Esta investigación fue apoyada por la DFG Deutsche Forschungsgemeinschaft bajo el número de concesión y DFG 315/4-1 FO SFB 688.

1. Aislamiento del cerebro microvasos <ol><li> Para cada preparación utilizan cinco a diez ratones neonatales de cualquier sexo (3-5 días de edad). </li><li> Eutanasia a un ratón de acuerdo a locales IACUC / veterinario recomendaciones, retire inmediatamente el cerebro, y se transfiere a una placa de Petri que contiene la solución siguiente: 15 mM Hepes (pH 7,4), 153 mM NaCl, 5,6 mM KCl, 2,3 mM CaCl 2 x 2H 2 O, 2,6 mM de MgCl 2 x 6H 2 O, 1% (w / v) de BSA (en lo sucesivo denominado tampón como A). </li><li> A menos que se indique otra cosa, todos los procedimientos de aislamiento deben realizarse a temperatura ambiente (RT) (22-24 ° C) bajo la campana de flujo laminar. Cortar el cerebro (cerebro sin cerebelo y tallo cerebral), después de la eliminación de las meninges y los fragmentos capilares, en tampón A usando un escalpelo estéril. Pipetear fragmenta el tejido de arriba abajo usando una pipeta de 10 ml hasta que no queden grumos aparecen. Transferir la suspensión a un tubo Falcon de 50 ml y centrifugar a 250 xg durante 5 min a TA. </li></ol> Nota: Meninges puede ser identificado como membranas delgadas y transparentes en la superficie del tejido cerebral. Pueden retirarse cuidadosamente con pinzas estériles. <ol start="4"><li> Eliminar el sobrenadante. </li><li> Disolver el precipitado en 4,5 ml de Tampón A con 1,5 ml de 0,75% (w / v) de colagenasa / dispasa (Roche) y se incuba durante 45 min a 37 ° C en un baño de agua (ocasionalmente agitación). </li><li> Mientras tanto, preparar las placas de 12-pocillos por recubrimiento de cuatro pocillos con colágeno IV (0,1 mg / ml disuelto en ácido acético 50 mM). Permitir que se adhieran durante 1 hr. </li><li> Detener la digestión mediante la adición de 15 ml de tampón enfriado con hielo A. Resuspender el precipitado completamente. </li><li> Centrifugar la suspensión a 250 xg durante 10 min a TA. </li><li> Eliminar el sobrenadante. </li><li> Para quitar la mielina, añadir 10 ml 25% (w / v) de BSA (Sigma, pureza&gt; 98%) y se centrifuga a 1.000 xg durante 20 min a 4 ° C. 25% de BSA se debe disolver en 1x PBS (PAA Laboratories) y se filtró a través de f 0,2 milter). </li><li> Con cuidado, descartar el sobrenadante, disolver el precipitado en 10 ml de tampón A y transferir a un nuevo tubo Falcon. </li><li> Centrifugar la suspensión a 250 xg durante 5 min a TA. El sedimento resultante contiene las células endoteliales. </li><li> Lavar dos veces el colágeno IV recubierto 12-así placa con PBS. </li><li> Resuspender el sedimento en 4 ml de medio de crecimiento (DMEM que contenía 10% de FCS, penicilina 50U/ml / estreptomicina, 1% de L-glutamina) y la placa de la suspensión celular en dos pocillos de 2 ml a cada pocillo. Añadir la puromicina a una concentración final de 4 mg / ml y se incuba durante 45 min a 37 ° C en una incubadora de cultivo celular. Este paso permite la eliminación de células que se adhieren rápidamente Nota:. Puromicina se añade durante 24 horas. Sólo cerebro ECs puede metabolizar, para otros tipos de células puromicina es tóxico 14. </li><li> Pasar el medio que contiene 2 ml de células no adheridas de paso 1,14 en dos pocillos frescos (estos pocillos contienen la fracción CE). Llenar los pocillos con células adheridas de step 1,14 con 2 ml de medio fresco (estos pocillos contienen otros tipos de células, por ejemplo, fibroblastos, astrocitos y se puede cultivar en paralelo y se utiliza para la comparación de la morfología). </li><li> Cambiar el medio al día siguiente. </li></ol> 2. Inmortalizando el cerebro células endoteliales microvasculares <ol><li> Cultivar la GP + E-86 Neo (GPENeo) 15 secretoras de fibroblastos, un virus deficiente en la replicación con polioma medio oncogén T en medio DMEM que contiene 10% FCS inactivado por calor, 50U/ml penicilina / estreptomicina, y 2 mg / ml de G418 ( . PAA Laboratories) en matraces recubiertos de gelatina Nota: polioma medio de transfección oncogén T provoca ventaja de crecimiento de las EC sobre los no-ECS que conduce a una monocapa homogénea de células con morfología endotelial 4 a 6 semanas de cultivo. GPENeo no están disponibles comercialmente y se pueden obtener como material pública compartida (por favor refiérase a las publicaciones originales 4,16). </li><li> Para usar el medio que contiene el virus de<html> inmortalización, cultivar las células en G418 GPENeo libre de mediano durante 24 h. </li><li> Eliminar 10 ml del sobrenadante y añadir GPEneo Polybrene (bromuro de hexadimetrina) (Sigma) a una concentración final de 8 mg / ml, esterilizar a través de filtros de 0,45 micras para eliminar los fragmentos celulares. </li><li> Retire el medio de cultivo de las culturas comunitarias preparadas en la parte 1 y añadir 2 ml de sobrenadante GPEneo / Polybrene mezcla en los pocillos. Repita al día siguiente utilizando un sobrenadante fresco GPEneo / Polybrene mezcla Nota:. Polybrene se utiliza para hacer los poros en la pared celular para facilitar la infección con las partículas víricas). </li><li> Eliminar el sobrenadante GPEneo / Polybrene mezcla el día siguiente, se lavan las células dos veces con PBS y mantener las células en el medio de crecimiento cambiantes que cada 3 días. Al confluencia, dividir las celdas 1:2 en colágeno IV placas recubiertas. </li><li> Típicamente, estables cerebrales endoteliales (CEND) líneas de células se debe obtener 4-5 semanas más tarde. </li></ol>e &quot;&gt; 3. Cultivar las células endoteliales microvasculares del cerebro <ol><li> Descongelar las células de cryoaliquot en un baño de agua y la transferencia de 15 ml-Falcon de 10 ml pre-calentado medio. </li><li> Centrifugar la suspensión a 250 xg durante 5 min a TA. </li><li> Eliminar el medio, transferir el precipitado en el colágeno IV T revestido 25 cm 2 frasco de cultivo celular con medio de crecimiento pre-calentado (densidad celular para el revestimiento debe ser de al menos 1 x 10 4 células / ml). </li><li> Cambio de medio al día siguiente y después de que las células alcanzaron la confluencia (generalmente después de 5 días) dividir las celdas. </li></ol> 4. La división de las células CEND (Nota: La división debe hacerse sólo una vez por semana, evitar la división superior de 1:4). <ol><li> Eliminar el medio, se lavan las células con PBS. </li><li> Añadir 3 ml de tripsina-EDTA caliente solución (PAA Laboratories) (T 75 cm 2 matraz), se incuba a 37 ° C y espere hasta que la capa de células se dispersa (generalmente dentro de 5 a 15 min). </li><li> Añadir 5 ml omedio f crecimiento, pipetear arriba y abajo, y la transferencia a un nuevo colágeno IV recubierto matraz. </li></ol> 5. La congelación de las células CEND <ol><li> Obtener la suspensión de células como se describe en el paso 4 </li><li> Centrifugar la suspensión a 250 xg durante 5 min a TA. </li><li> Resuspender el sedimento celular (obtenido a partir de 1 T 75 cm 2 matraz) en 6 ml de medio de congelación (95% medio de crecimiento, 5% de DMSO). </li><li> Divida la suspensión de células en 1,5 ml cuatro alícuotas crio-Nota:. Crio-Una alícuota se pueden sembrar en T 25 cm 2 frasco. </li><li> Guarde los crio-alícuotas en nitrógeno líquido a temperatura de vapor. </li></ol> CEND medio de crecimiento: 450 ml de DMEM, 10% FCS, 10 ml de L-glutamina, 2% MEM-Kit, 2% NEAA, 10 piruvato natrium ml, 50 U / ml de penicilina / estreptomicina 6. Los resultados representativos Las células CEND y cerebEND se caracteriza por inmunotinción de una endotelialnd BBB marcadores, así como por mediciones de la resistencia eléctrica transendotelial (TEER) y la permeabilidad. El CEND y cerebEND tenían una morfología similar a cultivos primarios de cerebro ECS, con monocapas de células alargadas estrechamente empaquetados que mostraron inhibición del crecimiento a la confluencia. Las células expresaron niveles detectables de bien claudin-5, ocludina y cadherina VE proteínas que se localizan en las uniones célula-célula, como se muestra por inmunofluorescencia (Figura 3) 4,5. El cultivo de células CEND en el suero reducida medio resultó en un aumento de la TEER (de 150 Ωcm 2 en presencia de 10% de suero a 500 Ωcm 2 en presencia de 2% de suero), que fue potenciada por la adición de hidrocortisona (800 Ωcm 2) o insulina (1.000 Ωcm 2) 4. Monocapas de CEND cultivadas en suero reducida medio durante 21 días tenía TEER de 900 Ωcm 2 (Figura 4). TEER se midió utilizando un conjuntoque contienen electrodos de corriente y voltaje de paso de medición-(World Precision Instruments). Para la comparación, el principal microvascular cerebral ECs se ha informado que tienen valores de TEER de 200-600 Ωcm 2 y una línea celular de ratón comercialmente disponible bEnd.3 tenía TEER valores de 100-140 Ωcm 2 (para una revisión reciente ver Abbot 2005 y Toth et al., 2011 17,18). Además, el paso de macromoléculas, tales como no cargado FITC-dextranos de masas moleculares 4, 10, 70 y 500 kDa, o con fluoresceína (300 Da) a través de la monocapa de CEND en medio de diferenciación 2% de FCS durante 4 h se redujo en comparación con las células de control mantenidos en medio de crecimiento que contiene 10% de FCS: flujo paracelular se redujo a 30% de las células de control para la fluoresceína, a 26% de FITC-dextrano 10 y 70 kDa, y el flujo se redujo a 4,5% de las células de control para FITC -dextrtan 500 kDa. Similar a TEER valores, la permeabilidad era al nivel más bajo en las células cultivadas en presencia de glucocorticoids (GC) 4. En otros estudios, se identificaron los genes diana de glucocorticoides, ocludina, claudin-5 y VE-cadherina en el endotelio vascular cerebral 4,7,9. Tratamiento GC llevado a un aumento en la expresión de estas proteínas y a la reordenación de la VE-cadherina con el citoesqueleto. El GC directa mediada por la regulación de proteínas apretado cruce occludin y claudina 5 aparece a través de los elementos de respuesta GC en sus regiones promotoras 4,7,19. Además, claudin-5 fue identificado como un objetivo estrógeno novela en endotelio vascular 10. Subyace en la disfunción endotelial muchas enfermedades diferentes. Hemos cultivado la CEND bajo oxígeno / privación de glucosa (OGD) condiciones. OGD condujo a la interrupción de la función BBB, que podría ser reconstituido después del tratamiento combinado con GC y el proteasoma bortezomib inhibidor 12. Condiciones OGD condujo a un fuerte aumento en la captación de glucosa y en la expresión de transpor glucosatros en cerebEND, que podría ser atenuada por la adición de MK801, un inhibidor no competitivo de NMDA-receptor 13. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/4022/4022fig1.jpg" /> Figura 1. Morfología de las células endoteliales microvasculares del cerebro (CEND) una semana después del aislamiento. Fotografías de microscopía de luz se tomaron bajo el 6x (A) y 15x (B) aumentos. Las colonias formadas isla de células endoteliales son visibles. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/4022/4022fig2.jpg" /> Figura 2. Morfología de las células endoteliales microvasculares del cerebro (CEND) un mes después del aislamiento y la inmortalización. Imágenes de microscopía de luz se tomaron bajo la ampliación de 15x. Una monocapa confluente, homogénea de células endoteliales puede ser observado. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/4022/4022fig3.jpg" /> Figura 3. Inmortalizado cerebro microvascular células endoteliales expresan claudin-5, ocludina y cadherina VE. CEND células fueron cultivadas en colágeno IV cubreobjetos recubiertos y se tiñeron con anticuerpos contra claudin-5 (A), la ocludina (B) y VE-cadherina (C). Las imágenes fueron tomadas con un microscopio Zeiss Axioscop2 bajo el aumento de 40x. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/4022/4022fig4.jpg" /> Figura 4. Medición de la resistencia eléctrica transendotelial (TEER) de CEND monocapa. CEND fueron cultivadas en colágeno IV recubiertos filtros transwell (tamaño de poro de 0,4 micras). Después de alcanzar la confluencia, las células se mantuvieron en medio que contenía 2% de FCS. TEER se midió después de 7 días, 14 y 21 utilizando un conjunto que contiene los electrodos de corriente y tensión de medición pasajeras.

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	<li>Wilhelm, I., Fazakas, C., Krizbai, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+models+of+the+blood-brain+barrier.">In vitro models of the blood-brain barrier.</a> Acta Neurobiol. Exp (Wars). 71, 113 (2011).</li><li>Forster, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+effects+of+hydrocortisone+and+TNFalpha+on+tight+junction+proteins+in+an+in+vitro+model+of+the+human+blood-brain+barrier.">Differential effects of hydrocortisone and TNFalpha on tight junction proteins in an in vitro model of the human blood-brain barrier.</a> J. Physiol. 586, 1937 (2008).</li><li>Weksler, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood-brain+barrier-specific+properties+of+a+human+adult+brain+endothelial+cell+line.">Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line.</a> FASEB. J. 19, 1872 (2005).</li><li>Forster, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Occludin+as+direct+target+for+glucocorticoid-induced+improvement+of+blood-brain+barrier+properties+in+a+murine+in+vitro+system.">Occludin as direct target for glucocorticoid-induced improvement of blood-brain barrier properties in a murine in vitro system.</a> J. Physiol. 565 (Pt 2), 475 (2005).</li><li>Silwedel, C., Forster, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+susceptibility+of+cerebral+and+cerebellar+murine+brain+microvascular+endothelial+cells+to+loss+of+barrier+properties+in+response+to+inflammatory+stimuli.">Differential susceptibility of cerebral and cerebellar murine brain microvascular endothelial cells to loss of barrier properties in response to inflammatory stimuli.</a> J. Neuroimmunol. 179, 37 (2006).</li><li>Forster, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucocorticoid+effects+on+mouse+microvascular+endothelial+barrier+permeability+are+brain+specific.">Glucocorticoid effects on mouse microvascular endothelial barrier permeability are brain specific.</a> J. Physiol. 573 (Pt 2), 413 (2006).</li><li>Burek, M., Forster, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+and+characterization+of+the+murine+claudin-5+promoter.">Cloning and characterization of the murine claudin-5 promoter.</a> Mol. Cell Endocrinol. 298, 19 (2009).</li><li>Forster, C., Kahles, T., Kietz, S., Drenckhahn, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dexamethasone+induces+the+expression+of+metalloproteinase+inhibitor+TIMP-1+in+the+murine+cerebral+vascular+endothelial+cell+line+cEND.">Dexamethasone induces the expression of metalloproteinase inhibitor TIMP-1 in the murine cerebral vascular endothelial cell line cEND.</a> J. Physiol. 580 (Pt.3), 937 (2007).</li><li>Blecharz, K. G., Drenckhahn, D., Forster, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucocorticoids+increase+VE-cadherin+expression+and+cause+cytoskeletal+rearrangements+in+murine+brain+endothelial+cEND+cells.">Glucocorticoids increase VE-cadherin expression and cause cytoskeletal rearrangements in murine brain endothelial cEND cells.</a> J. Cereb. Blood Flow Metab. 28, 1139 (2008).</li><li>Burek, M., Arias-Loza, P. A., Roewer, N., Forster, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Claudin-5+as+a+novel+estrogen+target+in+vascular+endothelium.">Claudin-5 as a novel estrogen target in vascular endothelium.</a> Arterioscler. Thromb Vasc. Biol. 30, 298 (2010).</li><li>Blecharz, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucocorticoid+effects+on+endothelial+barrier+function+in+the+murine+brain+endothelial+cell+line+cEND+incubated+with+sera+from+patients+with+multiple+sclerosis.">Glucocorticoid effects on endothelial barrier function in the murine brain endothelial cell line cEND incubated with sera from patients with multiple sclerosis.</a> Mult. Scler. 16, 293 (2010).</li><li>Kleinschnitz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucocorticoid+insensitivity+at+the+hypoxic+blood-brain+barrier+can+be+reversed+by+inhibition+of+the+proteasome.">Glucocorticoid insensitivity at the hypoxic blood-brain barrier can be reversed by inhibition of the proteasome.</a> Stroke. 42, 1081 (2011).</li><li>Neuhaus, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Addition+of+NMDA-receptor+antagonist+MK801+during+oxygen/glucose+deprivation+moderately+attenuates+the+upregulation+of+glucose+uptake+after+subsequent+reoxygenation+in+brain+endothelial+cells.">Addition of NMDA-receptor antagonist MK801 during oxygen/glucose deprivation moderately attenuates the upregulation of glucose uptake after subsequent reoxygenation in brain endothelial cells.</a> Neurosci. Lett. 506, 44 (2012).</li><li>Perriere, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Puromycin-based+purification+of+rat+brain+capillary+endothelial+cell+cultures.+Effect+on+the+expression+of+blood-brain+barrier-specific+properties.">Puromycin-based purification of rat brain capillary endothelial cell cultures. Effect on the expression of blood-brain barrier-specific properties.</a> J. Neurochem. 93, 279 (2005).</li><li>Golenhofen, N., Ness, W., Wawrousek, E. F., Drenckhahn, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+induction+of+the+stress+protein+alpha-B-crystallin+in+vascular+endothelial+cells.">Expression and induction of the stress protein alpha-B-crystallin in vascular endothelial cells.</a> Histochem Cell Biol. 117, 203 (2002).</li><li>Risau, W., Engelhardt, B., Wekerle, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+function+of+the+blood-brain+barrier:+incomplete+presentation+of+protein+(auto-)antigens+by+rat+brain+microvascular+endothelium+in+vitro.">Immune function of the blood-brain barrier: incomplete presentation of protein (auto-)antigens by rat brain microvascular endothelium in vitro.</a> J. Cell Biol. 110, 1757 (1990).</li><li>Abbott, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+CNS+barriers:+evolution,+differentiation,+and+modulation.">Dynamics of CNS barriers: evolution, differentiation, and modulation.</a> Cell Mol. Neurobiol. 25, 5 (2005).</li><li>Toth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patented+in+vitro+blood-brain+barrier+models+in+CNS+drug+discovery.">Patented in vitro blood-brain barrier models in CNS drug discovery.</a> Recent Pat. CNS Drug Discov. 6, 107 (2011).</li><li>Harke, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucocorticoids+regulate+the+human+occludin+gene+through+a+single+imperfect+palindromic+glucocorticoid+response+element.">Glucocorticoids regulate the human occludin gene through a single imperfect palindromic glucocorticoid response element.</a> Mol. Cell Endocrinol. 295, 39 (2008).</li><li>Kiefer, F., Courtneidge, S. A., Wagner, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncogenic+properties+of+the+middle+T+antigens+of+polyomaviruses.">Oncogenic properties of the middle T antigens of polyomaviruses.</a> Adv. Cancer Res. 64, 125 (1994).</li><li>Kiefer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell+transformation+by+polyomavirus+middle+T+antigen+in+mice+lacking+Src-related+kinases.">Endothelial cell transformation by polyomavirus middle T antigen in mice lacking Src-related kinases.</a> Curr. Biol. 4, 100 (1994).</li><li>Ong, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ShcA+and+Grb2+mediate+polyoma+middle+T+antigen-induced+endothelial+transformation+and+Gab1+tyrosine+phosphorylation.">ShcA and Grb2 mediate polyoma middle T antigen-induced endothelial transformation and Gab1 tyrosine phosphorylation.</a> EMBO J. 20, 6327 (2001).</li><li>O'Connell, K. A., Edidin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mouse+lymphoid+endothelial+cell+line+immortalized+by+simian+virus+40+binds+lymphocytes+and+retains+functional+characteristics+of+normal+endothelial+cells.">A mouse lymphoid endothelial cell line immortalized by simian virus 40 binds lymphocytes and retains functional characteristics of normal endothelial cells.</a> J. Immunol. 144, 521 (1990).</li><li>Roux, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+gamma-glutamyl+transpeptidase+and+alkaline+phosphatase+activities+in+immortalized+rat+brain+microvessel+endothelial+cells.">Regulation of gamma-glutamyl transpeptidase and alkaline phosphatase activities in immortalized rat brain microvessel endothelial cells.</a> J. Cell Physiol. 159, 101 (1994).</li><li>Montesano, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+proteolytic+activity+is+responsible+for+the+aberrant+morphogenetic+behavior+of+endothelial+cells+expressing+the+middle+T+oncogene.">Increased proteolytic activity is responsible for the aberrant morphogenetic behavior of endothelial cells expressing the middle T oncogene.</a> Cell. 62, 435 (1990).</li><li>Steiner, O., Coisne, C., Engelhardt, B., Lyck, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+immortalized+bEnd5+and+primary+mouse+brain+microvascular+endothelial+cells+as+in+vitro+blood-brain+barrier+models+for+the+study+of+T+cell+extravasation.">Comparison of immortalized bEnd5 and primary mouse brain microvascular endothelial cells as in vitro blood-brain barrier models for the study of T cell extravasation.</a> J. Cereb. Blood Flow Metab. 31, 315 (2010).</li><li>Skaper, S. D., Conn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Neurosciences. 2, 1303 (1990).</li><li>Ishii, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thrombomodulin,+an+endothelial+anticoagulant+protein,+is+absent+from+the+human+brain.">Thrombomodulin, an endothelial anticoagulant protein, is absent from the human brain.</a> Blood. 67, 362 (1986).</li><li>Minagar, A., Alexander, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood-brain+barrier+disruption+in+multiple+sclerosis.">Blood-brain barrier disruption in multiple sclerosis.</a> Mult. Scler. 9, 540 (2003).</li></ol>

No hay conflictos de interés declarado.

El procedimiento descrito puede ser utilizado para el aislamiento de microvascular ECs de diferentes cepas de ratón, así como a partir de diferentes cepas de ratón knock-out para estudiar los cambios específicos en la función del endotelio vascular. Como un método de inmortalización se utilizó la transformación con oncoproteína de poliomavirus murino, Polioma medio antígeno T. Se transforma rápidamente inmaduros células endoteliales in vivo e in vitro 20,21,22. Otros métodos de inmortalización de ECs descritos en la literatura incluyen, por ejemplo, la inmortalización con antígeno T grande SV40 de Simian Virus 40 23 vacuolizante, producto del gen E1A del adenovirus 24 o la sobreexpresión de la subunidad catalítica de la telomerasa humana 3. La inmortalización con PYMT es específico para el murino ECs inmaduro, que permite la obtención de un cultivo homogéneo CE de ratones neonatos en un corto tiempo. Inmortalización cambia las propiedades de las células y thE Resultados obtenidos con las líneas celulares inmortalizadas deben compararse con las células primarias o con experimentos in vivo con ratones. PYMT inmortalizada CE se ha descrito para expresar altos niveles de actividad fibrinolítica que resultan de una mayor producción de plasminógeno de tipo uroquinasa activador y disminución de la producción de activador del plasminógeno 25. La comparación directa de PYMT inmortalizada bEND5 línea celular primaria con ECs reveló que tanto en modelos in vitro BBB son muy adecuados para los estudios de adhesión de células T 26. Las líneas celulares establecidas de acuerdo con el procedimiento descrito se puede utilizar en el paso número bajo para mantener las propiedades de barrera por la alta expresión de proteínas de BBB y CE de la unión, como las células pierden estas propiedades durante el envejecimiento. Así, después de la pérdida de propiedades de barrera, la preparación de una nueva línea celular debe ser considerado. Densidad de célula de recubrimiento debe ser alta para ECs, ya que es fundamental para la proliferación celular. Esto debe tenerse en cuenta durante el procedimiento de aislamiento así como el mantenimiento de la inmortalizada ECs. Cada línea celular nuevo deben ser evaluados por sus propiedades de barrera y de posibles contaminantes con otros tipos de células. Monocapas CE pueden ser teñidas con anti-antígeno de músculo galactocerebrósido, anti-proteína ácida fibrilar glial y anti-liso como anticuerpos primarios para excluir la contaminación con los oligodendrocitos, astrocitos y pericitos 4,27. Para descartar la contaminación por vasculatura meningal, la expresión de la trombomodulina puede ser probado, que se expresa en todos los lechos vasculares con la excepción del cerebro 28. Curiosamente, las líneas de células endoteliales microvasculares inmortalizadas aisladas de diferentes regiones del cerebro difieren en sus propiedades de barrera y la susceptibilidad a los estímulos proinflamatorios. Como ejemplo, las líneas cerebEND CEND cerebrales y del cerebelo celulares se pueden mencionar 4,5. CerebEND mostró, en comparacióna CEND, la disminución de los niveles de expresión de los principales componentes del apretado nudo de claudina-1 y ocludina. Sin embargo, los niveles de claudin-3 y -12 fueron mayores en cerebEND. La función de barrera de las células cerebEND sufrido mucho más bajo un tratamiento con el mediador inflamatorio, TNFa que las propiedades de barrera de las células CEND hizo 5. Mayor vulnerabilidad cerebelosa a estímulos inflamatorios, se puede observar in vivo en pacientes con esclerosis múltiple y en su modelo animal experimental encefalomielitis autoinmune 29. Estos hallazgos interesantes muestran la necesidad de generación y caracterización individual en modelos in vitro para diferentes regiones del cerebro, con el fin de mejorar la focalización de medicamentos futuro en el cerebro.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> Albúmina de suero bovino (BSA) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A7906 </td><td> Pureza&gt; 98% </td></tr><tr><td> colágeno IV </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C5533 </td><td> 50 ug / ml en 50 mM de ácido acético </td></tr><tr><td> Colagenasa / dispasa </td><td> Roche </td><td> 10269638001 </td><td></td></tr><tr><td> Dulbecco modificado a medio Eagle (DMEM) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D5796 </td><td></td></tr><tr><td> Sulfóxido de dimetilo (DMSO) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D2650 </td><td></td></tr><tr><td> Suero de ternera fetal (FCS) </td><td> PAA Laboratories </td><td> A15110-1333 </td><td> concentración final 10%, inactivado por calor (30 min a 56 ° C) </td></tr&gt; <tr><td> L-glutamina </td><td> Biochrom AG </td><td> K0282 </td><td> Almacenamiento: ≤ -15 ° C </td></tr><tr><td> MEM Vitamine </td><td> Biochrom AG </td><td> K0373 </td><td> Almacenamiento: ≤ -15 ° C </td></tr><tr><td> Na-piruvato </td><td> Biochrom AG </td><td> L0473 </td><td></td></tr><tr><td> Neomicina (G418) </td><td> PAA Laboratories </td><td> P11-012 </td><td></td></tr><tr><td> No aminoácidos esenciales (NEA) </td><td> Biochrom AG </td><td> K0293 </td><td> El almacenamiento a 4 ° C </td></tr><tr><td> Penicilina / Estreptomicina </td><td> Biochrom AG </td><td> A2212 </td><td> Almacenamiento: ≤ -15 ° C </td></tr><tr><td> Salina tamponada con fosfato (PBS) </td><td> Biochrom AG </td><td> L1825 </td><td></td></tr><tr><td> Polibreno (bromuro de hexadimetrina) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 107689 </td><td> 0,8 mg / ml en PBS, el almacenamiento a -20 ° C </td></tr><tr><td> Puromicina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P8833 </td><td></td></tr><tr><td> Tripsina / EDTA </td><td> Biochrom AG </td><td> L1825 </td><td> 0,05%, 0,02% de EDTA en PBS </td></tr></tbody></table>

generation of an immortalized murine brain microvascular endothelial cell line as an in vitro blood brain barrier model

Las células epiteliales y endoteliales (CE) están creando barreras paracelulares que protegen el tejido del entorno externo e interno. La barrera sangre-cerebro (BBB) ​​que consiste en CE, astrocitos pies finales pericitos, y la membrana basal es responsable de la protección y de la homeostasis del parénquima cerebral. En modelos in vitro BBB son herramientas comunes para estudiar la estructura y función de la BBB en el nivel celular. Un número considerable de diferentes modelos in vitro BBB se han establecido para la investigación en laboratorios diferentes hasta la fecha. Generalmente, las células se obtienen de bovino, porcino, de rata o de tejido de cerebro de ratón (discutido en detalle en la revisión por Wilhelm et al. 1). Muestras de tejidos humanos sólo están disponibles en un número limitado de laboratorios o empresas 2,3. Mientras que las preparaciones de células primarias son mucho tiempo y las culturas CE puede variar de lote a lote, el establecimiento de inmortalizada CE lines es el foco de interés científico. A continuación, se presenta un método para establecer una línea microvascular cerebral inmortalizado CE de cerebro de ratón recién nacido. Se describe el procedimiento paso a paso lista de los reactivos y las soluciones utilizados. El método establecido por nuestro laboratorio permite el aislamiento de una homogénea línea inmortalizada de células endoteliales dentro de las cuatro a cinco semanas. Las líneas de células microvasculares endoteliales del cerebro denominada CEND 4 (a partir de la corteza cerebral) y cerebEND 5 (a partir de corteza cerebelosa), se aisló de acuerdo con este procedimiento en el laboratorio Förster y se han usado eficazmente para la explicación de diferentes procesos fisiológicos y patológicos en el BBB. Uso de CEND y cerebEND hemos demostrado que estas células responden a glucocorticoides y estrógenos 4,6-9 tratamiento 10, así como a pro-infammatory mediadores, tales como TNF-alfa 5,8. Por otra parte, se ha estudiado la patología de múltiples sclerosis 11 y 12,13 hipoxia en la CE-nivel. El CEND y líneas cerebEND se puede considerar como una buena herramienta para el estudio de la estructura y función de la BHE, las respuestas celulares de los AE a diferentes estímulos o en la interacción de la CE con linfocitos o células cancerosas.

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Generation of an Immortalized Murine Brain Microvascular Endothelial Cell Line as an In Vitro Blood Brain Barrier Model

Este método se describe cómo aislar e inmortalizar las células endoteliales microvasculares de cerebro de ratón. Se describe un protocolo paso a paso a partir de la homogeneización del tejido cerebral, las fases de digestión, la siembra y la inmortalización de las células. Por lo general, toma alrededor de cinco semanas para obtener una homogénea línea inmortalizada de células endoteliales microvasculares.

Generación de una línea murina Inmortalizado microvascular cerebral célula endotelial como<em&gt; In Vitro</em&gt; Barrera hematoencefálica modelo

Epithelial and endothelial cells (EC) are building paracellular barriers which protect the tissue from the external and internal environment. The ...

generation-an-immortalized-murine-brain-microvascular-endothelial

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Generation of an Immortalized Murine Brain Microvascular Endothelial Cell Line as an In Vitro Blood Brain Barrier Model

18.7K vistas.  University of Wurzburg. Este método se describe cómo aislar e inmortalizar las células endoteliales microvasculares de cerebro de ratón. Se describe un protocolo paso a paso a partir de la homogeneización del tejido cerebral, las fases de digestión, la siembra y la inmortalización de las células. Por lo general, toma alrededor de cinco semanas para obtener una homogénea línea inmortalizada de células endoteliales microvasculares.

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Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains technically challenging. One approach, Activation-Induced Manganese-enhanced MRI (AIM MRI), has been used successfully to map neuronal activity in rodents 1-5. In AIM MRI, Mn2+ acts a calcium analog and accumulates in depolarized neurons 6,7. Because Mn2+ shortens the T1 tissue property, regions of elevated neuronal activity will enhance in MRI. Furthermore, Mn2+ clears slowly from the activated regions; therefore, stimulation can be performed outside the magnet prior to imaging, enabling greater experimental flexibility. However, because Mn2+ does not readily cross the blood-brain barrier (BBB), the need to open the BBB has limited the use of AIM MRI, especially in mice.
One tool for opening the BBB is ultrasound. Though potentially damaging, if ultrasound is administered in combination with gas-filled microbubbles (i.e., ultrasound contrast agents), the acoustic pressure required for BBB opening is considerably lower. This combination of ultrasound and microbubbles can be used to reliably open the BBB without causing tissue damage 8-11.
Here, a method is presented for performing AIM MRI by using microbubbles and ultrasound to open the BBB. After an intravenous injection of perflutren microbubbles, an unfocused pulsed ultrasound beam is applied to the shaved mouse head for 3 minutes. For simplicity, we refer to this technique of BBB Opening with Microbubbles and UltraSound as BOMUS 12. Using BOMUS to open the BBB throughout both cerebral hemispheres, manganese is administered to the whole mouse brain. After experimental stimulation of the lightly sedated mice, AIM MRI is used to map the neuronal response.
To demonstrate this approach, herein BOMUS and AIM MRI are used to map unilateral mechanical stimulation of the vibrissae in lightly sedated mice 13. Because BOMUS can open the BBB throughout both hemispheres, the unstimulated side of the brain is used to control for nonspecific background stimulation. The resultant 3D activation map agrees well with published representations of the vibrissae regions of the barrel field cortex 14. The ultrasonic opening of the BBB is fast, noninvasive, and reversible; and thus this approach is suitable for high-throughput and/or longitudinal studies in awake mice.

A technique is described for broadly opening the blood-brain barrier in the mouse using microbubbles and ultrasound. Using this technique, manganese can be administered to the mouse brain. Because manganese is an MRI contrast agent that accumulates in depolarized neurons, this approach enables imaging of neuronal activity.

Neuroimagen Funcional Utilizando ultrasonidos hematoencefálica perturbación de la barrera y la RM-manganeso mayor

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Investigación

Neurociencias

Isolation of Primary Murine Brain Microvascular Endothelial Cells

The blood-brain-barrier is ultrastructurally assembled by a monolayer of brain microvascular endothelial cells (BMEC) interconnected by a junctional complex of tight and adherens junctions. Together with other cell-types such as astrocytes or pericytes, they form the neurovascular unit (NVU), which specifically regulates the interchange of fluids, molecules and cells between the peripheral blood and the CNS. Through this complex and dynamic system BMECs are involved in various processes maintaining the homeostasis of the CNS. A dysfunction of the BBB is observed as an essential step in the pathogenesis of many severe CNS diseases. However, specific and targeted therapies are very limited, as the underlying mechanisms are still far from being understood. 
Animal and in vitro models have been extensively used to gain in-depth understanding of complex physiological and pathophysiological processes. By reduction and simplification it is possible to focus the investigation on the subject of interest and to exclude a variety of confounding factors. However, comparability and transferability are also reduced in model systems, which have to be taken into account for evaluation. The most common animal models are based on mice, among other reasons, mainly due to the constantly increasing possibilities of methodology. In vitro studies of isolated murine BMECs might enable an in-depth analysis of their properties and of the blood-brain-barrier under physiological and pathophysiological conditions. Further insights into the complex mechanisms at the BBB potentially provide the basis for new therapeutic strategies.
This protocol describes a method to isolate primary murine microvascular endothelial cells by a sequence of physical and chemical purification steps. Special considerations for purity and cultivation of MBMECs as well as quality control, potential applications and limitations are discussed.

Brain microvascular endothelial cells (BMEC) are interconnected by specific junctional proteins forming a highly regulated barrier separating blood and the central nervous system (CNS), the so-called blood-brain-barrier (BBB). The isolation of primary murine brain microvascular endothelial cells, as discussed in this protocol, enables detailed in vitro studies of the BBB.

Aislamiento de células primaria murino cerebro endoteliales microvasculares

The blood-brain-barrier is ultrastructurally assembled by a monolayer of brain microvascular endothelial cells (BMEC) interconnected by a junctional ...

Interfacing 3D Engineered Neuronal Cultures to Micro-Electrode Arrays: An Innovative In Vitro Experimental Model

Currently, large-scale networks derived from dissociated neurons growing and developing in vitro on extracellular micro-transducer devices are the gold-standard experimental model to study basic neurophysiological mechanisms involved in the formation and maintenance of neuronal cell assemblies. However, in vitro studies have been limited to the recording of the electrophysiological activity generated by bi-dimensional (2D) neural networks. Nonetheless, given the intricate relationship between structure and dynamics, a significant improvement is necessary to investigate the formation and the developing dynamics of three-dimensional (3D) networks. In this work, a novel experimental platform in which 3D hippocampal or cortical networks are coupled to planar Micro-Electrode Arrays (MEAs) is presented. 3D networks are realized by seeding neurons in a scaffold constituted of glass microbeads (30-40 &#181;m in diameter) on which neurons are able to grow and form complex interconnected 3D assemblies. In this way, it is possible to design engineered 3D networks made up of 5-8 layers with an expected final cell density. The increasing complexity in the morphological organization of the 3D assembly induces an enhancement of the electrophysiological patterns displayed by this type of networks. Compared with the standard 2D networks, where highly stereotyped bursting activity emerges, the 3D structure alters the bursting activity in terms of duration and frequency, as well as it allows observation of more random spiking activity. In this sense, the developed 3D model more closely resembles in vivo neural networks.

Interfacing 3D Engineered Neuronal Cultures to Micro-Electrode Arrays: An Innovative In Vitro Experimental Model

In this work, a novel experimental model in which 3D neuronal cultures are coupled to planar Micro-Electrode Arrays (MEAs) is presented. 3D networks are built by seeding neurons in a scaffold made up of glass microbeads on which neurons grow and form interconnected 3D structures.

Interfaz culturas 3D Engineered neuronales a micro-electrodos matrices: un innovador<em&gt; In Vitro</em&gt; Modelo Experimental

Currently, large-scale networks derived from dissociated neurons growing and developing in vitro on extracellular micro-transducer devices are the ...

Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method

This protocol is a practical guide to the N-methyl-D-glucamine (NMDG) protective recovery method of brain slice preparation. Numerous recent studies have validated the utility of this method for enhancing neuronal preservation and overall brain slice viability. The implementation of this technique by early adopters has facilitated detailed investigations into brain function using diverse experimental applications and spanning a wide range of animal ages, brain regions, and cell types. Steps are outlined for carrying out the protective recovery brain slice technique using an optimized NMDG artificial cerebrospinal fluid (aCSF) media formulation and enhanced procedure to reliably obtain healthy brain slices for patch clamp electrophysiology. With this updated approach, a substantial improvement is observed in the speed and reliability of gigaohm seal formation during targeted patch clamp recording experiments while maintaining excellent neuronal preservation, thereby facilitating challenging experimental applications. Representative results are provided from multi-neuron patch clamp recording experiments to assay synaptic connectivity in neocortical brain slices prepared from young adult transgenic mice and mature adult human neurosurgical specimens. Furthermore, the optimized NMDG protective recovery method of brain slicing is compatible with both juvenile and adult animals, thus resolving a limitation of the original methodology. In summary, a single media formulation and brain slicing procedure can be implemented across various species and ages to achieve excellent viability and tissue preservation.

Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method

This protocol demonstrates the implementation of an optimized N-methyl-D-glucamine (NMDG) protective recovery method of brain slice preparation. A single media formulation is used to reliably obtain healthy brain slices from animals of any age and for diverse experimental applications.

Preparación de rebanadas cerebrales agudas mediante un optimizado N-metil-D-glucamine recuperación protección método

This protocol is a practical guide to the N-methyl-D-glucamine (NMDG) protective recovery method of brain slice preparation. Numerous recent studies have ...

An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers

Blood-brain barrier (BBB) is a specialized barrier that protects the brain microenvironment from toxins and pathogens in the circulation and maintains brain homeostasis. The principal sites of the barrier are endothelial cells of the brain capillaries whose barrier function results from tight intercellular junctions and efflux transporters expressed on the plasma membrane. This function is regulated by pericytes and astrocytes that together form the neurovascular unit (NVU). Several neurological diseases such as stroke, Alzheimer&#39;s disease (AD), brain tumors are associated with an impaired BBB function. Assessment of the BBB permeability is therefore crucial in evaluating the severity of the neurological disease and the success of the treatment strategies employed.
We present here a simple yet robust permeability assay that have been successfully applied to several mouse models both, genetic and experimental. The method is highly quantitative and objective in comparison to the tracer fluorescence analysis by microscopy that is commonly applied. In this method, mice are injected intraperitoneally with a mix of aqueous inert fluorescent tracers followed by anesthetizing the mice. Cardiac perfusion of the animals is performed prior to harvesting brain, kidneys or other organs. Organs are homogenized and centrifuged followed by fluorescence measurement from the supernatant. Blood drawn from the cardiac puncture just before perfusion serves for normalization purpose to the vascular compartment. The tissue fluorescence is normalized to the wet weight and serum fluorescence to obtain a quantitative tracer permeability index. For additional confirmation, the contralateral hemi-brain preserved for immunohistochemistry can be utilized for tracer fluorescence visualization purposes.

An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers

Here we present a mouse brain vascular permeability assay using intraperitoneal injection of fluorescent tracers followed by perfusion that is applicable to animal models of blood-brain barrier dysfunction. One hemi-brain is used for assessing permeability quantitatively and the other for tracer visualization/immunostaining. The procedure takes 5 - 6 h for 10 mice.

Un en Vivo Barrera Blood - brain permeabilidad ensayo en ratones usando fluorescencia etiquetada trazadores

Blood-brain barrier (BBB) is a specialized barrier that protects the brain microenvironment from toxins and pathogens in the circulation and maintains ...

An In Vivo Assessment of Blood-Brain Barrier Disruption in a Rat Model of Ischemic Stroke

Ischemic stroke leads to vasogenic cerebral edema and subsequent primary brain injury, which is mediated through destruction of the blood-brain barrier (BBB). Rats with induced ischemic stroke were established and used as in vivo models to investigate the functional integrity of the BBB. Spectrophotometric detection of Evans blue (EB) in the brain samples with ischemic injury could provide reliable justification for the research and development of novel therapeutic modalities. This method generates reproducible results, and is applicable in any laboratory without a need for special equipment. Here, we present a visualized and technical guideline on the detection of the extravasation of EB following induction of ischemic stroke in rats.

An In Vivo Assessment of Blood-Brain Barrier Disruption in a Rat Model of Ischemic Stroke

The overall goal of this procedure is to provide a highly reproducible technique for in vivo assessment of the blood-brain barrier disruption in rat models of ischemic stroke.

Una evaluación In Vivo de la interrupción de la Barrera Blood - Brain en un modelo de rata de ictus isquémico

Ischemic stroke leads to vasogenic cerebral edema and subsequent primary brain injury, which is mediated through destruction of the blood-brain barrier ...

A Preclinical Model to Assess Brain Recovery After Acute Stroke in Rats

The purpose of this study was to establish and validate an animal brain ischemia model in the recovery and sequela stages. A middle cerebral artery occlusion/reperfusion (MCAO/R) model in male Sprague-Dawley rats was chosen. By changing the rat&#39;s weight (260&#8722;330 g), the thread bolt type (2636/2838/3040/3043) and the brain infarct time (2-3 h), a higher Longa&#39;s score, a larger infarct volume and a greater model success ratio were screened using the Longa&#39;s score and TTC staining. The optimum model condition (300 g, 3040 thread bolt, 3 h brain infarct time) was acquired and used in a 1-90 day observation period after reperfusion via assessment of sensorimotor functions and infarct volume. At these conditions, the bilateral asymmetry test had a significant difference from 1 to 90 days, and the grid-walking test had a significant difference from 1 to 60 days; both differences could be a suitable sensorimotor functional test. Thus, the most appropriate condition of a novel rat model in the recovery and sequela stages of brain ischemia was found: 300 g rats that underwent MCAO with a 3040 thread bolt for a 3 h brain infarct and then reperfused. The appropriate sensorimotor functional tests were a bilateral asymmetry test and a grid-walking test.

The&#160;purpose of this study is to establish and validate an animal model for research in the recovery and sequela stages of brain ischemia by testing brain infarction and sensorimotor function after middle cerebral artery occlusion/reperfusion (MCAO/R) after 1-90 days in rats.

Un modelo preclínico para evaluar la recuperación cerebral después de un accidente cerebrovascular agudo en ratas

The purpose of this study was to establish and validate an animal brain ischemia model in the recovery and sequela stages. A middle cerebral artery ...

Whole Neonatal Cochlear Explants as an In vitro Model

Untreated hearing loss imposes significant costs on the global healthcare system and impairs individuals' quality of life. Sensorineural hearing loss is characterized by the cumulative and irreversible loss of sensory hair cells and auditory nerves in the cochlea. Entire and vital cochlear explants are one of the fundamental tools in hearing research to detect hair cell loss and to characterize the molecular mechanisms of the inner ear cells. Many years ago, a protocol for neonatal cochlear isolation was developed, and although it has been modified over time, it still holds potential for improvement. 
This paper presents an optimized protocol for isolating and culturing whole neonatal cochlear explants in multi-well culture chambers that enables the study of hair cells and spiral ganglion neuron cells along the entire length of the cochlea. The protocol was tested using cochlear explants from mice and rats. Healthy cochlear explants were obtained to study the interaction between hair cells, spiral ganglion neuron cells, and the surrounding supporting cells. 
One of the main advantages of this method is that it simplifies the organ culture steps without compromising the quality of the explants. All three turns of the organ of Corti are attached to the bottom of the chamber, which facilitates in vitro experiments and the comprehensive analysis of the explants. We provide some examples of cochlear images from different experiments with live and fixed explants, demonstrating that the explants retain their structure despite exposure to ototoxic drugs. This optimized protocol can be widely used for the integrative analysis of the mammalian cochlea.

Whole Neonatal Cochlear Explants as an In vitro Model

The current protocol updates previous protocols and incorporates relatively straightforward approaches for culturing high-quality cochlear explants. This provides reliable data acquisition and high-resolution imaging in live and fixed cells. This protocol supports the ongoing trend of studying inner ear cells.

Explantes cocleares neonatales enteros como modelo in vitro

Untreated hearing loss imposes significant costs on the global healthcare system and impairs individuals' quality of life. Sensorineural hearing loss is ...

Medición de la resistencia transendotelial para evaluar la integridad de la barrera celular

Barrier Functional Integrity Recording on bEnd.3 Vascular Endothelial Cells via Transendothelial Electrical Resistance Detection

The blood-brain barrier (BBB) is a dynamic physiological structure composed of microvascular endothelial cells, astrocytes, and pericytes. By coordinating the interaction between restricted transit of harmful substances, nutrient absorption, and metabolite clearance in the brain, the BBB is essential in preserving central nervous system homeostasis. Building in vitro models of the BBB is a valuable tool for exploring the pathophysiology of neurological disorders and creating pharmacological treatments. This study describes a procedure for creating an in vitro monolayer BBB cell model by seeding bEnd.3 cells into the upper chamber of a 24-well plate. To assess the integrity of cell barrier function, the conventional epithelial cell voltmeter was used to record the transmembrane electrical resistance of normal cells and CoCl2-induced hypoxic cells in real-time. We anticipate that the above experiments will provide effective ideas for the creation of in vitro models of BBB and drugs to treat disorders of central nervous system diseases.

Autor destacado: Aplicaciones de la detección de TEER para evaluar la integridad de la barrera celular 

This protocol describes a dependable and efficient in vitro model of the brain blood barrier. The method uses mouse cerebral vascular endothelial cells bEnd.3 and measures transmembrane electrical resistance.

Registro de la integridad funcional de la barrera en las células endoteliales vasculares bEnd.3 mediante detección de resistencia eléctrica transendotelial

The blood-brain barrier (BBB) is a dynamic physiological structure composed of microvascular endothelial cells, astrocytes, and pericytes. By coordinating ...