Biz kültür tekniği ile onların yararlı tavsiye için Dr Julie Gordon ve Dr Nancy Manley teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma Çocuk Glokom Vakfı ve Sharon-Stewart Aniridi Araştırma Vakfı tarafından desteklenmiştir.

Fare embriyo kültürü: Tüm deneysel prosedürleri gözden ve devam düzenleyici gözetim korur Gürcistan Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi Üniversitesi tarafından onaylanan protokol # A2010 07-119, aşağıdaki sağlık kuralları National Institutes ile sıkı göre yapılmıştır. 1.. Kültür Medya hazırlanması <ol><li> KnockOut DMEM, nakavt Serum Replacement (KSR) (% 10), N-2 Supplement (1x), Albümin, İnek Serum (2%), Penisilin (: aşağıdaki miktarlarda ticari olarak temin edilebilen, kök hücre ortamı ve takviyeleri ile kültür ortamı hazırlayın 50 IU / ml), streptomisin (50 ug / ml) ve Amfoterisin-B (1.25 ug / ml). Hazırlanan kültür ortamı, daha önce, aşağıdaki değişikliklerle 15 tarif edilene benzer: antimikotik ilavesi ve özel reaktifler ve ekipman ile ilgili ayrıntılar için antibiyotik iki konsantrasyonunun (bakınız, Li kullanarakMalzemelerin st). Not: Daha önce kullanılan (. Moore-Scott, vd 15) olarak antibiyotik konsantrasyonu embriyo kültürleri 24 saatlik süre kadar taşınan için yeterli oldu. Kültür, 24 saat devam edildi ötesinde, ancak biz kültür kirlenmesini deneyimli bu başarılı bir antibiyotik konsantrasyonunun iki katına ile kontrol edilmiştir. </li><li> 4 ° C&#39;de ya da üretici tavsiyelerine uygun olarak -20 ° C &#39;de, ortam bileşenleri saklayın. KSR ve N-2 Ek tekrarlanan donma ve erime önlemek için -20 ° C&#39;de parçalar halinde muhafaza edilmelidir. Bir kez açıldı KnockOut DMEM üreticinin tavsiyesine göre 30 gün içinde kullanılmalıdır. Kullanımdan önce, 37 ° C bir su banyosu içinde bileşenleri sıcak </li><li> Steril şartlar altında ortam hazırlayın. Tüm ekipman ve kültürü kaputu koymadan önce% 70 alkol sprey ile medya bileşenleri içeren şişelerin yüzeyi dezenfekte edin. </li><li> Ortam bileşenleri steril bir beherde veya doğrudan filtre sistemi (Corning) in ya da karıştırılabilir. İlk KnockOut DMEM&#39;ye albümin tozu ekleyin. Albümin tamamen eriyene kadar hafifçe sallayarak iyice karıştırın. Daha sonra N-2 Ek, KSR ve antibiyotik eklemek ve bir pipet ile iyice karıştırın. Daha sonra vakum emme ile 0.22 um gözenek boyutlu filtre kullanılarak filtre ortamı sterilize. Kullanılana kadar 4 ° C&#39;de 50 ml konik tüp içine saklamak ve ortam dağıtın. Bir kez hazırlanan ortam kültür 4-5 gün içinde kullanılmalıdır. </li></ol> 2. Kültür Ekipmanları Hazırlanması <ol><li> Cam kültür şişeleri ve kauçuk mantarlarını sterilize edin. Bir alüminyum folyo ile kültür şişeleri sarın ve su bir beher içinde kauçuk mantarı şişe yerleştirin ve otoklav ile sterilize edilir. </li><li> Kültür başlamadan önce% 70 alkol sprey sıcak ve 37 ° C ile kültür odası (Precision Kuluçka Birimi) sterilize edin. Kültür odası ekültür şişeleri tutan merkezi bir dönme diski ile quipped. Odacık içine gaz akışı, bir basınç ölçer tarafından düzenlenir ve akış hızı sonunda bir cam tüp içinde suda hava kabarcıkları çıkış gözlemleyerek ayarlanabilir. Bu haddeleme şişe kültürü cihaz Yeni ve Cockroft 17 tarafından tanıtılan orijinal cihazının değiştirilmiş bir versiyonu. </li><li> Kültür bölmeye% 95 O 2/5% CO2 bir gaz karışımı ihtiva eden bir gaz silindiri ve 50 cc / dk &#39;lık bir akış hızı sağlar ve yeterli oksijen gitmesini sağlar &quot;saniyede bir hava kabarcığı&quot; gaz akışını ayarlamak Kültür embriyolar. </li></ol> 3. Fare Embriyo Toplama ve Kültür Hazırlık <ol><li> Yaban tip fare embriyoları elde etmek için, C57BL/6J ve CD-1 (Charles River Laboratories) genetik arka soylannın fareler kullanılmıştır. </li><li> Her gün sabah vajinal fişleri için dişi farelerin kontrol. Th bulma gün öğleE vajinal fiş E0.5 DPC (gün cinsel birleşme gönderebilir) olarak kabul edilmelidir. </li><li> Standart protokolleri izleyen hamile fareler euthanizing tarafından E10.5 DPC de fare embriyolar toplayın. Fareler Amerikan Veteriner Hekimleri Birliği (AVMA) Hayvanların Ötenazi (2013) için rehber tarafından belirtilen bir CO 2 inhalasyon cihazı kullanılarak ötenazi edildi. Ölüm sağlanması için, servikal dislokasyon CO 2 maruz kaldıktan sonra gerçekleştirilmiştir. </li><li> Araçlara abdominal saç yapışmasını önlemek için ventral karın yüzeyi üzerinde% 70 etanol püskürtün. Sonra keskin künt işletim makas ve rahim bulmak için forseps Microdissecting içinde 4-3/4 bir çift kullanarak ventrale karın boşluğu açmak. Microdissecting forseps bir 4 kullanarak tüm rahim kaldırın ve rahim gövde ve rahim boynuzları ucunda bir ışık işletim makas ile keserek gövdesinden ayırmak. </li><li> Çabuk durulama 1x PBS içinde bütün uterus 37 ° C&#39;ye kadar ısıtıldırahim için bir kan yapışmasını çıkarın ve hemen DMEM içinde yerleştirmek için bir Petri kabı, 37 ° C&#39;ye kadar ısıtıldı. Ayrıca kullanımdan önce% 70 etanol sprey tarafından aletleri sterilize edin. Not: PBS, DMEM ve kültür ortamına dahil olmak üzere, ve tüm işlem boyunca 37 ° C&#39;de muhafaza bunları ön ısıtma çözüm önerilir. </li><li> Bir mikroskop altında, rahim segmental bir ışık işletim makas ile disseke edilmelidir. Bu (köreltilmiş uçlar) modifiye Microdissecting cımbız hafifçe açılmasına genişletmek için sokulabildiği aracılığıyla bölümlere rahmin her iki tarafında küçük açıklıklar ile sonuçlanır. Bu, daha sonra yavaşça Reichert membran ile parietal sarısı kese (PYS) ortaya çıkarmak için Microdissecting bir çift cımbız ile yırtılarak temizlenebilir plasental decidua, maruz kalmasını mümkün kılar. Cımbız kullanarak bir kenarı hafifçe PYS birlikte Reichert membran delmek ve inci ayrıE visseral sarısı kesesi (VYS) altında yatan bozulmamış Vys ile embriyolar maruz katman. Ectoplacental koni ve trophoectoderm türevleri plasental decidua veya Reichert membran ile ya da temizlenebilir. Bakım embriyolar derhal dışarı pop gibi Vys rüptürü önlemek için alınmalıdır. </li><li> Bozulmamış VYS ile Embriyolar daha sonra kültür ortam maddesi plastik bir transfer pipeti kullanılarak 37 ° C&#39;ye kadar ısıtıldı içeren bir Petri tabağına transfer edilmelidir. Not: rahim hemen ayrıldıktan sonra kültür ortamına transfer kültüründe embriyonun gelişimi için daha iyi olur. </li><li> Küçük bir açılış büyük kan damarları kaçınarak Microdissecting cımbız ile yumurta sarısının yapılmalıdır. Cımbız keskin bir çift hafifçe kafa bölgesine bitişik bir alanda delerek açılmasını sağlamak için kullanılabilir. Alternatif künt cımbız iki çift sarısı kesesi tutun ve yavaşça küçük bir açılış yapmak için gözyaşı için kullanılabilir.Sonra yavaşça embriyonik kafasını sığdırmak için yeterli bir boyuta cımbız ile genişleterek açıklığı genişletmek. Yakından embriyo tamamlıyor amniyon zarı yavaşça vücuttan düzenlenen ve bir cımbız kullanarak yırtılmış olmalıdır. 15 kese sarısı bununla embriyonik damar bütünlüğünü koruyarak embriyonik baş ve daha sonra bütün embriyo yavaşça sarısı kesesi eksterioze edilmelidir. Not: yumurta sarısı kesesi damar hasarları potansiyel kültür embriyonun gelişimini etkileyebilir. Hasarlı damar sistemi ile bu tür embriyo kültürü için kullanılmamalıdır ve daha sonra iptal edilebilir embriyoların hazırlama için kullanılabilir. </li><li> Embriyonik evreleme kriterleri: gövde ve baş büyüklüğü, bacak ve her gruptan en az iki embriyo için hücre gruplarının sayısını (ler) sayılarak göz morfolojisi ve sahneye dahil morfolojik kriterlere göre mikroskop ve grubu altında embriyolar inceleyin. &lt;strong&gt; Not: Genellikle rahimde gelişme aynı çöp gösteri farklarından elde ve vücut büyüklüğü, morfolojik özellikleri ve Somitlerin sayısında farklılık embriyolar. Ancak, bizim morfolojik kriterlere göre gruplandırılmış embriyolar genellikle benzer hücre gruplarının sayısını (± 1) sergilenen bulundu. Bu nedenle, bu kültür için başlangıç ​​gecikme süresi gibi her embriyo için somitler saymak için gerekli değildir. Not: kültür somitler saymak için kullanılan embriyolar kullanmayın. Kültürünü başlayarak zaman gecikmesini önlemek için diğer embriyoları için kültür başladıktan sonra somitler saymak. Rahim ayrıldıktan sonra kültüre gecikmeli embriyolar genellikle zayıf gelişme gösterirler. </li><li> Orta 37 ° C ısıtılmış taze kültürü ile bir Petri kabı hemen embriyoların transferi ve embriyoların tekrar steril Kültür ile bir Petri kabı transfer edilmelidir kültürü kaputu götürüne medya ortamı ile kültür şişeler içine koymadan önce kültürünü başlatın. Not: embriyoların için birden fazla medya transferlerini kültür embriyo toplama ve diseksiyon farklı adımlar kültürü kaputu yüklü olmayan bir mikroskop altında gerçekleştirilmiştir gibi kirlenmeyi önlemede yardımcı olur önce. Not: DKBKS (&gt; 12 embriyo), süreç yarım embriyolar büyük ve başlangıç ​​kültürü veya kültür ortamı ile bir tabak koyun ve 37 ° C&#39;de CO 2 inkübatör yerleştirdiğinizde Embriyolar uzun süre (&gt; 35-40 dk) kalmıştı dışında biz yavaşlatmak ve bu kültürü daha sonra gelişimini etkileyecek kalp gözlenmiştir. </li></ol> 4. Fare Embriyolar Kültürleme <ol><li> Kültürü kaputu otoklava kültür şişe açın ve bunları düzgün etiket. Kültür ortamı transferi 3 ml t her birine 37 ° C&#39;ye kadar ılıtıldıo şişeler ve ardından fare embriyoları steril plastik transferi pipetler kullanılarak kültür şişeler içine yavaşça transfer edilmelidir. Kültürü şişeleri daha sonra kültür cihazında haddeleme diske kültür şişeleri tutmaya yardımcı kauçuk tıpa ile kapatılmış bir şişe olmalıdır. Not: medya ile kültürü şişeleri farelere ötenazi önce hazırlanan ve kültür tertibatının haddeleme disk üzerine yerleştirilebilir. Bu durum, kültür şişelerine embriyo transferi için süreyi kısaltır. Not: Fareler Embriyolar bireysel olarak veya aynı kültür şişesi içinde iki ya da üç embriyolar ile alt kültürleri olarak kültürlenebilir. </li><li> Kültürü şişeleri aseptik olarak 37 ° C &#39;de kültür aparatına taşınan ve sıkı bir şekilde kauçuk tıpa ile haddeleme disk üzerindeki deliklere onları kanca gerekmektedir. Embr serbest yüzmesini sağlayan dakika (rpm) başına 35 rotasyonlar sabit bir hızda dönmeye haddeleme disk açınAyrıca medya ve yolar embriyonik doku tarafından serbest gaz alışverişi olur. Kültür odası bağlı silindirden gaz kültür şişeleri içine haddeleme disk ve lastik mantarları akar. </li><li> Düzenli Kültür 16-40 saat boyunca embriyolar ve gaz çıkışı ve kültür oda sıcaklığı kontrol edin. Not: fare embriyo manipülasyon kültüründe: embriyoların en az 30 dakika boyunca kültür koşullarına adapte olsun. Daha sonra düşük performans ve güçsüz bir kalp atışı gösteren embriyolar iptal edilebilir ve geri kalan embriyoların daha fazla işleme çalışmaları için kullanılabilir. Örneğin elektroporasyon 5,9,16, mikroenjeksiyon 18, boncuk implantasyon 16, ilaç tedavisi ve diğer işlemler gibi Embriyo manipülasyonu, bu anda gerçekleştirilebilir. Biz başarıyla erken göz gelişimi rollerini incelemek için bazı sinyal molekülleri ile tedavi Affi-jel agaroz boncuk implantasyonu yapıldı. Embriyolar, sonramanipülasyonlar bir taze ortamda geri döndü ve kültürü devam edilebilir. </li><li> 9-10 saat ve kültür 18-19 saat kültür 40 saat boyunca devam edildi sonra belirli aralıklarla tamamen taze ortam ile kültür ortamı değiştirin. Not: kültür 16-18 saat tarafından durdurulduğunda kültür ortamı yerine gerekmeyebilir. </li><li> Kültüründe başarılı ölçüleri: kültüründe embriyonik gelişme vücut büyüklüğü artış, hücre gruplarının sayısı ve baş, kol, kalp ve gözlerin morfolojik geliştirilmesi yolu ile değerlendirilmelidir ise kültüründe embriyonik hayatta kalma vücutta görünür kalp ve kan dolaşımı tarafından belirlenmelidir. </li><li> E11.0 DPC (~ 40-41 ler) ve E12.0 DPC (~ 49-50 ler) utero geliştirilen embriyolarda sırasıyla, 16-18 saat ve 38-40 saat için, kültürlenmiş embriyolar karşılaştırmak için kontrol olarak kullanılmalıdır. </li><li> Kültür sırasında ve utero aşamalarında için farklı zaman noktalarında embriyonik gelişme capt edilebilirdiseksiyon mikroskop altında değe. Nokta görüntüleme yazılımı görüntüleri yakalamak için kullanılan ve daha sonra görüntü işleme yazılımı kullanılarak işlendi. </li></ol>

<ol>
	<li>Behesti, H., Holt, J. K., Sowden, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+level+of+BMP4+signaling+is+critical+for+the+regulation+of+distinct+T-box+gene+expression+domains+and+growth+along+the+dorso-ventral+axis+of+the+optic+cup.">The level of BMP4 signaling is critical for the regulation of distinct T-box gene expression domains and growth along the dorso-ventral axis of the optic cup.</a> BMC Dev. Biol. 6, 62 (2006).</li><li>Gray, J., Ross, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+tube+closure+in+mouse+whole+embryo+culture.">Neural tube closure in mouse whole embryo culture.</a> J. Vis. Exp. , (2011).</li><li>Tam, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postimplantation+mouse+development:+whole+embryo+culture+and+micro-manipulation.">Postimplantation mouse development: whole embryo culture and micro-manipulation.</a> Int. J. Dev. Biol. 42, 895-902 (1998).</li><li>Miura, S., Mishina, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-embryo+culture+of+E5.5+mouse+embryos:+development+to+the+gastrulation+stage.">Whole-embryo culture of E5.5 mouse embryos: development to the gastrulation stage.</a> Genesis. 37, 38-43 (2003).</li><li>Osumi, N., Inoue, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+transfer+into+cultured+mammalian+embryos+by+electroporation.">Gene transfer into cultured mammalian embryos by electroporation.</a> Methods. 24, 35-42 (2001).</li><li>Yokoo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+mesenchymal+stem+cells+in+rodent+whole-embryo+culture+are+reprogrammed+to+contribute+to+kidney+tissues.">Human mesenchymal stem cells in rodent whole-embryo culture are reprogrammed to contribute to kidney tissues.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 3296-3300 (2005).</li><li>Sadler, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+of+early+somite+mouse+embryos+during+organogenesis.">Culture of early somite mouse embryos during organogenesis.</a> J. Embryol. Exp. Morphol. 49, 17-25 (1979).</li><li>Kitchin, K. T., Ebron, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Further+development+of+rodent+whole+embryo+culture:+solvent+toxicity+and+water+insoluble+compound+delivery+system.">Further development of rodent whole embryo culture: solvent toxicity and water insoluble compound delivery system.</a> Toxicology. 30, 45-57 (1984).</li><li>Takahashi, M., Nomura, T., Osumi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transferring+genes+into+cultured+mammalian+embryos+by+electroporation.">Transferring genes into cultured mammalian embryos by electroporation.</a> Dev. Growth Different. 50, 485-497 (2008).</li><li>Cuthbertson, R. A., Beck, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postimplantation+whole+embryo+culture:+a+new+method+for+studying+ocular+development.">Postimplantation whole embryo culture: a new method for studying ocular development.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 31, 1653-1656 (1990).</li><li>New, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+explanted+rat+embryos+in+circulating+medium.">Development of explanted rat embryos in circulating medium.</a> J. Embryol. Exp. Morphol. 17, 513-525 (1967).</li><li>Chung, K. C., Park, J. H., Kim, C. H., Ahn, Y. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+necrosis+factor-alpha+and+phorbol+12-myristate+13-acetate+differentially+modulate+cytotoxic+effect+of+nitric+oxide+generated+by+serum+deprivation+in+neuronal+PC12+cells.">Tumor necrosis factor-alpha and phorbol 12-myristate 13-acetate differentially modulate cytotoxic effect of nitric oxide generated by serum deprivation in neuronal PC12 cells.</a> J. Neurochem. 72, 1482-1488 (1999).</li><li>Sasaoka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+a+functional+role+of+Shc+proteins+in+mitogenic+signaling+induced+by+insulin,+insulin-like+growth+factor-1,+and+epidermal+growth+factor.">Evidence for a functional role of Shc proteins in mitogenic signaling induced by insulin, insulin-like growth factor-1, and epidermal growth factor.</a> J. Biol. Chem. 269, 13689-13694 (1994).</li><li>Chotani, M. A., Mitra, S., Eid, A. H., Han, S. A., Flavahan, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+cAMP+signaling+pathways+differentially+regulate+alpha2C-adrenoceptor+expression:+role+in+serum+induction+in+human+arteriolar+smooth+muscle+cells.">Distinct cAMP signaling pathways differentially regulate alpha2C-adrenoceptor expression: role in serum induction in human arteriolar smooth muscle cells.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 288, 69-76 (2005).</li><li>Moore-Scott, B. A., Gordon, J., Blackburn, C. C., Condie, B. G., Manley, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+serum-free+in+vitro+culture+technique+for+midgestation+mouse+embryos.">New serum-free in vitro culture technique for midgestation mouse embryos.</a> Genesis. 35, 164-168 (2003).</li><li>Gordon, J., Moore, B. A., Blackburn, C. C., Manley, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum-Free+Culture+of+Mid-gestation+Mouse+Embryos:+A+Tool+for+the+Study+of+Endoderm-Derived+Organs.">Serum-Free Culture of Mid-gestation Mouse Embryos: A Tool for the Study of Endoderm-Derived Organs.</a> Methods Mol. Biol. 1092, 183-194 (2014).</li><li>New, D. A., Cockroft, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rotating+bottle+culture+method+with+continuous+replacement+of+the+gas+phase.">A rotating bottle culture method with continuous replacement of the gas phase.</a> Experientia. 35, 138-140 (1979).</li><li>Cockroft, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+in+culture+of+rat+foetuses+explanted+at+12.5+and+13.5+days+of+gestation.">Development in culture of rat foetuses explanted at 12.5 and 13.5 days of gestation.</a> J. Embryol. Exp. Morphol. 29, 473-483 (1973).</li><li>Zeeb, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacological+manipulation+of+blood+and+lymphatic+vascularization+in+ex+vivo-cultured+mouse+embryos.">Pharmacological manipulation of blood and lymphatic vascularization in ex vivo-cultured mouse embryos.</a> Nat. Protoc. 7, 1970-1982 (2012).</li><li>Wawersik, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BMP7+acts+in+murine+lens+placode+development.">BMP7 acts in murine lens placode development.</a> Dev. Biol. 207, 176-188 (1999).</li><li>Thut, C. J., Rountree, R. B., Hwa, M., Kingsley, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+large-scale+in+situ+screen+provides+molecular+evidence+for+the+induction+of+eye+anterior+segment+structures+by+the+developing+lens.">A large-scale in situ screen provides molecular evidence for the induction of eye anterior segment structures by the developing lens.</a> Dev. Biol. 231, 63-76 (2001).</li><li>Greenfield, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrogen+lowers+Alzheimer+beta-amyloid+generation+by+stimulating+trans-Golgi+network+vesicle+biogenesis.">Estrogen lowers Alzheimer beta-amyloid generation by stimulating trans-Golgi network vesicle biogenesis.</a> J. Biol. Chem. 277, 12128-12136 (2002).</li><li>Cheng, J., Dutra, A., Takesono, A., Garrett-Beal, L., Schwartzberg, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+generation+of+C57BL/6J+mouse+embryonic+stem+cells+in+a+defined+serum-free+media.">Improved generation of C57BL/6J mouse embryonic stem cells in a defined serum-free media.</a> Genesis. 39, 100-104 (2004).</li><li>Kim, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+reprogramming+of+human+neural+stem+cells+by+OCT4.">Direct reprogramming of human neural stem cells by OCT4.</a> Nature. 461, 649-643 (2009).</li><li>Totonchi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feeder-+and+serum-free+establishment+and+expansion+of+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Feeder- and serum-free establishment and expansion of human induced pluripotent stem cells.</a> Int. J. Dev. Biol. 54, 877-886 (2010).</li></ol>

Biz herhangi bir rakip mali çıkarlarını yok.

Orta gebelik aşama fare embriyoları, 37 ° C&#39;de% 95 O 2/5 bir haddeleme şişe kültür cihazı içinde% CO2 atmosferinde bir serum içermeyen kültür ortamı içinde kültürlendi Embriyo gelişme ex utero rahim kültürün tamamlanmasından (Şekil 1) için ötenazi farelerden izole edilir zaman, işlem sırasında her adımında birden fazla faktöre bağımlı idi. Gelişimini etkileyen en önemli faktör kültürü başlatmak için alınan zaman oldu. En çok d...

In vitro bütün embriyolarını kullanarak kültür yöntemleri utero erişimi aksi takdirde zor olan embriyonik organogeneziste alan mekanizmaların sinyalizasyon incelemek için uygundur. Tüm embriyolar doku bütünlüğünü sağlamak ve gerekli mekanizmaları sinyalizasyon zamanında oluşumu için önemli olan doku etkileşimleri için uygun destek organojenez esnasında farklı hücresel süreçler için. Bütün embriyo kültürleri vb nakli çalışmaları, genetik ve doku manipülasyonları, boncuk implantasyon çalışmaları, toksikolojik çalışmalar, gibi uygulamalar bir bolluk için bir platform sağlarken., Şu anda kullanılan embriyo kültür sistemleri embriyoların uygun büyüme ve bakım için serum esas bağımlı kültür 1-9. Serum kültür ortamı 6-8, 10, 11% 10-100 arasında değişen en önemli bileşenlerinden biri olarak kullanılmıştır., Bununla birlikte, serumun bileşim, iyi tanımlanmış değildir ve hayvandan hayvana farklı olabilir ve her zaman serum toplanır. Serum laboratuvar hazırlık zaman alıcı ve sıkı prosedürleri içerir iken, tedarik serum ticari farklı partiler arasında önemli değişkenlik gösterir ve deneysel maliyetlerini yükseltir. Bunlara ek olarak, serum gibi potansiyel olarak bazı deneylerin sonuçlarını etkileyebilir büyüme faktörleri, hormonlar veya başka proteinler, doku etkileşimlerinin önemli sinyal molekülleri çalışma gerektirir özellikle bu bilinmeyen faktörler içerebilir. Çalışmalar kültüre serumu ilaveli potansiyel olarak siklik adenosin monofosfatın (cAMP) ve mitojenik sinyal ve fosfoinositid 3 katılan proteinleri (3 PI) kinaz geçitler 12-14 sinyal gibi bazı sinyal moleküllerinin hücre içi seviyelerini değiştirebilir göstermiştir. Bu aksine, bir serum içermeyen kültür sistemi, antijen serbest ortamının avantajlar sağlamaktadırhücresel süreçleri değiştirebilir ve biyolojik olarak aktif enzimleri oruç deneyleri arasında tutarlılık sağlar. Bu çalışmada, 37 ° C&#39;de% 95 O yuvarlanan şişe kültür cihazı içinde 2/5% CO2 atmosferinde kültür orta gebelik aşama bütün embriyolar için ticari olarak temin edilebilen, kök hücre ortamı takviyesi hazırlanan bir serum içermeyen kültür ortamı kullanılmaktadır C 15,16 °. Bu tanımlanan koşullar altında 16-40 saat için kültürlenmiştir Fare embriyolar hücresel çoğalma, göç ve farklılaşma doku etkileşimlerinin uygun seviyelerini gösteren bu kalp, kol, beyin ve göz gibi genel embriyonik gövde ve farklı yapılarda morfolojik gelişiminde ilerlemesi sergiledi. Göz gibi karmaşık organ sistemlerinin biri için kültüründe embriyonik gelişme moleküler analizi embr okular doku gözlemlenen ile tutarlı olması için, oküler gelişimini sergilemiştirYÖS (hazırlık, Kalaskar ve Lauderdale) rahimde gelişmekte. Böylece orta gebelik aşamasında kültürlendi fare embriyoları, rahimde embriyo geliştirme gözlenen ile karşılaştırılabilir aşamalı büyüme ve gelişme sergilerler morfolojik göstermektedir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="634">
	<tbody>
		<tr>
			<td>KnockOut DMEM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10829-018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KnockOut Serum Replacement</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10828-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 Supplement</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>17502-048</td>
			<td>Stock: 100x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin, from Bovine Serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9418-50G</td>
			<td>Stock: 100%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic - Antimycotic Solution</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>30-004-Cl</td>
			<td>Stock: Penicillin (10000 IU/ml); Streptomycin (10000 &#181;g/ml; Amphotericin (250&#181;g/ml)&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM&#160;&#160;</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>15-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Incubator Unit</td>
			<td>B.T.C. Engineering Milton Cambridge England</td>
			<td>Id.No. 840-374</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Bottles for Rotating Unit</td>
			<td>B.T.C. Engineering</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone Rubber Cork</td>
			<td>B.T.C. Engineering</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>95% O2/5% CO2 Cylinder</td>
			<td>AirGas Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stemi SV11 Apo Dissecting Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stemi SV6 Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Water Jacketed Incubator</td>
			<td>Forma Scientific</td>
			<td>Model: 3110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture Hood</td>
			<td>Nuaire Biological Safety Cabinets Class II TypeA2</td>
			<td>Model: Nu-425-600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Bath</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>IsoTemp205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weigh Balance</td>
			<td>Mettler Toledo&#160;</td>
			<td>AG285</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Tube &#8211; 50ml</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light Operating Scissors</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-6702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Operating Sharp-Blunt Scissors&#160;</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-6812</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Dissecting Forceps &#8211; 4&#8221;</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Dissecting Forceps - Hudson (cWALD) &#8211; 4-3/4&#8221;</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5237</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Dissecting Tweezers (5/45)</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5005</td>
			<td>Modified - Sharp ends were made blunt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Dissecting Tweezers (5)</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5060</td>
			<td>Modified - Sharp ends were made blunt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Dissecting Tweezers (55)</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5063</td>
			<td>Modified - Sharp ends were made blunt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instrument Tray</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RT-1401S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instrument Tray Lid</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RT-1401L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish-100mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>087571Z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish-60mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>0875713A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish-35mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>0875711YZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter System ( 0.22um Cellulose Acetate)-150ml</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter System ( 0.22um Cellulose Acetate)-250ml</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430756</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter System ( 0.22um Cellulose Acetate)-500ml</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet-aid Pipetter</td>
			<td>Drummond Scientific Co.</td>
			<td>D57849</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological Pipette-10ml</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89130-898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Serological Pipette-25ml</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer Pipette - 7.7ml</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>202-20S</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mouse embryonic development in a serum-free whole embryo culture system

Orta gebelik aşama fare embriyoları oksijenli haddeleme şişe kültür sistemi içinde ticari olarak temin edilebilen, kök hücre ortamı takviyesi hazırlanan bir serum içermeyen kültür ortamı kullanılarak kültürlenmiştir. E10.5 fare embriyoları dikkatlice sağlam yumurta sarısının ile rahim izole edildi ve yolk kesesi ile embriyonun damar sürekliliğini korurken hassas cerrahi manevra kapsayan bir süreçte embriyoların yavaşça sarısı kesesi eksterioze edildi. Bozulmamış yolk kesesi veya uzaklaştırılarak yumurta sarısı ile hazırlanan embriyolar ile karşılaştırıldığında, bu embriyolar, üstün hayatta kalma oranı ve benzer koşullar altında kültüre gelişim ilerlemesi sergiledi. Biz, bu fare embriyoları, ne 16-40 saat boyunca 37 ° C&#39;de% 95 O yuvarlanan şişe kültür cihazı içinde 2/5% CO2 atmosferinde tanımlanmış bir ortam içinde kültürlendi, karşılaştırılabilir morfolojik büyüme ve gelişme sergilerler olduğunu göstermektedir Embriyoların rahimde gelişmekte. Biz inci inanıyorumyöntem embriyonik organogeneziste önemli sinyal etkileşimleri incelemek için, tüm embriyo kültürünü kullanmak için ihtiyaç duyan araştırmacılar için yararlı olacaktır.

Fare embriyolarının gelişimi ex utero rahim embriyolar kültürlenir süre için vücut izole edilir zaman başlangıç ​​çok sayıda faktöre bağlıdır. Şekil 1 &#39;de gösterildiği gibi, işlem vücuttan uterus ayrılmasından (Şekil 1A), bozulmamış yolk kesesi (Şekil 1 B) ile embriyoların izolasyonu da dahil olmak üzere bir dizi adım içerir, yumurta sarısı kesesinden embriyoların eksteriorizasyon ( Şekil 1C) ve 37 °...

Watch this Scientific Journal Video about Mouse Embryonic Development in a Serum-free Whole Embryo Culture System at JoVE.com

Mouse Embryonic Development in a Serum-free Whole Embryo Culture System

Embriyo kültürlerinde kullanılan serum, özellikle sinyalizasyon etkileşimler içeren çalışmalarda deney sonucunu etkileyebilecek bilinmeyen bileşenleri içerir. Burada bir serum içermeyen kültür sistemi kullanılan oksijenli ve 16-40 saat süre ile kültüre orta gebelik fare embriyo utero gelişen embriyo benzer morfolojik gelişimini gösteren göstermektedir.

Serumsuz Tüm Embriyo Kültür Sistemde Fare Embriyonik Development

Mid-gestation stage mouse embryos were cultured utilizing a serum-free culture medium prepared from commercially available stem cell media supplements in ...

mouse-embryonic-development-serum-free-whole-embryo-culture

Research

JoVE Journal

Biology

25.6K Görüntüleme.  University of Georgia.  Embriyo kültürlerinde kullanılan serum, özellikle sinyalizasyon etkileşimler içeren çalışmalarda deney sonucunu etkileyebilecek bilinmeyen bileşenleri içerir. Burada bir serum içermeyen kültür sistemi kullanılan oksijenli ve 16-40 saat süre ile kültüre orta gebelik fare embriyo utero gelişen embriyo benzer morfolojik gelişimini gösteren göstermektedir. 