in which embryonic myocytes can be isolated from a variety of cardiac sub-domains, dissociated, fluorescently labeled, and microinjected into host embryos with high precision. Cells can then be directly analyzed in situ using a variety of imaging and histological techniques. This protocol is a powerful alternative to traditional grafting experiments that can be prohibitively difficult in a moving tissue such as the heart. The general outline of this method can also be adapted to a variety of donor tissues and host environments, and its ease of use, low cost, and speed make it a potentially useful application for a variety of developmental studies.

In this method, embryonic cardiac tissues are surgically microdissected, dissociated, fluorescently labeled, and implanted into host embryonic tissues. This provides a platform for studying the individual or tissue level developmental organization under ectopic hemodynamic conditions, and/or altered paracrine/juxtacrine environments.

Microinjection-מערכת מבוססת עבור-Vivo השרשת Cardiomyocytes עובריים בתוך העובר העופות

Interpreting the relative impact of cell autonomous patterning versus extrinsic microenvironmental influence on cell lineage determination represents a ...

An ex-ovo Chicken Embryo Culture System Suitable for Imaging and Microsurgery Applications

Understanding the relationships between genetic and microenvironmental factors that drive normal and malformed embryonic development is fundamental for discovering new therapeutic strategies. Advancements in imaging technology have enabled quantitative investigation of the organization and maturing of the body plan, but later stage embryonic morphogenesis is less clear. Chicken embryos are an attractive vertebrate animal model system for this application because of its ease of culture and surgical manipulation. Early embryos can be cultured for a short time on filter paper rings, which enables complete optical access for cell patterning and fate studies1,2. Studying advanced developmental processes such as cardiac morphogenesis are traditionally performed through a window of the eggshell3-5, but this technique limits optical access due to window size. We previously developed a simple method to culture whole embryos ex-ovo on hexagonal weigh boats for up to 10 days, which enabled high resolution imaging via ultrasonography6,7. These cultures were difficult to transport, limiting the types of imaging tools available for live experiments. We here present an improved shell-less culture system with a cost-effective, portable environmental chamber. Eggs were cracked onto a hammock created by a polyurethane membrane (cling wrap) affixed circumferentially to a plastic cup partially filled with sterile water. The dimensions of the circumference and depth of the hammock were both critical to maintain surface tension, while the mechanics of the hammock and water beneath helped dampen vibrations induced by transportation. A small footprint circulating water bath was also developed to enable continuous temperature control during experimentation. We demonstrate the ability to culture embryos in this way for at least 14 days without morphogenic defect or delay and employ this system in several microsurgical and imaging applications.

An ex-ovo Chicken Embryo Culture System Suitable for Imaging and Microsurgery Applications

In this article, we present a simple methodology to enable long-term ex-ovo avian embryo culture. This technique is ideal for longitudinal experimentation requiring complete optical accessibility and/or sterile transportation in avian embryos.

לשעבר אובו העובר עוף התרבות מתאים ליישומים הדמיה microsurgery מערכת

Understanding the relationships between genetic and microenvironmental factors that drive normal and malformed embryonic development is fundamental for ...

Ex Utero Culture of Mouse Embryos from Pregastrulation to Advanced Organogenesis

Postimplantation mammalian embryo culture methods have been generally inefficient and limited to brief periods after dissection out of the uterus. Platforms have been recently developed for highly robust and prolonged ex utero culture of mouse embryos from egg-cylinder stages until advanced organogenesis. These platforms enable appropriate and faithful development of pregastrulating embryos (E5.5) until the hind limb formation stage (E11). Late gastrulating embryos (E7.5) are grown in rotating bottles in these settings, while extended culture from pregastrulation stages (E5.5 or E6.5) requires a combination of static and rotating bottle cultures. In addition, sensitive regulation of O2 and CO2 concentration, gas pressure, glucose levels, and the use of a specific ex utero culture medium are critical for proper embryo development. Here, a detailed step-by-step protocol for extended ex utero mouse embryo culture is provided. The ability to grow normal mouse embryos ex utero from gastrulation to organogenesis represents a valuable tool for characterizing the effect of different experimental perturbations during embryonic development.

Ex Utero Culture of Mouse Embryos from Pregastrulation to Advanced Organogenesis

An enhanced platform for whole-embryo culture allows continuous and robust ex utero development of postimplantation mouse embryos for up to six days, from pregastrulation stages until advanced organogenesis. In this protocol, we detail the standard procedure for successful embryo culture using static plates and rotating bottle systems.

רחם לשעבר תרבות של עוברי עכבר מ pregastrulation כדי Organogenesis מתקדם

Postimplantation mammalian embryo culture methods have been generally inefficient and limited to brief periods after dissection out of the uterus. ...

Live Imaging of Early Cardiac Progenitors in the Mouse Embryo

The first steps of heart development imply drastic changes in cell behavior and differentiation. While analysis of fixed embryos allows studying in detail specific developmental stages in a still snapshot, live imaging captures dynamic morphogenetic events, such as cell migration, shape changes, and differentiation, by imaging the embryo as it develops. This complements fixed analysis and expands the understanding of how organs develop during embryogenesis. Despite its advantages, live imaging is rarely used in mouse models because of its technical challenges. Early mouse embryos are sensitive when cultured ex vivo and require efficient handling. To facilitate a broader use of live imaging in mouse developmental research, this paper presents a detailed protocol for two-photon live microscopy that allows long-term acquisition in mouse embryos. In addition to the protocol, tips are provided on embryo handling and culture optimization. This will help understand key events in early mouse organogenesis, enhancing the understanding of cardiovascular progenitor biology.

We present a detailed protocol for mouse embryo culture and imaging that enables 3D + time imaging of cardiac progenitor cells. This video-toolkit addresses the key skills required for successful live imaging otherwise hard to acquire from text-only publications.

הדמיה חיה של אבות לב מוקדמים בעובר העכבר

The first steps of heart development imply drastic changes in cell behavior and differentiation. While analysis of fixed embryos allows studying in detail ...

Preparation of Rat Serum Suitable for Mammalian Whole Embryo Culture

Mammalian whole embryo culture (WEC) is a widely used technique for examining pharmacological toxicity in developing mouse and rat embryos and for investigating the mechanisms of developmental processes. Immediately centrifuged (IC) rat serum is commonly used for WEC and is essential for the growth and development of cultured mouse and rat embryos ex vivo. For the culture of midgestation embryos (i.e., E8.0-12.5 for the mouse, and E10.0-14.5 for the rat), 100% rat serum is the best media for supporting the growth of the embryo ex vivo. To prepare rat serum suitable for WEC, the collected blood should be centrifuged immediately to separate the blood cells from the plasma fraction. After centrifugation, the fibrin clot forms in the upper layer; this clot should be squeezed gently using a pair of sterile forceps and subsequently centrifuged to completely separate the blood cells from the serum. In this video article, we demonstrate our standard protocol for the preparation of optimal IC rat serum, including blood collection from the abdominal aorta of male rats and extraction of the serum by centrifugation.

Mammalian whole embryo culture (WEC) is widely used in teratology and developmental biology. Immediately centrifuged rat serum is commonly provided as a medium for both mouse and rat WEC. In this video, we demonstrate our standard protocol for the preparation of high-quality rat serum suitable for mammalian WEC.

הכנת סרום העכברוש מתאים לתרבות עובר שלמה יונקים

Mammalian whole embryo culture (WEC) is a widely used technique for examining pharmacological toxicity in developing mouse and rat embryos and for ...

הערכת הידבקות עוברים במודל תרבית משותפת במבחנה עם תאי אישיקאווה

Establishment of an Embryo Implantation Model In Vitro

Embryo implantation is the first step in the establishment of a successful pregnancy. An in vitro model for embryo implantation is critical for basic biological research, drug development, and screening. This paper presents a simple, rapid, and highly efficient in vitro model for embryo implantation. In this protocol, we first introduce mouse blastocyst acquisition and human endometrial adenocarcinoma cells (Ishikawa)&#160;preparation for implantation, followed by the co-culture method for mouse embryos and Ishikawa cells. Finally, we conducted a study to assess the impact of varying concentrations of 17-&#946;-estradiol (E2) and progesterone (P4) on embryo adhesion rates based on this model. Our findings revealed that high concentrations of E2 significantly reduced embryo adhesion, whereas the addition of progesterone could restore the adhesion rate. This model offers a simple and fast platform for evaluating and screening molecules involved in the adhesion process, such as cytokines, drugs, and transcription factors controlling implantation and endometrial receptivity.

מחבר זרקור: קידום אסטרטגיות טיפוליות לשיפור שיעורי ההריון על ידי ניתוח אינטראקציות עובר-אנדומטריום

This protocol describes methodologies to establish simple and efficient embryo implantation in vitro model for evaluating the relevant molecules affecting the embryo implantation process.

הקמת מודל השתלת עוברים במבחנה

Embryo implantation is the first step in the establishment of a successful pregnancy. An in vitro model for embryo implantation is critical for basic ...