Este trabajo fue financiado por becas de los Institutos Nacionales de Salud, Instituto Nacional del Cáncer (1R21CA141039), BD Premio Beca de Investigación de Biociencias, la Sociedad Americana del Cáncer Investigación Institucional Grant (IRG # 58-006-53), al Centro de la Universidad de Purdue para el cáncer Investigación y los Institutos Canadienses de la Programa de Iniciativas de Investigación del Cáncer de Alberta Junta de Investigación y Salud. MP fue apoyada por los Institutos Nacionales de Salud, Instituto Nacional del Cáncer, Programa de Prácticas de Prevención del Cáncer (R25CA128770; PI: D. Teegarden), administrado por el Centro de Ciencias Oncológicas y el Centro de Investigación de aprendizaje por descubrimiento en la Universidad Purdue.

1. Anticipo para la Preparación <ol><li> Mantenga pipetas serológicas estériles y puntas de pipeta a 4 ° C. Solución de problemas: geles de Matrigel a temperatura ambiente (RT); utilizando pipetas fríos y consejos evitarán Matrigel gelifique durante la configuración de la cultura. </li><li> Descongelar una botella de Matrigel en 4 ° C durante la noche. </li></ol> 2. Preparación de los reactivos <ol><li> Preparación de la solución de fibronectina existencia: Haga una solución de 1 mg / ml de fibronectina disolviendo 100 mg de fibronectina humana en 100 ml de agua destilada. Una vez que la fibronectina se ha disuelto, filtro estéril, alícuota y almacena a 4 º C durante un máximo de 6 meses. Solución de problemas: Si la fibronectina no se disuelve rápidamente incubar la solución durante unos minutos en un juego de baño de agua a 37 ° C. </li><li> Preparación de 10x PBS: Disolver 80 g de cloruro de sodio NaCl, 14,4 g de Na 2 HPO 4, 2 g de KCl y 2,4 g de KH 2 PO <sub&gt; 4 en 1 L de agua destilada. Ajuste el pH a 7.4, filtro estéril, y almacenar a 4 ° C durante un máximo de 6 meses. </li><li> Preparación de tampón de neutralización 20: Hacer una solución que contenía HEPES 100 mM en 2x tampón fosfato salino (PBS) usando 1 M de HEPES y 10x soluciones madre de PBS. Ajustar el pH de la solución a 7,0. Almacenar a 4 ° C durante 2-3 meses. </li><li> Preparación de 2 mg / ml solución de cola de rata colágeno de tipo I: Hacer una solución de 2 mg / ml de colágeno I en el tampón de neutralización (etapa 2.3). Agite la solución a baja velocidad y mezclar suavemente con la pipeta hacia arriba y hacia abajo. Como este colágeno es muy viscoso, evitar la generación de burbujas de aire, mientras que el pipeteado. Se recomienda preparar la solución de colágeno I fresca cada vez. Guardar la solución en hielo hasta su uso. </li><li> Preparación de recubrimiento endosteal (rend): Mezclar 1 mg / ml de stock fibronectina con 2 mg / ml de colágeno I Stock (pasos 2,1 y 2,4) a una concentración final de 77 mg / ml y 29 mg / ml, respectivamente, en 1x y# 160; PBS estéril. Mezclar y almacenar a 4 ° C durante un máximo de 1 mes. </li><li> Preparación de la matriz del hueso reconstruido (RBM): <ol><li> PreCool 1,5 ml tubos de microcentrífuga en hielo. Mantenga todas las soluciones de la matriz en el hielo en todo momento. </li><li> Mezclar 4 partes de Matrigel (concentración Matrigel varía de lote a lote, pero no se encontraron las variaciones insignificantes), 2,5 partes de 1 mg / ml de fibronectina y 1 parte de 2 mg / ml de colágeno I en el hielo por primera pipeta Matrigel en el tubo utilizando puntas de pipeta frías y luego añadir la fibronectina y el colágeno I. Matrigel se iniciará la solidificación a temperaturas superiores a 4 ° C, por lo que trabajar rápidamente, mientras que el pipeteado de Matrigel. Mezclar la matriz muy suavemente la pipeta hacia arriba y hacia abajo, evitar la introducción de burbujas. Mantener los tubos en hielo mientras se mezcla la RBM. </li></ol></li><li> Preparación del medio de cultivo de médula ósea (BMGM): Hacer 500 ml de BMGM contienen 6,2 x 10 -4 M CaCl 2, succinato sódico 10 -6 M, 10 -6 M hidrocortisona, 20% de plasma humano (normal o maligna recogida de donantes sanos o pacientes), y 1% de penicilina / estreptomicina en medio RPMI-1640. CaCl2, succinato de sodio, y suplementos de hidrocortisona pueden ser almacenadas a -80 ° C durante&gt; 6 meses como 1000 x soluciones madre. Al crecer líneas celulares, suero bovino fetal (FBS) puede ser sustituido por el plasma humano. </li><li> Preparación de 10% neutros formalina tamponada (NBF): Añadir una solución de formaldehído al 37% de stock a 1x PBS a 10% v / v Mezclar bien y almacenar a temperatura ambiente durante 2-3 semanas protegidos de la luz. </li><li> Preparación de 1% de albúmina de suero bovino (BSA): Pesar cantidad apropiada de BSA y disolverlo en 1x PBS. Almacenar a 4 ° C y utilizar dentro de 1 semana. Solución de BSA tiende a contaminarse si se mantiene refrigerado por períodos más largos. Alternativamente, solución de BSA se puede dividió en alícuotas y se congeló a -20 ° C para almacenamiento a largo plazo. Evite los ciclos de congelación-descongelación. </li><li> Preparación de la solución de recuperación de células (CRS): Marca EDTA 5 mM, vanadato de sodio 1 mM (Na &lt;sub&gt; 3 VO 4) y 1,5 mM de fluoruro de sodio solución (NaF) en 1x PBS. Filtro estéril y se almacena a 4 ° C hasta 6 meses. </li></ol> 3. Embedded 3-D cultivo de células BM humano no malignas y malignas <ol><li> Purificar células mononucleares primarias de BM de Ficoll-Plaque centrifugación en gradiente de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Paso opcional: las células se pueden etiquetar con 0,25 M de diacetato de carboxifluoresceína, succinimidil éster (CFSE) según las instrucciones del fabricante para seguir la proliferación celular durante todo el período de cultivo. Solución de problemas: Si las células mueren después de la tinción CFSE, se valora la cantidad de CFSE como la concentración depende del tipo de célula; 0,25 M funciona bien para las células mononucleares primarias de BM. </li><li> Añadir 65 l de solución Rend en cada pocillo de una placa de cultivo tratado de tejidos de 48 pocillos. Corre la solución de manera uniforme para cubrir toda la superficie del pocillo e incubar durante&gt; 30min a TA. </li><li> Preparar la suspensión de células a una densidad de células de 0,5 x 10 6 en 10 l de 1x PBS por pocillo de una placa de 48 pocillos. En un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml mezclar la suspensión de células con 100 l de matriz de la GBR por pocillo. Mezclar las células y la matriz de gestión por resultados con la pipeta suavemente hacia arriba y hacia abajo; evitar la introducción de burbujas. Mantener la mezcla de células / matriz sobre hielo para evitar la gelificación de la matriz. Nota: el sistema de gestión por resultados es totalmente escalable, para configurar el sistema en un formato que no sea de 48 pocillos, ajustar las cantidades de todos los reactivos (matrices y medianas) en base a la superficie de la placa utilizada. Escala el número de células para ser chapados en consecuencia. </li><li> Aspirar el restante Rend y agregue la mezcla de células / matriz en el centro de un pozo. Rápidamente, se extendió la mezcla de células / matriz para cubrir toda la superficie del pozo de manera uniforme. Coloque la placa durante 30-60 min en 37 ° C, 5% de CO 2 incubador de cultivo de tejido para permitir que la matriz se solidifique. No sacuda ni disTurb la placa durante la incubación. Solución de problemas: Para evitar la distribución desigual de las células en la RBM, mezclar bien antes de la siembra. Mezclar después de cada 5 ª bien presentado para evitar las células de sedimentación a la parte inferior del tubo. Una vez chapado, las células no se hunden hasta el fondo del pozo debido a la tensión superficial en la matriz. Solución de problemas: Para evitar la distribución desigual de las células en la RBM, mezclar bien antes de la siembra. Mezclar después de cada 5 ª bien presentado para evitar las células de sedimentación a la parte inferior del tubo. Una vez chapado, las células no se hunden hasta el fondo del pozo debido a la tensión superficial en la matriz. </li><li> Precaliente BMGM en un baño de agua ajustado a 37 ° C. </li><li> Después de 30 minutos, compruebe que la matriz se ha establecido correctamente, sino que formará un gel suave como la capa que no se mueve cuando se inclina el plato. Superposición de la capa de células / matriz con 1 ml de agua tibia BMGM. Para evitar el desgarro de la pipeta matriz el medio muy suavemente (dispensación gota a gota) utilizandouna pipeta serológica. Coloque la cultura de gestión por resultados montaje en un 37 ° C, 5% de CO 2 incubadora tejido la cultura y de la cultura para el período de tiempo deseado. Nota: la viabilidad celular se mantiene durante al menos 30 días sin cambio de medio, y si se requiere cambio de medio sólo cambiar 50% de medio de cada vez. Paso crítico: Es fundamental que el medio no es frío como la temperatura fría puede molestar a la matriz ya establecido. Tenga cuidado de no rociar el medio en la parte superior de la matriz en la que se puede romper la capa de matriz blanda. Solución de problemas: Si la viabilidad celular en el sistema de gestión por resultados es baja, la densidad celular puede tener que ser determinado experimentalmente cuando se trabaja con células que no sean células mononucleares primarias de BM aspirados. Cuando se trabaja con líneas celulares, disminuir el número de células de 10 veces, como líneas celulares inmortalizadas proliferan más rápido que las células primarias. </li></ol> 4. Imaging &#39;en-matriz&#39; <ol><li><strong&gt; Microscopía de luz <ol><li> Imagen de las células cultivadas directamente en RBM utilizando campo claro, contraste de interferencia diferencial (DIC), confocal o cualesquiera otras técnicas de imagen que permiten imágenes de larga distancia como la matriz es de aproximadamente 1 mm de espesor. Utilice la función Z-stack disponible en muchos de los microscopios para tomar imágenes de todo la cultura, de arriba abajo. </li></ol></li><li> La tinción de inmunofluorescencia Consejo: Para el protocolo de inmunotinción abajo evitar aspirar las soluciones de tinción / lavado, en lugar inclinar el plato y quitar las soluciones con una pipeta. <ol><li> Retire la BMGM utilizando una pipeta y lavar 2-3x con 100 l / lavado / pocillo de RT 1x PBS. Asegúrese de que suficiente PBS se utiliza para cubrir toda la superficie del pozo. </li><li> Fijar las células en la matriz mediante la adición de 100 l / pocillo (para una placa de 48 pocillos) de NBF al 10% durante 15 min a TA. Retire NBF y lavar las células dos veces con 100 l / lavado / pocillo de RT 1x PBS. Nota: Evite el uso de frío NBF ya que puede licuar la matriz. </li><li> Retirar PBS, añadir 1% de BSA durante 1 hora a TA o a 4 º C durante la noche con el fin de bloquear la unión no específica de anticuerpos. </li><li> Preparar la solución de anticuerpo primario en 1% de BSA a la dilución requerida. La dilución variará para cada anticuerpo, consulte con el fabricante o el titular para determinar la concentración óptima de anticuerpos. Añadir 100 l / pocillo de solución de anticuerpo primario y se incuba siguiendo las instrucciones del fabricante. Paso crítico: Todas las incubaciones que implican anticuerpos conjugados con fluoróforos o colorantes fluorescentes deben ser realizadas en la oscuridad. </li><li> Elimine la solución de anticuerpo primario y lavar 3 veces con 1x PBS durante 5 min. </li><li> Para la tinción de inmunofluorescencia indirecta, incubar con un anticuerpo secundario conjugado con sonda fluorescente durante 1 hora a TA. Diluir los anticuerpos en el 1% de BSA a una concentración sugerido por el fabricante. </li><li> Retire el secundariosolución ntibody y lavar 3 veces con 1x PBS durante 5 min. Solución de problemas: Para evitar el alto fondo durante la exploración, se valorarán los anticuerpos secundarios conjugados con fluorescencia y utilizar la menor concentración que proporciona la señal sea adecuada. Si alto fondo sigue siendo un problema, aumentar el número y la duración de las etapas de lavado, o utilizar anticuerpos primarios conjugados directamente, y omita el paso 4.2.6. </li><li> Para la tinción de los núcleos añaden 4 &#39;,6-diamino-2-fenilindol (DAPI) solución de tinción nuclear, a la dilución sugerido por el fabricante, y se incuba durante 7-10 min a TA. </li><li> Elimine la solución de tinción nuclear y lavar 2 veces con 1x PBS durante 5 min. </li><li> Retire la PBS desde el último lavado y añadir una gota de medio de montaje (juego regular), en la muestra de preservar la fluorescencia. Imagen con la configuración de excitación / emisión apropiados en un microscopio de fluorescencia o confocal. Nota: Imaging debe hacerse dentro de los 2 días de tinciónpara evitar la degradación de la matriz y la pérdida de la integridad de la GBR y la pérdida de la señal fluorescente. Si no reflejado de inmediato, las muestras teñidas deben mantenerse a 4 ° C, protegido de la luz, hasta imágenes. </li></ol></li></ol> 5. Aislamiento de células de RBM <ol><li> Retire medio suavemente sin alterar la capa de matriz. No aspirar. </li><li> Lavar las células 2 veces con PBS 1x estéril. No aspirar. </li><li> Añadir 0,5 ml de CRS frío de hielo a cada pocillo y quitar la capa de la matriz entera junto con las células, pipeteando enérgicamente arriba y hacia abajo. Recoger las células, matriz y el SRC en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Coloque sobre hielo. </li><li> Añadir un adicional de 0,5 ml de CRS para el mismo pozo y recoger todo el material restante. Traslado al mismo tubo de microcentrífuga. </li><li> Vortex la mezcla de células, matriz y el SRC e incubar en hielo durante 1 hora. Células Vortex cada 15 min para facilitar la liberación de la matriz. </li><li> Echa la mezcla después de 1 hora, sin grumos visiblesde la matriz debe estar presente. Solución de problemas: si matas de matriz son todavía visibles después de 1 hora, las células de transferencia / matriz / mezcla de CRS a un tubo más grande, añadir 2-5 ml adicional de CRS, y se incuba durante un adicional de 30 a 60 min. </li><li> Centrifugar las células en CRS a 1.000 rpm durante 5 a 10 min a 4 ° C. Eliminar el sobrenadante y resuspender el botón celular en 1 ml de PBS 1x frío. </li><li> Centrifugar a 1000 rpm durante 5-10 min y separar el sobrenadante. Repita el lavado con PBS una vez más. </li><li> El segundo lavado con PBS completa la recuperación de las células de la matriz y las células aisladas se puede utilizar para todas las aplicaciones aguas abajo, tales como el aislamiento de ADN / ARN / proteína, citometría de flujo, el trasplante in vivo, etc. </li></ol>

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Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

El modelo de gestión por resultados proporciona un sistema integral donde la composición celular del BM se mantiene ex vivo por hasta 30 días. BM células cultivadas en la auto-estratificar RBM según su función imitando de cerca la arquitectura BM encontrado in vivo. Por otra parte, este es el primer sistema que permite la expansión del clon mieloma múltiple 8. Los pasos más importantes para garantizar el sólido crecimiento de las células de BM y el éxito general de la cultura son...

El cultivo de tejidos se ha desarrollado para estudiar el comportamiento de células en un entorno controlado para minimizar la variabilidad sistémica cuando la comparación de diversos procesos en organismos intactos. Este método se estableció por primera vez en el 1900 y 1,2 se refiere a una técnica en explantes de tejidos fueron cultivadas ex vivo en un plato de cristal. A mediados de la década de 1900 el sistema fue adaptado para hacer crecer células dispersas en lugar de fragmentos de tejidos intactos, y los términos &quot;cultivo de tejidos&quot; y &quot;cultivo celular&quot; se convirtió en sinónimo de 3. En tales sistemas de cultivo celular convencionales células se cultivan en la superficie del plástico de cultivo de tejidos superpuestos con medio de crecimiento suplementado con varios factores de crecimiento. Dos tipos de culturas han surgido sobre la base de la capacidad de adhesión de varias células: cultivo de células adherentes, donde las células se adhieren y propagan en el plástico de cultivo de tejidos y cultivos no adherentes, donde las células se propagan en suspensión. Desde los primeros días de la célulaSe han creado de cultivo, múltiples líneas de células inmortales, tales como células HeLa 4, la primera línea celular de cáncer humano. Estas líneas celulares tienen la capacidad de proliferar indefinidamente en cultivo celular, y la mayoría no requiere ningún tratamiento especial para mantener la viabilidad. El enfoque reduccionista de los métodos de cultivo de células original fue diseñado para simplificar el sistema tanto como sea posible mediante la inclusión de sólo los componentes mínimo requerido para mantener la viabilidad celular y la proliferación. Sin embargo, los enfoques de cultivo celular simplificados no apoyan ex vivo la mayoría de los tipos de células humanas primarias con finito vida útil. Por lo tanto, los nuevos sistemas de cultivo están siendo diseñados para aproximar el microambiente del tejido lo más estrechamente posible, permitiendo así que los explantes de células para crecer en condiciones fisiológicas. En contraste con los enfoques de cultivo celular convencionales / reduccionistas, 3 dimensiones (3-D) sistemas de cultivo se están convirtiendo en un método preferido para la cultura de manera eficiente varioslíneas celulares humanas y células primarias para estudiar posteriormente los mecanismos implicados en la salud y la enfermedad, en el contexto de un microambiente de apoyo. Tales sistemas de 3-D se instalan generalmente usando matrices y / o reconstruidos medio suplementado con factores de crecimiento, con el fin de recapitular el microambiente del tejido para estudiar los tipos de células de interés. La primera de estas 3 dimensiones (3-D) modelos de cultivo fue desarrollado para estudiar el desarrollo de la glándula mamaria. Para proporcionar las células con condiciones nativas células epiteliales mamarias fueron incrustados en Matrigel, colágeno IV y laminina-fuente rica de la matriz extracelular (ECM), y sobrepuesto con medio de crecimiento. Bajo tales condiciones, las células epiteliales mamarias forman racimos se asemejan a los acinos mamaria, y a la estimulación con hormonas lactogénicas, estos acinos secretadas caseína, y otras proteínas de la leche, en el hueco lúmenes de las estructuras-acinos similares. La secreción de caseína no se observó en los cultivos estándar, incluso después de la adición de prolactina 5, Enfatizando el papel de microambiente en la preservación de las características morfológicas y fenotípicas de las células. Otra demostración de la pérdida de la función celular normal cuando se toman células fuera del contexto de su microambiente fisiológica es una demostración de que sin microambiente de apoyo, los queratinocitos no pueden formar epidermis estratificada 6. Un número de otros modelos en 3-D han sido creados para permitir la propagación ex vivo de células primarias 7,8. El papel crucial de la microambiente en el comportamiento de las células se demostró con elegancia en un estudio en el que las células epiteliales mamarias forman &quot;dentro-fuera&quot; acinos cuando se cultiva en el colágeno I de la matriz, en comparación con los acinos polarizado correctamente que se formó en Matrigel. Esta pérdida de la morfología adecuada se revirtió cuando se añadieron las células mioepiteliales laminina productoras a las culturas de colágeno I 9. Por otra parte, se requiere microambiente adecuado para la exactamanifestación genotipo. Se cultiva en un plato, las células de cáncer de mama MCF7 transfectadas con una molécula de adhesión célula-célula CEACAM1 se comportan exactamente igual que las células negativas CEACAM no transfectadas. Sin embargo, cuando se cultivan en Matrigel, en contacto con ECM, forma MCF7 wildtype estructuras de tipo tumoral, mientras que las células MCF7 transfectadas con CEACAM1 revertir a un fenotipo y la forma acinos normal con lúmenes hueco, como se ha establecido con el epitelio mamario maligno 10. Del mismo modo, el bloqueo de β1-integrina en las células de cáncer de mama no cambia su comportamiento bajo condiciones de cultivo estándar, pero el mismo experimento llevado a cabo en cultivos de 3-D demuestra que el bloqueo de β1-integrina vuelve células malignas a un fenotipo normal 11. Por lo tanto, microambiente del tejido no sólo es necesaria para mantener la viabilidad celular, sino también para retener la función apropiada de la célula. Además de proporcionar un sistema en el comportamiento de la célula puede ser estudiado bajo condiciones fisiológicass, culturas 3-D función de medio tan robusto y fiable para la prueba preclínica de nuevas terapias 8,12,13. El cultivo de las células en 3-D permite el cribado de compuestos en investigación en las condiciones de medio ambiente mediada por resistencia a las drogas 14, donde la contribución de célula-célula y célula-ECM adherencia puede ser evaluada. Además, fuera del objetivo toxicidad de nuevos compuestos puede determinarse mediante la incorporación de múltiples compartimentos celulares de diversos tejidos. Estas pantallas se pueden realizar más rápidamente y son más rentables que los de los estudios comparables en vivo 8. Aquí les presentamos una configuración de un modelo 3-D de la médula ósea reconstruida (RBM), donde las células de la médula ósea normal y maligno (BM) proliferan ex vivo en un sistema que imita muy de cerca el microambiente de la BM humano. Los intentos previos de cultivo de células primarias BM humanos en cultivos de 2-D, líquido o co-cultivos adherentes con diversos componentes de la BM estromaO 3-D, cultivos de agar semi-sólidos han tenido un éxito limitado debido a su incapacidad para abastecer las células con los componentes del microambiente del tejido 15-18. En estos sistemas de células primarias de BM tenían escasa viabilidad y no lograron proliferar ex vivo. Otro sistema donde las células progenitoras BM humanos se cultivan en co-cultivos de esferoides con células estromales de BM es un sistema de 3-D que se sufrió la viabilidad de células madre hematopoyéticas y la proliferación durante al menos 96 h 19. Sin embargo, aunque altamente beneficioso para la comprensión de la biología progenitoras hematopoyéticas, este sistema no recapitula fielmente el microambiente de la BM debido a la ausencia de componentes de ECM, por lo tanto, limitando su utilidad. El modelo de gestión por resultados descritos aquí presenta un sistema integral donde ambos compartimentos celulares y extracelulares del BM humana se reconstruyen in vitro. Se demuestra que las culturas de gestión por resultados pueden apoyar el crecimiento ex vivo de las células BM humanos normales, como hemosLL como células aisladas de pacientes con diversos trastornos hematológicos.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="877">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:328px;">CellTrace CFSE proliferation kit-for flow cytometry</td>
			<td style="width:239px;">Invitrogen/Life technologies</td>
			<td style="width:108px;">C34554</td>
			<td style="width:203px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:328px;">Fibronectin from human plasma</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>NG1884448</td>
			<td style="width:203px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:328px;">Ficoll-Paque PLUS</td>
			<td>GE Lifesciences</td>
			<td>17-1440-02</td>
			<td style="width:203px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:328px;">Matrigel basement membrane matrix</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>354234</td>
			<td style="width:203px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:328px;">Rat tail collagen type I</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>354249</td>
			<td style="width:203px;">Collagen I from Millipore does not polimerize properly using this protocol</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:328px;">Vectashield mounting medium for fluorescence (regular set)</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1000</td>
			<td style="width:203px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:328px;">SigmaFast Red TR/Napthol AS-MX tablets</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F4648</td>
			<td style="width:203px;">For TRAP staining</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:328px;">SigmaFast BCIP/NBT tablets</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B5655</td>
			<td style="width:203px;">For alkaline phosphatase staining</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:328px;">Zeiss confocal LSM 510 microscope&#160;</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td style="width:203px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:328px;">Zeiss 510 software</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td style="width:203px;">Image analysis software for confocal analysis</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:328px;">Zeiss Axiovert 200M inverted microscope&#160;</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td style="width:203px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:328px;">MetaMorph software</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td style="width:203px;">Image analysis software for Axiovert 200M</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:328px;">FACSort flow cytometer&#160;</td>
			<td>BD biosciences</td>
			<td></td>
			<td style="width:203px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:328px;">CellQuest Pro software&#160;</td>
			<td>BD biosciences</td>
			<td></td>
			<td style="width:203px;">Software for the analysis of flow cytometry data</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a three-dimensional tissue culture model to study primary human bone marrow and its malignancies

El cultivo de tejidos ha sido una herramienta muy valiosa para estudiar muchos aspectos de la función celular, desde el desarrollo normal a la enfermedad. Métodos de cultivo celular convencionales se basan en la capacidad de las células ya sea para unirse a un sustrato sólido de una placa de cultivo de tejido o para crecer en suspensión en medio líquido. Múltiples líneas celulares inmortales se han creado y crecido utilizando estos enfoques, sin embargo, estos métodos a menudo fallan cuando las células primarias necesitan ser cultivadas ex vivo. Dicha avería se ha atribuido a la ausencia de los componentes de la matriz extracelular apropiadas del microambiente del tejido de los sistemas estándar que se utiliza plástico de cultivo de tejidos como una superficie para el crecimiento celular. La matriz extracelular es un componente integral del microambiente del tejido y su presencia es crucial para el mantenimiento de las funciones fisiológicas tales como la polarización celular, la supervivencia y la proliferación. Aquí presentamos un método de cultivo de tejidos de 3 dimensiones donde cel hueso medular primariaLS se cultivan en matriz extracelular formulado para recapitular el microambiente de la médula humana (sistema de RBM). Incrustado en la matriz extracelular, las células se suministran con nutrientes a través del medio suplementado con plasma humano, proporcionando así un sistema integral donde la supervivencia y la proliferación celular se puede mantener durante hasta 30 días, mientras que el mantenimiento de la composición celular del tejido primario. Usando el sistema de gestión por resultados que hemos crecido con éxito células de médula ósea primarias de donantes sanos y en pacientes con amiloidosis, y diversas neoplasias hematológicas. El sistema de GBR permite, visualización directa en-matriz en tiempo real del comportamiento celular y evaluación de la eficacia preclínica de nuevas terapias. Por otra parte, las células se pueden aislar de la GBR y posteriormente utilizados para el trasplante in vivo, clasificación de células, citometría de flujo, y el ácido nucleico y el análisis de proteínas. En su conjunto, el método de gestión por resultados proporciona un sistema fiable para el crecimiento de huesos primario marrocélulas W en condiciones fisiológicas.

Dado que las células de médula ósea primaria fallan a proliferar en condiciones de cultivo de tejidos estándar, el sistema de GBR se ha creado para imitar el microambiente de la médula, proporcionando un sistema para la cultura y expandir las células BM ex vivo. Los principales componentes de la matriz extracelular BM, fibronectina, colágeno I, colágeno IV, laminina y 21, se incorporaron a la matriz RBM para proporcionar el andamiaje estructural de esta cultura 3-D. Endostio, la interfaz entr...

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A Three-dimensional Tissue Culture Model to Study Primary Human Bone Marrow and its Malignancies

En los métodos de cultivo estándar se toman células de su entorno fisiológico y se hicieron crecer en la superficie de plástico de un plato. Para estudiar el comportamiento de las células de médula ósea humana primaria hemos creado un sistema de cultivo de 3-D, donde las células se cultivan en condiciones que recapitulan el microambiente nativo del tejido.

Un tejido tridimensional Cultura modelo para estudiar primaria médula ósea humana y sus malignidades

Tissue culture has been an invaluable tool to study many aspects of cell function, from normal development to disease. Conventional cell culture methods ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

16.5K vistas.  Purdue University.  En los métodos de cultivo estándar se toman células de su entorno fisiológico y se hicieron crecer en la superficie de plástico de un plato. Para estudiar el comportamiento de las células de médula ósea humana primaria hemos creado un sistema de cultivo de 3-D, donde las células se cultivan en condiciones que recapitulan el microambiente nativo del tejido. 

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Human Neuroendocrine Tumor Cell Lines as a Three-Dimensional Model for the Study of Human Neuroendocrine Tumor Therapy

Neuroendocrine tumors (NETs) are rare tumors, with an incidence of two per 100,&#x200A;000 individuals per year, and they account for 0.5% of all human malignancies.1 Other than surgery for the minority of patients who present with localized disease, there is little or no survival benefit of systemic therapy. Therefore, there is a great need to better understand the biology of NETs, and in particular define new therapeutic targets for patients with nonresectable or metastatic neuroendocrine tumors. 3D cell culture is becoming a popular method for drug screening due to its relevance in modeling the in vivo tumor tissue organization and microenvironment.2,3 The 3D multicellular spheroids could provide valuable information in a more timely and less expensive manner than directly proceeding from 2D cell culture experiments to animal (murine) models.
To facilitate the discovery of new therapeutics for NET patients, we have developed an in vitro 3D multicellular spheroids model using the human NET cell lines. The NET cells are plated in a non-adhesive agarose-coated 24-well plate and incubated under physiological conditions (5% CO2, 37 &deg;C) with a very slow agitation for 16-24 hr after plating. The cells form multicellular spheroids starting on the 3rd or 4th day. The spheroids become more spherical by the 6th day, at which point the drug treatments are initiated. The efficacy of the drug treatments on the NET spheroids is monitored based on the morphology, shape and size of the spheroids with a phase-contrast light microscope. The size of the spheroids is estimated automatically using a custom-developed MATLAB program based on an active contour algorithm. Further, we demonstrate a simple method to process the HistoGel embedding on these 3D spheroids, allowing the use of standard histological and immunohistochemical techniques. 
This is the first report on generating 3D spheroids using NET cell lines to examine the effect of therapeutic drugs. We have also performed histology on these 3D spheroids, and displayed an example of a single drug's effect on growth and proliferation of the NET spheroids. Our results support that the NET spheroids are valuable for further studies of NET biology and drug development.

We present a simple agarose overlay platform to grow 3D multicellular spheroids using neuroendocrine cancer cell lines. This method provides a very convenient way to examine the effect of therapeutic drugs on the neuroendocrine tumor cells. It could also help us establish human neuroendocrine tumor spheroids for cancer therapy.

Humanos neuroendocrinos líneas de células tumorales como un modelo tridimensional para el estudio de la terapia humana tumor neuroendocrino

Neuroendocrine tumors (NETs) are rare tumors, with an incidence of two per 100,&#x200A;000 individuals per year, and they account for 0.5% of all human ...

Investigación

Medicina

Primary Culture of Human Vestibular Schwannomas

Vestibular schwannomas (VSs) represent Schwann cell (SC) tumors of the vestibular nerve, compromising 10% of all intracranial neoplasms. VSs occur in either sporadic or familial (neurofibromatosis type 2, NF2) forms, both associated with inactivating defects in the NF2 tumor suppressor gene. Treatment for VSs is generally surgical resection or radiosurgery, however the morbidity of such procedures has driven investigations into less invasive treatments. Historically, lack of access to fresh tissue specimens and the fact that schwannoma cells are not immortalized have significantly hampered the use of primary cultures for investigation of schwannoma tumorigenesis. To overcome the limited supply of primary cultures, the immortalized HEI193 VS cell line was generated by transduction with HPV E6 and E7 oncogenes. This oncogenic transduction introduced significant molecular and phenotypic alterations to the cells, which limit their use as a model for human schwannoma tumors. We therefore illustrate a simplified, reproducible protocol for culture of primary human VS cells. This easily mastered technique allows for molecular and cellular investigations that more accurately recapitulate the complexity of VS disease.

Vestibular Schwannomas (VSs) are non-malignant tumors of Schwann cell (SC) origin, associated with mutations in the NF2 tumor suppressor gene. We report a reproducible, efficient protocol for primary human VS cell culture that allows for molecular and cellular experimental manipulation and analysis and recapitulates the heterogeneous nature of human disease.

Cultivo primario de Human vestibular schwannomas

Vestibular schwannomas (VSs) represent Schwann cell (SC) tumors of the vestibular nerve, compromising 10% of all intracranial neoplasms. VSs occur in ...

Three Dimensional Cultures: A Tool To Study Normal Acinar Architecture vs. Malignant Transformation Of Breast Cells

Invasive breast carcinomas are a group of malignant epithelial tumors characterized by the invasion of adjacent tissues and propensity to metastasize. The interplay of signals between cancer cells and their microenvironment exerts a powerful influence on breast cancer growth and biological behavior1. However, most of these signals from the extracellular matrix are lost or their relevance is understudied when cells are grown in two dimensional culture (2D) as a monolayer. In recent years, three dimensional (3D) culture on a reconstituted basement membrane has emerged as a method of choice to recapitulate the tissue architecture of benign and malignant breast cells. Cells grown in 3D retain the important cues from the extracellular matrix and provide a physiologically relevant ex&#160;vivo system2,3. Of note, there is growing evidence suggesting that cells behave differently when grown in 3D as compared to 2D4. 3D culture can be effectively used as a means to differentiate the malignant phenotype from the benign breast phenotype and for underpinning the cellular and molecular signaling involved3. One of the distinguishing characteristics of benign epithelial cells is that they are polarized so that the apical cytoplasm is towards the lumen and the basal cytoplasm rests on the basement membrane. This apico-basal polarity is lost in invasive breast carcinomas, which are characterized by cellular disorganization and formation of anastomosing and branching tubules that haphazardly infiltrates the surrounding stroma. These histopathological differences between benign gland and invasive carcinoma can be reproduced in 3D6,7. Using the appropriate read-outs like the quantitation of single round acinar structures, or differential expression of validated molecular markers for cell proliferation, polarity and apoptosis in combination with other molecular and cell biology techniques, 3D culture can provide an important tool to better understand the cellular changes during malignant transformation and for delineating the responsible signaling.

Three dimensional culture of mammary epithelial cells on a reconstituted basement membrane is a useful method to recapitulate the in vivo architecture of the benign breast, and to differentiate the malignant phenotype from the benign breast phenotype. Importantly, this system can be applied to study invasive carcinomas in other tissues.

Tres Culturas dimensionales: una herramienta para estudiar normal Acinar Arquitectura vs transformación maligna de las células de la mama

Invasive breast carcinomas are a group of malignant epithelial tumors characterized by the invasion of adjacent tissues and propensity to metastasize. The ...

Quantification of Breast Cancer Cell Invasiveness Using a Three-dimensional (3D) Model

It is now well known that the cellular and tissue microenvironment are critical regulators influencing tumor initiation and progression. Moreover, the extracellular matrix (ECM) has been demonstrated to be a critical regulator of cell behavior in culture and homeostasis in vivo. The current approach of culturing cells on two-dimensional (2D), plastic surfaces results in the disturbance and loss of complex interactions between cells and their microenvironment. Through the use of three-dimensional (3D) culture assays, the conditions for cell-microenvironment interaction are established resembling the in vivo microenvironment. This article provides a detailed methodology to grow breast cancer cells in a 3D basement membrane protein matrix, exemplifying the potential of 3D culture in the assessment of cell invasion into the surrounding environment. In addition, we discuss how these 3D assays have the potential to examine the loss of signaling molecules that regulate epithelial morphology by immunostaining procedures. These studies aid to identify important mechanistic details into the processes regulating invasion, required for the spread of breast cancer.

Quantification of Breast Cancer Cell Invasiveness Using a Three-dimensional 3D Model

This article provides detailed methodologies for the use of three-dimensional (3D) assays to quantify breast cancer cell invasion. Specifically, we discuss the procedures required to set up such assays, quantification, and data analysis, as well as methods to examine the loss of membrane integrity that occurs when cells invade.

La cuantificación de la invasividad de las células del cáncer de mama El uso de un modelo (3D) Tres Dimensiones

It is now well known that the cellular and tissue microenvironment are critical regulators influencing tumor initiation and progression. Moreover, the ...

Femoral Bone Marrow Aspiration in Live Mice

Serial sampling of the cellular composition of bone marrow (BM) is a routine procedure critical to clinical hematology. This protocol describes a detailed step-by-step technical procedure for an analogous procedure in live mice which allows for serial characterization of cells present in the BM. This procedure facilitates studies aimed to detect the presence of exogenously administered cells within the BM of mice as would be done in xenograft studies for instance. Moreover, this procedure allows for the retrieval and characterization of cells enriched in the BM such as hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) without sacrifice of mice. Given that the cellular composition of peripheral blood is not necessarily reflective of proportions and types of stem and progenitor cells present in the marrow, procedures which provide access to this compartment without requiring termination of the mice are very helpful. The use of femoral bone marrow aspiration is illustrated here for cytological analysis of marrow cells, flow cytometric characterization of the hematopoietic stem/progenitor compartment, and culture of sorted HSPCs obtained by femoral BM aspiration compared with conventional marrow harvest.

This protocol describes a procedure for serial sampling of femoral bone marrow (BM) without requiring the sacrifice of mice. This procedure facilitates longitudinal studies of the BM composition of mice over time and provides serial access to cells within the BM for ex vivo and transplantation studies.

Femoral Aspiración de médula ósea en ratones vivos

Serial sampling of the cellular composition of bone marrow (BM) is a routine procedure critical to clinical hematology. This protocol describes a detailed ...

Three-dimensional Co-culture Model for Tumor-stromal Interaction

Cancer progression (initiation, growth, invasion and metastasis) occurs through interactions between malignant cells and the surrounding tumor stromal cells. The tumor microenvironment is comprised of a variety of cell types, such as fibroblasts, immune cells, vascular endothelial cells, pericytes and bone-marrow-derived cells, embedded in the extracellular matrix (ECM). Cancer-associated fibroblasts (CAFs) have a pro-tumorigenic role through the secretion of soluble factors, angiogenesis and ECM remodeling. The experimental models for cancer cell survival, proliferation, migration, and invasion have mostly relied on two-dimensional monocellular and monolayer tissue cultures or Boyden chamber assays. However, these experiments do not precisely reflect the physiological or pathological conditions in a diseased organ. To gain a better understanding of tumor stromal or tumor matrix interactions, multicellular and three-dimensional cultures provide more powerful tools for investigating intercellular communication and ECM-dependent modulation of cancer cell behavior. As a platform for this type of study, we present an experimental model in which cancer cells are cultured on collagen gels embedded with primary cultures of CAFs.

Here we present a protocol to co-culture in three-dimensions, which is useful for investigating multicellular interactions and extracellular matrix-dependent modulation of cancer cell behavior. In this experimental model, cancer cells are cultured on collagen gels embedded with human cancer-associated fibroblasts.

Tridimensional Modelo Co-cultura para la interacción tumor estromal

Cancer progression (initiation, growth, invasion and metastasis) occurs through interactions between malignant cells and the surrounding tumor stromal ...

Three-Dimensional (3D) Tumor Spheroid Invasion Assay

Invasion of surrounding normal tissues is generally considered to be a key hallmark of malignant (as opposed to benign) tumors. For some cancers in particular (e.g., brain tumors such as glioblastoma multiforme and squamous cell carcinoma of the head and neck &#8211; SCCHN) it is a cause of severe morbidity and can be life-threatening even in the absence of distant metastases. In addition, cancers which have relapsed following treatment unfortunately often present with a more aggressive phenotype. Therefore, there is an opportunity to target the process of invasion to provide novel therapies that could be complementary to standard anti-proliferative agents. Until now, this strategy has been hampered by the lack of robust, reproducible assays suitable for a detailed analysis of invasion and for drug screening. Here we provide a simple micro-plate method (based on uniform, self-assembling 3D tumor spheroids) which has great potential for such studies. We exemplify the assay platform using a human glioblastoma cell line and also an SCCHN model where the development of resistance against targeted epidermal growth factor receptor (EGFR) inhibitors is associated with enhanced matrix-invasive potential. We also provide two alternative methods of semi-automated quantification: one using an imaging cytometer and a second which simply requires standard microscopy and image capture with digital image analysis.

Three-Dimensional 3D Tumor Spheroid Invasion Assay

Invasion of surrounding normal tissues is a defining characteristic of malignant tumors. We provide here a simple, semi-automated micro-plate assay of invasion into a natural 3D biomatrix that has been exemplified with a number of models of advanced human cancers.

Tumor Ensayo tridimensional (3D) esferoide Invasion

Invasion of surrounding normal tissues is generally considered to be a key hallmark of malignant (as opposed to benign) tumors. For some cancers in ...

Three-dimensional Alginate-bead Culture of Human Pituitary Adenoma Cells

A three-dimensional culture method is described in which primary pituitary adenoma cells are grown in alginate beads. Alginate is a polymer derived from brown sea algae. Briefly, the tumor tissue is cut into small pieces and submitted to an enzymatic digestion with collagenase and trypsin. Next, a cell suspension is obtained. The tumor cell suspension is mixed with 1.2% sodium alginate and dropped into a CaCl2 solution, and the alginate/cell suspension is gelled on contact with the CaCl2 to form spherical beads. The cells embedded in the alginate beads are supplied with nutrients provided by the culture media enriched with 20% FBS. Three-dimensional culture in alginate beads maintains the viability of adenoma cells for long periods of time, up to four months. Moreover, the cells can be liberated from the alginate by washing the beads with sodium citrate and seeded on glass coverslips for further immunocytochemical analyses. The use of a cell culture model allows for the fixation and visualization of the actin cytoskeleton with minimal disorganization. In summary, alginate beads provide a reliable culture system for the maintenance of pituitary adenoma cells.

Three-dimensional culture in alginate beads, due to its simplicity and reproducibility, was chosen to maintain the pituitary adenoma cells. The procedures included an initial enzymatic digestion and mechanical dissociation of the tumor tissue, and the subsequent cell suspension was encapsulated in alginate beads.

Tridimensional de alginato-grano Cultura de células humanas del adenoma pituitario

A three-dimensional culture method is described in which primary pituitary adenoma cells are grown in alginate beads. Alginate is a polymer derived from ...

Three-Dimensional Culture Assay to Explore Cancer Cell Invasiveness and Satellite Tumor Formation

Mammalian cell culture in monolayers is widely used to study various physiological and molecular processes. However, this approach to study growing cells often generates unwanted artifacts. Therefore, cell culture in a three-dimensional (3D) environment, often using extracellular matrix components, emerged as an interesting alternative due to its close similarity to the native in vivo tissue or organ. We developed a 3D cell culture system using two compartments, namely (i) a central compartment containing cancer cells embedded in a collagen gel acting as a pseudo-primary macrospherical tumor and (ii) a peripheral cell-free compartment made of a fibrin gel, i.e. an extracellular matrix component different from that used in the center, in which cancer cells can migrate (invasion front) and/or form microspherical tumors representing secondary or satellite tumors. The formation of satellite tumors in the peripheral compartment is remarkably correlated to the known aggressiveness or metastatic origin of the native tumor cells, which makes this 3D culture system unique. This cell culture approach might be considered to assess cancer cell invasiveness and motility, cell-extracellular matrix interactions and as a method to evaluate anti-cancer drug properties.

Cancer cells are embedded in a collagen gel and then sandwiched in an acellular fibrin gel to generate a 3D culture system in which the invasiveness and formation of satellite tumors may be monitored.

Tridimensional Ensayo de Cultivo para explorar invasividad de las células del cáncer y la formación de tumores satélite

Mammalian cell culture in monolayers is widely used to study various physiological and molecular processes. However, this approach to study growing cells ...

Isometric Contractility Measurement of the Mouse Mesenteric Artery Using Wire Myography

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and drugs. It is widely used in many studies on the physiological functions of vascular smooth muscle, the pathogenesis of vascular diseases such as hypertension, and the development of smooth muscle relaxant drugs. The mouse is a widely used model animal with a large pool of disease models and genetically modified strains. We introduced this method to measure the isometric contraction of mouse mesenteric artery in detail. A 1.4-mm segment of mouse mesenteric resistance artery was isolated and mounted on a myograph chamber by passing two steel wires through its lumen. After equilibration and normalization steps, the vessel segment was potentiated by a high-K+ solution twice prior to the contraction assay. As an example of the application of this method in drug development, we measured the relaxant effect of a novel natural substance, neoliensinine, isolated from a Chinese herb, embryos of the lotus seed (Nelumbo nucifera Gaertn.) on mouse mesenteric arteries. The vessel segments mounted on the myograph chamber were stimulated with a high-K+ solution. When the force tension reached a stable sustained phase, cumulative doses of neoliensinine were added to the chamber. We found that neoliensinine had a dose-dependent relaxant effect on smooth muscle contraction, thus suggesting that it bears potential activity against hypertension. In addition, as the vessel segment can survive at least 4 hours after mounting and maintain contractility induced by the high-K+ solution for many times, we suggest that the wire myograph system may be used for the time-consuming process of drug screening.

The wire myograph technique is used to investigate vascular smooth muscle functions and screen new drugs. We report a detailed protocol for measuring the isometric contractility of the mouse mesenteric artery and for screening new relaxants of vascular smooth muscle.

Medición de la contractilidad isométrica de la arteria mesentérica de ratón con cable miografía

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and ...