Fueron financiados Estos estudios, en parte, por subvenciones de la Fundación Alternativa de Investigación y Desarrollo (107.588), el Instituto Nacional de Salud (1U54CA136465-04S1), y el Programa de Investigación del Cáncer de Seno de California (201B-0141). Agradecemos a los Dres. Andrew Wilber y R. Scott McIvor por la generosa donación de su <pkt2 lubig=""> transponson y PK / hubiC-SB11 plásmidos transposasa. Agradecemos John Tamaresis, Ph.D. para el asesoramiento sobre métodos estadísticos, Timothy Brown para realizar citometría de flujo, Georgette Henrich consejo sobre ensayos migraciones, y Nancy Bellagamba para facilitar la recogida de muestras THR. </pkt2>

Cabezas femorales se obtuvieron de los pacientes sometidos a cirugía electiva THR en el Departamento de Cirugía Ortopédica en la Escuela de Medicina de la Universidad de Stanford. Todos los tejidos se recogieron como muestras sin identificación, de acuerdo con las regulaciones de la Oficina de Cumplimiento de Investigación de la Universidad de Stanford. 1. Selección de una línea (s) Celular del Cáncer de Mama <ol><li> Obtener o transfectar la línea celular de cáncer de mama deseado (s) con un reportero luciferase construir-GFP. Los siguientes experimentos se realizaron utilizando el MCF-7 de cáncer de mama líneas celulares de ingeniería para la expresión estable de la luciferasa de luciérnaga (fLUC) y proteína fluorescente verde potenciada (EGFP) MDA-MB-231 y por transfección con el plásmido transposón de belleza durmiente pKT2 / Lubig y el pK plásmido transposasa / hubiC-SB11 45,46. NOTA: Las líneas celulares transfectadas se conocen como MDA-MB-231-fLuc-EGFP, y MCF-7-fLuc-EGFP. </li></ol> 2. Aislar Tissue Fragments de Cabezas femorales <ol><li> Después de la cirugía THR, recoger la cabeza femoral desechado en un recipiente estéril lleno de solución salina fisiológica. Transferir la muestra al laboratorio y procesarla dentro de 1-3 horas de la cirugía. Nota: si hay un retraso en el procesamiento, coloque la muestra a 4 ° C. </li><li> Prepare un área de trabajo mediante la colocación de los siguientes elementos en una estera absorbente en una campana de cultivo de tejidos de flujo laminar: guantes estériles, gubia quirúrgica, fórceps, vaso de precipitado con isopropanol al 70% para enjuagar los instrumentos y los vasos de cultivo de tejidos como se estipula a continuación para cada tipo de experimento . </li><li> El uso de un guante quirúrgico estéril para mantener la cabeza del fémur ronda en una mano, utilice la gubia en la otra mano para extraer fragmentos de hueso trabecular del tamaño deseado (~ 5.2 mm) del eje superior expuesta del fémur. Transferencia de fragmentos de hueso en el recipiente de cultivo (por ejemplo, 6, 12, o 24 y placa de cultivo de tejidos o la cámara de migración), dependiendo del tipo de la proliferación, colonization o migración experimento, tal como se describe en los pasos 3, 4 o 5. NOTA: fragmentos de tejido óseo debe ser cosechada como se describe anteriormente después de completar los pasos iniciales para cada ensayo específico proliferación, colonización o migración. Fragmentos variarán en tamaño como se muestra en la Figura 2. Los fragmentos pueden ser pesados ​​antes o después de los experimentos con el propósito de la normalización. </li></ol> 3. Las células de cáncer de mama co-cultivo adyacentes a fragmentos de hueso para medir la proliferación de células de mama Utilizando BLI <ol><li> Antes del experimento, preparar una suspensión que contiene 2 x 10 5 células de cáncer de mama / 50 l, y preparar tapones de cera de hueso para inmovilizar los fragmentos de hueso en cultivo. Cortar una punta de micropipeta P200 en 3 pedazos y usar el extremo estrecho de la pieza más grande de una manera &quot;cortador de galletas&quot; para cortar pequeños (~ 35 mg) piezas de cera de hueso. Utilice el extremo ancho de la pieza más pequeña para expulsar los tapones de cera de hueso en una placa de Petripara el almacenamiento. </li><li> Coloque un pedazo de cera de hueso en la posición de las 12 de cada bien y presione suavemente hacia abajo con un dedo índice estéril enguantada. </li><li> Pipetear 50 l de suspensión de células que contiene 1 x 10 5 células de cáncer de mama en DMEM-FBS al 10% + Pen-Strep en el centro de cada pocillo de una placa de 6 pocillos. (Alternativamente, las células de semillas en un patrón disperso si lo desea.) Colocar la placa en un C de cultivo de tejidos incubadora a 37 ° durante 45 min para promover la unión celular. </li><li> Coloque el fragmento 1 hueso en 1 pieza de cera de hueso para cada pozo experimental y aplicar una presión suave con la gubia para asegurarlo. Realizar experimentos por triplicado tal que 3 fragmentos óseos de una muestra de THR dados se colocan en los tres primeros pozos, mientras que los tres pocillos de fondo contienen cera de hueso sólo como controles. </li><li> Usando una pipeta de 5 ml, entregar suave y lentamente 5 ml de DMEM-FBS al 10% a un lado de cada pocillo para evitar que se desprenda de las células de la mama o fragmentos de hueso. Colocar la placa en un 3776; C incubadora de cultivo de tejidos de 20 a 24 h. </li><li> Para realizar imágenes de bioluminiscencia (BLI) retire la placa de la incubadora y añadir sustrato luciferina (para lograr una concentración de 300 mg / ml) a cada pocillo. Imagen de la placa de inmediato en una plataforma de imágenes IVIS utilizando los siguientes parámetros: f-stop de 1, pequeña de agrupación, el tiempo de exposición de 1 segundo, el nivel D. Mide la intensidad de la señal de cada uno así como la luminosidad media (fotones / segundo / centímetro cuadrado / estereorradián). </li><li> Utilice software de imagen para definir regiones de interés (ROI) para cuantificar la radiación promedio para todos los pozos experimentales y de control. Exportar valores medios luminosidad a una hoja de Excel para realizar estadísticas y generar gráficos. </li></ol> 4. Las células de cáncer de mama co-cultivo sembrados directamente en fragmentos de hueso para el Estudio de Colonización y número de la célula <ol><li> El uso de fórceps para colocar los fragmentos de hueso directamente en los pocillos vacíos de una placa de cultivo de tejido de 24 pocillos (1 fragmento / pocillo). </li><li> PepitaETTE un 50 l suspensión de células de gotita de DMEM-FBS al 10% que contiene 1 x 10 3-6 células de cáncer de mama directamente en la parte superior de cada fragmento de hueso. Colocar la placa en un 37 ° C tejido cultura incubadora durante 45 minutos para promover la unión celular. Añadir suavemente 1-2 ml DMEM-FBS al 10% en el lado de cada pocillo de tal manera que el fragmento se sumerge totalmente en medio. Incubar la placa en un 37 ° C tejido cultura incubadora durante 20 a 24 horas. </li><li> Después de la incubación, el uso de fórceps para transferir cada fragmento de tejido óseo a una placa de 24 pocillos fresco que contenía 1 ml de DMEM-FBS al 10% en cada pocillo. Para realizar BLI, siga los pasos 3.6 a 3.7 anteriores. Además, los fragmentos pueden ser vistos usando un microscopio de fluorescencia, o tirarse por obtener la población ósea para el análisis de los números de células de cáncer de mama y las propiedades como se describe en el paso 6. </li><li> Para preparar los fragmentos intactos para la evaluación cualitativa por microscopía de fluorescencia después de BLI, pipeta de 5 l de solución de etiquetado bisfosfonato fluorescente (precomparación de acuerdo con las instrucciones del fabricante) en cada pocillo para etiquetar las espículas mineralizados de los fragmentos de hueso. Se incuba la placa en la incubadora de cultivo de tejidos durante otras 24 h. </li><li> Tras 24 horas de cultivo en solución de etiquetado bisfosfonato fluorescente, use pinzas para transferir los fragmentos de placas de cultivo de tejidos que contienen medio sin rojo fenol y vista usando un microscopio de fluorescencia configurado para GFP imagen (485 nm) y la etiqueta con bifosfonatos (680 nm). </li></ol> 5. Medición de la migración de células de cáncer de mama a los fragmentos de tejido óseo y cultivadas Fragmento de hueso sobrenadantes <ol><li> La migración hacia el tejido óseo sobrenadante de cultivo. NOTA: Realice experimentos por triplicado tal que 3 fragmentos de un espécimen THR dados se utilizan para generar 3 sobrenadantes. Para cada experimento, se compara la migración a través de tres pocillos que contienen sobrenadantes de hueso frente a tres pocillos que contienen medio de control solamente. <ol><li> Generar tis huesodemandar sobrenadantes mediante la colocación de fragmentos de hueso en los pocillos de una placa de 12 pocillos que contenía 2,2 ml de DMEM-FBS al 10% por pocillo. Cultura en un 37 ° C incubadora de cultivo de tejido durante 24 horas. Retire el medio a las 24 horas y reemplazar con 2,2 ml DMEM-FBS al 10%. Los pocillos de control de tratamiento que contiene DMEM-FBS al 10% de la misma manera. ATENCIÓN: se cambió el medio a las 24 horas para eliminar factores secretados en respuesta al trauma del tejido resultante de la cirugía. Debido a que los sobrenadantes del tejido óseo se generan en contenía FBS al medio, los pocillos que contenían FBS medio que contiene sólo se incluyen para controlar las contribuciones de FBS a la migración de células de cáncer de mama. </li><li> En 48 horas, recoger 0,9 ml de cada uno / medio de control sobrenadante y pipeta en los pocillos de una placa receptora. Los insertos posteriormente serán colocados en estos pozos. Incubar la placa receptora en la cultura incubadora de tejido mientras la siembra de las inserciones. Nota: El resto de sobrenadante (~ 1 ml después de la evaporación) se pueden recoger para el análisis de secretoma factors si se desea 44. </li><li> Para sembrar las inserciones Transwell, colóquelos en un estándar, de 24 pocillos placa de cultivo tisular vacía. Pipetear 350 l suspensión de células que contiene 1 x 10 5 células de cáncer de mama en DMEM-FBS al 10% sobre la superficie de la membrana superior, interior de cada inserto como se muestra en la Figura 1A. Coloque la placa de 24 pocillos que contenía los insertos de cabezas de serie en el 37 ° C de cultivo de tejidos incubadora durante 45 min para promover la unión. </li><li> Una vez que las células se han unido a los insertos, el uso de fórceps para transferir los insertos a la placa de receptor de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Ángulo de cada inserto cuando la coloque en el receptor así para evitar la formación de burbujas entre la membrana de inserción y el receptor así sobrenadante. Incubar la placa receptora con inserciones durante 20 horas en un 37 ° C tejido cultura incubadora. NOTA: Verifique el lado inferior de la placa receptora de burbujas entre la membrana de inserción y el receptor así supernatant. Si se ven burbujas, extraiga los protectores específicos y colocarlos de nuevo en el receptor bien hasta que no queden burbujas están presentes. </li><li> Después de 20 horas de uso de fórceps para extraer los insertos de la placa receptora. Usando los procedimientos en los pasos 3.6 a 3.7 realizar BLI a la imagen de las células que han migrado en y unidos a la parte inferior de los pocillos de la placa receptor. </li></ol></li><li> La migración hacia los fragmentos de tejido óseo. NOTA: Realice experimentos por triplicado tal que 3 fragmentos de un espécimen THR dados se colocan en 3 inserciones separadas, y 3 perlas de vidrio se colocan en 3 inserciones separadas como controles. <ol><li> Preparar la placa receptora pipeteando 0,9 ml de DMEM-FBS al 10% en cada pocillo. Colóquelo en la cultura incubadora tejido mientras se preparan los insertos. </li><li> Para sembrar las inserciones, ellos invertir en la superficie de una caja de tubo de microcentrífuga de plástico que tiene una tapa. Pipetear 50 l de suspensión celular gota de DMEM-FBS al 10% que contiene 1 x 10 5 células de cáncer de mama directly sobre la superficie exterior, parte inferior de cada membrana de inserción (que está mirando hacia arriba en los insertos invertidas). Cubrir la caja del tubo de microcentrífuga con la tapa entreabierta y la transfiere a la incubadora a 37 ° tejido durante 45 min para promover la unión celular. </li><li> Transferir la caja del tubo de microcentrífuga a la campana de cultivo de tejido, y el uso de fórceps para girar los insertos sembradas lado derecho hacia arriba y transferirlos en los pocillos de la placa receptora. Pipetear 0,450 ml de DMEM-FBS al 10% en cada taza de inserción. Con unas pinzas, transferir un fragmento de tejido óseo (~ 3 mm) en cada taza de inserción preparado. Opcionalmente, utilizar cuentas de vidrio como controles negativos en pozos adicionales. Colocar la placa en una cultura incubadora tejido durante 20 horas. </li><li> Para medir la migración, preparar una placa de cultivo tisular estándar de 24 pocillos que contenía 1 ml de DMEM-FBS al 10% por pocillo. Retire la placa receptora de la incubadora y el uso de fórceps para transferir los fragmentos de hueso y los granos de cada insertar en pocillos separados de la placa estándar. Añadir luciferinasustrato (para lograr una concentración final de 300 mg / ml) a cada pocillo y realizar BLI usando los procedimientos en los pasos 3.6 a 3.7. </li></ol></li></ol> 6. Los análisis adicionales pre y post-experimentales <ol><li> Análisis de médula enrojecida. <ol><li> Transferencia de un fragmento de hueso en un filtro de células de 70 micras colocado en la parte superior de un tubo cónico de 50 ml. Utilice una jeringa de 10 ml con una aguja de 25 G para enjuagar vigorosamente el fragmento con 10 ml de PBS para obtener una suspensión de células de médula en el tubo cónico. Centrifugar la suspensión de células durante 3 minutos a 300 xg y 21 ° C, aspirar el sobrenadante y resuspender las células sedimentadas en PBS u otra solución deseada para citometría de flujo. NOTA: los volúmenes de resuspensión variarán dependiendo del tamaño del sedimento celular después de la centrifugación, y la aplicación. </li><li> Para los ensayos de viabilidad ~ 75-300 mu l volúmenes de PBS son apropiados, y estas suspensiones se pueden analizar utilizando fluorescenc disponible comercialmenteensayos de viabilidad basado en correo de acuerdo con las instrucciones del fabricante, pipetearon en un hemocitómetro convencional, y se contaron usando un microscopio de fluorescencia invertido. </li><li> Para el análisis de citometría de flujo o de la clasificación basada en la detección de células de cáncer de mama positivas para GFP, resuspender el sedimento celular en 1 ml de PBS que contenía 2% de FBS, 2 mM de EDTA, y 10 mM HEPES tal que la concentración es 1 x 10 6 células / ml. </li></ol></li><li> H &amp; E tinción inmunohistoquímica y. <ol><li> Para procesar los fragmentos de hematoxilina y eosina (H &amp; E) tinción y / o inmunohistoquímica, colocar los fragmentos en cassettes de plástico marcadas con un lápiz número 2, y sumergirse en un recipiente lleno con 10% de formalina tamponada durante 24 hr. </li><li> Tejidos de proceso para la inclusión en parafina, seccionamiento y tinción usando protocolos rutinarios que incluyen una etapa de descalcificación para dar cuenta de las espículas mineralizadas dentro de cada fragmento. </li></ol></li></ol>

No disclosures to report.

Mehra et al., Han descrito previamente la recogida y análisis de muestras de hueso postmortem de pacientes con cáncer de próstata metastásico cosechadas en el momento de la autopsia, que revela los tejidos de alta calidad y validar el uso de muestras de huesos humanos para estudiar el proceso metastásico 47. Aquí hemos descrito los protocolos de recolección, procesamiento y uso de fragmentos de tejidos óseos humanos obtenidos de cabezas femorales desechados después de la cirugía THR en un s...

El microambiente tumoral es ampliamente reconocida como un determinante crítico de la conducta de células de cáncer durante la progresión del cáncer de mama metastásico y repartidas 1-3. El objetivo del método que aquí se presenta es la de facilitar el estudio de las células de cáncer de mama en el microambiente del tejido óseo humano, el sitio más frecuente de metástasis del cáncer de mama 4-6. El hueso se compone de compartimentos mineralizadas y médula ósea 7-9, ambos de los cuales albergan células y factores secretados implicados en la progresión metastásica 10,11. Aunque es ampliamente utilizado en modelos in vivo de ratón facilitar estudios sistémicos del proceso metastásico 12-15, interacciones de las células dentro del esqueleto no son de fácil acceso para la observación y la perturbación directa. Sistemas de modelo para el estudio y el cultivo de tejidos óseos ratón y células de médula de ratón proporcionan un mejor acceso y han dado muchas ideas con respecto a la interferencia y los mecanismos que subyacen a las células del cáncer de mama metastasis del esqueleto murino 16-22. Sin embargo, los estudios han sugerido que puede haber patrones de osteotropism específicas de la especie por el tejido óseo 23,24. Estos patrones podrían reflejar especies específicas inherentes diferencias en las propiedades del tejido óseo, las diferencias resultantes de poblaciones de médula ósea alterados en ratones inmunodeficientes 11, y / o la edad relativamente joven de los ratones utilizados en los experimentos, todos los cuales son posibles determinantes de la médula microambiente. In vitro enfoques para el estudio de las células de cáncer de mama en co-cultivos óseos humanos se han centrado generalmente en los tipos de células óseas específicas tales como osteoblastos derivados de médula o de células estromales cultivadas como monocapas o dentro de la ingeniería de sistemas modelo de 3 dimensiones 25-35. Aunque los modelos de cultivo de células de 2 dimensiones han formado la base del in vitro enfoques para la investigación del cáncer, desde hace tiempo se ha reconocido que el comportamiento celular se altera fundamentalmente en monolayer sistemas de cultivo 18,36,37. Esto ha llevado al desarrollo de microambientes de ingeniería que imitan la complejidad de los tejidos vivos de 3 dimensiones, incluyendo la Matriz y modelos basados ​​en los andamios compuestos de materiales naturales tales como colágeno, o polímeros sintéticos sembraron con tipos específicos de células para crear microambientes similar a un tejido 36-41. Enfoques de ingeniería también han incluido el uso de las plataformas de biorreactores para controlar y estudiar el entorno hormonal del microambiente 18,19,41-43. Aunque los modelos biomiméticos y biorreactores proporcionan muchos elementos de un microambiente del tejido complejo en un entorno controlado, y se han aplicado con éxito para avanzar en el estudio de la metástasis del cáncer de mama al hueso 18,19,35,42,43, sistemas de modelos de ingeniería por lo general no incorporan el espectro completo de tipos de células y componentes de la matriz extracelulares presentes en el entorno hueso nativo. Hasta hace poco, el cáncer de mamacélulas no se han estudiado en el microambiente nativo, intacto, 3-dimensional de tejidos óseos humanos. Recientemente hemos informado de la elaboración de un modelo de co-cultivo utilizando fragmentos de tejidos óseos humanos aislados de reemplazo total de cadera (THR) cirugía especímenes 44. Estos especímenes albergan tanto los compartimentos mineralizadas y ósea necesarias para estudiar los mecanismos subyacentes de micro-metástasis en cultivo a corto plazo. En trabajos anteriores hemos establecido una prueba de principio para el uso de imágenes de bioluminiscencia (BLI) para monitorear la proliferación de células de cáncer de mama que expresan luciferasa (MDA-MB-231-fLuc) co-cultivadas con fragmentos de hueso 44. Aquí presentamos detallamos los protocolos experimentales para el estudio de la proliferación celular del cáncer de pecho, la colonización y la migración dentro del contexto de la microambiente nativo usando explantes de tejido óseo humano. En primer lugar se presenta un protocolo para el co-cultivo de células de cáncer de seno adyacentes a fragmentos de hueso para medir mamala proliferación celular usando BLI. En esta sección, las suspensiones celulares de mama se siembran en forma de manchas de células en placas de 6 pocillos adyacentes a fragmentos óseos, que están inmovilizados por piezas de cera de hueso. Los pocillos de control contienen cera de hueso, pero no fragmento de hueso. Una vez manchas de células se adhieren, se añade medio y la placa se cultivaron durante 24 h, después de lo cual la intensidad de señal bioluminiscente (asociado con el número de células) se mide con BLI. En el siguiente paso se presentan métodos para células de cáncer de mama co-cultivo sembradas directamente sobre fragmentos de hueso para estudiar la colonización y proliferación. Aquí las suspensiones de células de mama se pipetean directamente sobre los fragmentos de tejido óseo, que se controlan mediante cultivo por BLI y microscopía de fluorescencia con el tiempo para realizar un seguimiento de la colonización y el número de células. En este método, el compartimiento de la médula se puede lavar a partir de los fragmentos de hueso en cualquier punto de tiempo para el análisis de las células de cáncer de mama colonizados por citometría de flujo, o los ensayos de viabilidad ósea. Además, Deescriba dos enfoques diferentes para medir la migración de células de cáncer de mama. En el primer método pasos se describen para la medición de la migración hacia los sobrenadantes de cultivo de tejido óseo. En este protocolo las células de cáncer de mama se siembran en las superficies interiores, superiores de las membranas Transwell insertan con un 8 micras de tamaño de poro (como se muestra en la Figura 1A). Los insertos se colocan en un plato receptor con pocillos que contienen sobrenadante tejido óseo o medio de control. En el transcurso de un período de incubación de 20 h, pequeñas cantidades de células de cáncer de mama migran a través de las membranas de inserción hacia abajo en los pocillos de cultivo de tejidos más bajos donde se unen para la detección por BLI. En el segundo método de migración de las células de cáncer de mama se siembran en las superficies inferiores, exteriores de las membranas de inserción Transwell. Fragmentos de tejido de hueso se colocan en las tazas de inserción y las células de cáncer de mama migran a través de las membranas para colonizar los fragmentos de hueso (como se muestra en la Figura 1B), el cualluego son proyectados utilizando BLI.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>DMEM (1X) + GlutaMAX-l</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10569-010</td>
			<td>Supplement all DMEM with 10% fetal bovine serum and 1% Pen/Strep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>McCoy&#39;s 5A Medium (1X)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>16600-082</td>
			<td>Supplement all McCoy&#39;s&#160; with 10% fetal bovine serum and 1% Pen/Strep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>16000-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillen Streptomycin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blastocidin (10 mgl/ml)</td>
			<td>InvivoGen&#160;</td>
			<td>ant-bl</td>
			<td>Supplement media used for transfected cell lines.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon&#174; Cell Culture Inserts for 24 Well Plate with Transparent PET Membrane (8.0 &#956;m pore size)</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>353097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon&#174; 24 Well TC-Treated Polystyrene Cell Culture Insert Companion Plate</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>353504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit *for mammalian cells*</td>
			<td>Invitrogen Detection Technologies</td>
			<td>L-3224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoroBrite DMEM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A18967-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-luciferin firefly, potassium salt 5 grams (30 mg/mL)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>L-8220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Cell Strainer 70 &#956;m</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22363548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 Well TC-Treated Cell Culture Cluster</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 Well TC-Treated Cell Culture Cluster</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>3513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 Well TC-Treated Cell Culture Cluster</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>3526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Friedman-Pearson Rongeur</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>16021-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bone wax</td>
			<td>Surgical Specialties Corporation</td>
			<td>903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVIS 50 Imaging Platform</td>
			<td>Caliper Life Sciences/PerkinElmer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Living Image Software Program&#160;</td>
			<td>Caliper Life Sciences/PerkinElmer</td>
			<td>133026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS FL Imaging System</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Version 4.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OsteoSense 680 EX</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>NEV10020EX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCF-7 breast cancer cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HTB-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDA-MB-231 breast cancer cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HTB-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal mouse anti-human cytokeratin antibody</td>
			<td>DAKO Cytomation</td>
			<td>Clone (AE1/AE3)</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methods for culturing human femur tissue explants to study breast cancer cell colonization of the metastatic niche

El hueso es el sitio más común de metástasis del cáncer de mama. Aunque es ampliamente aceptado que el comportamiento de las células del cáncer de influencias microambiente, poco se sabe acerca de las propiedades celulares de cáncer de mama y comportamientos dentro del microambiente natural de tejido óseo humano. Hemos desarrollado enfoques para realizar el seguimiento, cuantificar y modular las células de cáncer de mama humano en el microambiente de fragmentos humanas cultivadas de tejido óseo aisladas de cabezas femorales desechados después de cirugía de reemplazo total de cadera. El uso de células de cáncer de mama de ingeniería para la luciferasa y la proteína fluorescente (EGFP) expresión verde mejoradas, somos capaces de cuantificar de forma reproducible la migración y proliferación de patrones de uso de imágenes de bioluminiscencia (BLI), interacciones celulares pista dentro de los fragmentos de hueso mediante microscopía de fluorescencia, y evaluar las células del seno después la colonización con citometría de flujo. Las principales ventajas de este modelo son: 1) a, microE tejido arquitectónico intacto nativambiente que incluye tipos de células humanas pertinentes, y 2) el acceso directo al microambiente, lo que facilita cuantitativo rápido y monitoreo cualitativo y perturbación de mama y de células óseas propiedades, comportamientos e interacciones. Una limitación principal, en la actualidad, es la viabilidad finito de los fragmentos de tejido, lo que limita la ventana del estudio de cultivo a corto plazo. Aplicaciones del sistema de modelo incluyen el estudio de la biología básica del cáncer de mama y otros tumores malignos por el hueso dentro del nicho metastásico, y el desarrollo de estrategias terapéuticas para orientar eficazmente las células de cáncer de mama en los tejidos óseos.

El aislamiento de fragmentos de tejido de Cabezas femorales Cabezas femorales se obtuvieron de igual número de hombres y mujeres (44 a 90 años de edad) sometidos a cirugía electiva de reemplazo total de cadera en el Departamento de Cirugía Ortopédica en la Escuela de Medicina de la Universidad de Stanford. Cada cabeza femoral desechado contiene una pequeña porción de la parte superior del fémur, que alberga el tejido óseo trabecular compuesto por espículas mineralizadas y ósea. Es...

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Methods for Culturing Human Femur Tissue Explants to Study Breast Cancer Cell Colonization of the Metastatic Niche

Protocolos se describen para el estudio de la migración de células de cáncer de mama, la proliferación y la colonización en un sistema modelo de explante de tejido óseo humano.

Métodos de explantes de tejidos El cultivo fémur humano para el Estudio de la colonización de la célula del cáncer de pecho de la Niche metastásico

Bone is the most common site of breast cancer metastasis. Although it is widely accepted that the microenvironment influences cancer cell behavior, little ...

methods-for-culturing-human-femur-tissue-explants-to-study-breast

Research

JoVE Journal

Medicine

12.4K vistas.  Stanford University School of Medicine.  Protocolos se describen para el estudio de la migración de células de cáncer de mama, la proliferación y la colonización en un sistema modelo de explante de tejido óseo humano. 

Video: Methods for Culturing Human Femur Tissue Explants to Study Breast Cancer Cell Colonization of the Metastatic Niche

Method for Novel Anti-Cancer Drug Development using Tumor Explants of Surgical Specimens

The current therapies for malignant glioma have only palliative effect. For therapeutic development, one hurdle is the discrepancy of efficacy determined by current drug efficacy tests and the efficacy on patients. Thus, novel and reliable methods for evaluating drug efficacy are warranted in pre-clinical phase. In vitro culture of tumor tissues, including cell lines, has substantial phenotypic, genetic, and epigenetic alterations of cancer cells caused by artificial environment of cell culture, which may not reflect the biology of original tumors in situ. Xenograft models with the immunodeficient mice also have limitations, i.e., the lack of immune system and interspecies genetic and epigenetic discrepancies in microenvironment. Here, we demonstrate a novel method using the surgical specimens of malignant glioma as undissociated tumor blocks to evaluate treatment effects. To validate this method, data with the current first-line chemotherapeutic agent, temozolomide (TMZ), are described.


We used the freshly-removed surgical specimen of malignant glioma for our experiments. We performed intratumoral injection of TMZ or other drug candidates, followed by incubation and analysis on surgical specimens. Here, we sought to establish a tumor tissue explant method as a platform to determine the efficacy of novel anti-cancer therapies so that we may be able to overcome, at least, some of the current limitations and fill the existing gap between the current experimental data and the efficacy on an actual patient's tumor. This method may have the potential to accelerate identifying novel chemotherapeutic agents for solid cancer treatment.

Here, we established a method for drug efficacy testing with surgical specimens of brain tumors, termed &#x201C;tumor explant method&#x201D;. With this method, we can evaluate drug efficacy without breaking the microenvironment of solid tumors. To validate reliability of this method, we describe representative data with our glioma specimen treated with the current first-line chemotherapeutic agent, temozolomide.

Método para el desarrollo de nuevos fármacos contra el cáncer utilizando explantes tumorales de las piezas quirúrgicas


The current therapies for malignant glioma have only palliative effect. For therapeutic development, one hurdle is the discrepancy of efficacy determined ...

Investigación

Medicina

An In Vitro System to Study Tumor Dormancy and the Switch to Metastatic Growth

Recurrence of breast cancer often follows a long latent period in which there are no signs of cancer, and metastases may not become clinically apparent until many years after removal of the primary tumor and adjuvant therapy. A likely explanation of this phenomenon is that tumor cells have seeded metastatic sites, are resistant to conventional therapies, and remain dormant for long periods of time 1-4.
The existence of dormant cancer cells at secondary sites has been described previously as quiescent solitary cells that neither proliferate nor undergo apoptosis 5-7. Moreover, these solitary cells has been shown to disseminate from the primary tumor at an early stage of disease progression 8-10 and reside growth-arrested in the patients' bone marrow, blood and lymph nodes 1,4,11. Therefore, understanding mechanisms that regulate dormancy or the switch to a proliferative state is critical for discovering novel targets and interventions to prevent disease recurrence. However, unraveling the mechanisms regulating the switch from tumor dormancy to metastatic growth has been hampered by the lack of available model systems.
in vivo and ex vivo model systems to study metastatic progression of tumor cells have been described previously 1,12-14. However these model systems have not provided in real time and in a high throughput manner mechanistic insights into what triggers the emergence of solitary dormant tumor cells to proliferate as metastatic disease. We have recently developed a 3D in vitro system to model the in vivo growth characteristics of cells that exhibit either dormant (D2.OR, MCF7, K7M2-AS.46) or proliferative (D2A1, MDA-MB-231, K7M2) metastatic behavior in vivo . We demonstrated that tumor cells that exhibit dormancy in vivo at a metastatic site remain quiescent when cultured in a 3-dimension (3D) basement membrane extract (BME), whereas cells highly metastatic in vivo readily proliferate in 3D culture after variable, but relatively short periods of quiescence. Importantly by utilizing the 3D in vitro model system we demonstrated for the first time that the ECM composition plays an important role in regulating whether dormant tumor cells will switch to a proliferative state and have confirmed this in in vivo studies15-17. Hence, the model system described in this report provides an in vitro method to model tumor dormancy and study the transition to proliferative growth induced by the microenvironment.

An In Vitro System to Study Tumor Dormancy and the Switch to Metastatic Growth

A modified 3-D in vitro system is presented in which growth characteristics of several tumor cell lines in reconstituted basement membrane correlate with the dormant or proliferative behavior of the tumor cells at a metastatic secondary site in vivo.

Un In Vitro Sistema para el Estudio de latencia del tumor y el salto hacia el crecimiento metastásico

Recurrence of breast cancer often follows a long latent period in which there are no signs of cancer, and metastases may not become clinically apparent ...

Human Neuroendocrine Tumor Cell Lines as a Three-Dimensional Model for the Study of Human Neuroendocrine Tumor Therapy

Neuroendocrine tumors (NETs) are rare tumors, with an incidence of two per 100,&#x200A;000 individuals per year, and they account for 0.5% of all human malignancies.1 Other than surgery for the minority of patients who present with localized disease, there is little or no survival benefit of systemic therapy. Therefore, there is a great need to better understand the biology of NETs, and in particular define new therapeutic targets for patients with nonresectable or metastatic neuroendocrine tumors. 3D cell culture is becoming a popular method for drug screening due to its relevance in modeling the in vivo tumor tissue organization and microenvironment.2,3 The 3D multicellular spheroids could provide valuable information in a more timely and less expensive manner than directly proceeding from 2D cell culture experiments to animal (murine) models.
To facilitate the discovery of new therapeutics for NET patients, we have developed an in vitro 3D multicellular spheroids model using the human NET cell lines. The NET cells are plated in a non-adhesive agarose-coated 24-well plate and incubated under physiological conditions (5% CO2, 37 &deg;C) with a very slow agitation for 16-24 hr after plating. The cells form multicellular spheroids starting on the 3rd or 4th day. The spheroids become more spherical by the 6th day, at which point the drug treatments are initiated. The efficacy of the drug treatments on the NET spheroids is monitored based on the morphology, shape and size of the spheroids with a phase-contrast light microscope. The size of the spheroids is estimated automatically using a custom-developed MATLAB program based on an active contour algorithm. Further, we demonstrate a simple method to process the HistoGel embedding on these 3D spheroids, allowing the use of standard histological and immunohistochemical techniques. 
This is the first report on generating 3D spheroids using NET cell lines to examine the effect of therapeutic drugs. We have also performed histology on these 3D spheroids, and displayed an example of a single drug's effect on growth and proliferation of the NET spheroids. Our results support that the NET spheroids are valuable for further studies of NET biology and drug development.

We present a simple agarose overlay platform to grow 3D multicellular spheroids using neuroendocrine cancer cell lines. This method provides a very convenient way to examine the effect of therapeutic drugs on the neuroendocrine tumor cells. It could also help us establish human neuroendocrine tumor spheroids for cancer therapy.

Humanos neuroendocrinos líneas de células tumorales como un modelo tridimensional para el estudio de la terapia humana tumor neuroendocrino

Neuroendocrine tumors (NETs) are rare tumors, with an incidence of two per 100,&#x200A;000 individuals per year, and they account for 0.5% of all human ...

The Use of Reverse Phase Protein Arrays (RPPA) to Explore Protein Expression Variation within Individual Renal Cell Cancers

Currently there is no curative treatment for metastatic clear cell renal cell cancer, the commonest variant of the disease. A key factor in this treatment resistance is thought to be the molecular complexity of the disease 1. Targeted therapy such as the tyrosine kinase inhibitor (TKI)-sunitinib have been utilized, but only 40% of patients will respond, with the overwhelming majority of these patients relapsing within 1 year 2. As such the question of intrinsic and acquired resistance in renal cell cancer patients is highly relevant 3.
In order to study resistance to TKIs, with the ultimate goal of developing effective, personalized treatments, sequential tissue after a specific period of targeted therapy is required, an approach which had proved successful in chronic myeloid leukaemia 4. However the application of such a strategy in renal cell carcinoma is complicated by the high level of both inter- and intratumoral heterogeneity, which is a feature of renal cell carcinoma5,6 as well as other solid tumors 7. Intertumoral heterogeneity due to transcriptomic and genetic differences is well established even in patients with similar presentation, stage and grade of tumor. In addition it is clear that there is great morphological (intratumoral) heterogeneity in RCC, which is likely to represent even greater molecular heterogeneity. Detailed mapping and categorization of RCC tumors by combined morphological analysis and Fuhrman grading allows the selection of representative areas for proteomic analysis.
Protein based analysis of RCC8 is attractive due to its widespread availability in pathology laboratories; however, its application can be problematic due to the limited availability of specific antibodies 9. Due to the dot blot nature of the Reverse Phase Protein Arrays (RPPA), antibody specificity must be pre-validated; as such strict quality control of antibodies used is of paramount importance. Despite this limitation the dot blot format does allow assay miniaturization, allowing for the printing of hundreds of samples onto a single nitrocellulose slide. Printed slides can then be analyzed in a similar fashion to Western analysis with the use of target specific primary antibodies and fluorescently labelled secondary antibodies, allowing for multiplexing. Differential protein expression across all the samples on a slide can then be analyzed simultaneously by comparing the relative level of fluorescence in a more cost-effective and high-throughput manner.

The Use of Reverse Phase Protein Arrays RPPA to Explore Protein Expression Variation within Individual Renal Cell Cancers

RPPA enables the protein expression of hundreds of samples, printed on nitrocellulose slides to be interrogated simultaneously, using fluorescently labelled antibodies. This technique has been applied to study the effect of drug treatment heterogeneity within clear cell renal carcinoma.

El uso de matrices inversas de proteínas de fase (RPPA) para explorar la variación de expresión de proteínas individuales dentro de cánceres de células renales

Currently there is no curative treatment for metastatic clear cell renal cell cancer, the commonest variant of the disease. A key factor in this treatment ...

Initiation of Metastatic Breast Carcinoma by Targeting of the Ductal Epithelium with Adenovirus-Cre: A Novel Transgenic Mouse Model of Breast Cancer

Breast cancer is a heterogeneous disease involving complex cellular interactions between the developing tumor and immune system, eventually resulting in exponential tumor growth and metastasis to distal tissues and the collapse of anti-tumor immunity. Many useful animal models exist to study breast cancer, but none completely recapitulate the disease progression that occurs in humans. In order to gain a better understanding of the cellular interactions that result in the formation of latent metastasis and decreased survival, we have generated an inducible transgenic mouse model of YFP-expressing ductal carcinoma that develops after sexual maturity in immune-competent mice and is driven by consistent, endocrine-independent oncogene expression. Activation of YFP, ablation of p53, and expression of an oncogenic form of K-ras was achieved by the delivery of an adenovirus expressing Cre-recombinase into the mammary duct of sexually mature, virgin female mice. Tumors begin to appear 6 weeks after the initiation of oncogenic events. After tumors become apparent, they progress slowly for approximately two weeks before they begin to grow exponentially. After 7-8 weeks post-adenovirus injection, vasculature is observed connecting the tumor mass to distal lymph nodes, with eventual lymphovascular invasion of YFP+ tumor cells to the distal axillary lymph nodes. Infiltrating leukocyte populations are similar to those found in human breast carcinomas, including the presence of &#945;&#946; and &#947;&#948; T cells, macrophages and MDSCs. This unique model will facilitate the study of cellular and immunological mechanisms involved in latent metastasis and dormancy in addition to being useful for designing novel immunotherapeutic interventions to treat invasive breast cancer.

Activation of latent mutations with adenovirus-Cre into the mammary ductal system results in a clinically relevant metastatic breast cancer. Incorporation of a YFP promoter allows tracking of distal metastatic tumor cells. This model is useful to study latent metastasis, anti-tumor immunity, and for designing novel immunotherapies to treat breast cancer.

Inicio de la metástasis de carcinoma de mama mediante la Focalización del epitelio ductal con adenovirus Cre: Un modelo de ratón transgénico de Novela del Cáncer de Mama

Breast cancer is a heterogeneous disease involving complex cellular interactions between the developing tumor and immune system, eventually resulting in ...

Profiling of Estrogen-regulated MicroRNAs in Breast Cancer Cells

Estrogen plays vital roles in mammary gland development and breast cancer progression. It mediates its function by binding to and activating the estrogen receptors (ERs), ER&#945;, and ER&#946;. ER&#945; is frequently upregulated in breast cancer and drives the proliferation of breast cancer cells. The ERs function as transcription factors and regulate gene expression. Whereas ER&#945;&#39;s regulation of protein-coding genes is well established, its regulation of noncoding microRNA (miRNA) is less explored. miRNAs play a major role in the post-transcriptional regulation of genes, inhibiting their translation or degrading their mRNA. miRNAs can function as oncogenes or tumor suppressors&#160;and are also promising biomarkers. Among the miRNA assays available, microarray and quantitative real-time polymerase chain reaction (qPCR) have been extensively used to detect and quantify miRNA levels. To identify miRNAs regulated by estrogen signaling in breast cancer, their expression in ER&#945;-positive breast cancer cell lines were compared before and after estrogen-activation using both the &#181;Paraflo-microfluidic microarrays and Dual Labeled Probes-low density arrays. Results were validated using specific qPCR assays, applying both Cyanine dye-based and Dual Labeled Probes-based chemistry. Furthermore, a time-point assay was used to identify regulations over time. Advantages of the miRNA assay approach used in this study is that it enables a fast screening of mature miRNA regulations in numerous samples, even with limited sample amounts. The layout, including the specific conditions for cell culture and estrogen treatment, biological and technical replicates, and large-scale screening followed by in-depth confirmations using separate techniques, ensures a robust detection of miRNA regulations,&#160;and eliminates false positives and other artifacts. However, mutated or unknown miRNAs, or regulations at the primary and precursor transcript level, will not be detected. The method presented here represents a thorough investigation of estrogen-mediated miRNA regulation.

Molecular signaling through both estrogen and microRNAs are critical in breast cancer development and growth. Estrogen activates the estrogen receptors, which are transcription factors. Many transcription factors can regulate the expression of microRNAs, and estrogen-regulated microRNAs can be profiled using different large-scale techniques.

Perfiles de microARN regulados por estrógeno en las células del cáncer de mama

Estrogen plays vital roles in mammary gland development and breast cancer progression. It mediates its function by binding to and activating the estrogen ...

Three Dimensional Cultures: A Tool To Study Normal Acinar Architecture vs. Malignant Transformation Of Breast Cells

Invasive breast carcinomas are a group of malignant epithelial tumors characterized by the invasion of adjacent tissues and propensity to metastasize. The interplay of signals between cancer cells and their microenvironment exerts a powerful influence on breast cancer growth and biological behavior1. However, most of these signals from the extracellular matrix are lost or their relevance is understudied when cells are grown in two dimensional culture (2D) as a monolayer. In recent years, three dimensional (3D) culture on a reconstituted basement membrane has emerged as a method of choice to recapitulate the tissue architecture of benign and malignant breast cells. Cells grown in 3D retain the important cues from the extracellular matrix and provide a physiologically relevant ex&#160;vivo system2,3. Of note, there is growing evidence suggesting that cells behave differently when grown in 3D as compared to 2D4. 3D culture can be effectively used as a means to differentiate the malignant phenotype from the benign breast phenotype and for underpinning the cellular and molecular signaling involved3. One of the distinguishing characteristics of benign epithelial cells is that they are polarized so that the apical cytoplasm is towards the lumen and the basal cytoplasm rests on the basement membrane. This apico-basal polarity is lost in invasive breast carcinomas, which are characterized by cellular disorganization and formation of anastomosing and branching tubules that haphazardly infiltrates the surrounding stroma. These histopathological differences between benign gland and invasive carcinoma can be reproduced in 3D6,7. Using the appropriate read-outs like the quantitation of single round acinar structures, or differential expression of validated molecular markers for cell proliferation, polarity and apoptosis in combination with other molecular and cell biology techniques, 3D culture can provide an important tool to better understand the cellular changes during malignant transformation and for delineating the responsible signaling.

Three dimensional culture of mammary epithelial cells on a reconstituted basement membrane is a useful method to recapitulate the in vivo architecture of the benign breast, and to differentiate the malignant phenotype from the benign breast phenotype. Importantly, this system can be applied to study invasive carcinomas in other tissues.

Tres Culturas dimensionales: una herramienta para estudiar normal Acinar Arquitectura vs transformación maligna de las células de la mama

Invasive breast carcinomas are a group of malignant epithelial tumors characterized by the invasion of adjacent tissues and propensity to metastasize. The ...

Orthotopic Injection of Breast Cancer Cells into the Mammary Fat Pad of Mice to Study Tumor Growth.

Breast cancer growth can be studied in mice using a plethora of models. Genetic manipulation of breast cancer cells may provide insights into the functions of proteins involved in oncogenic progression or help to discover new tumor suppressors. In addition, injecting cancer cells into mice with different genotypes might provide a better understanding of the importance of the stromal compartment. Many models may be useful to investigate certain aspects of disease progression but do not recapitulate the entire cancerous process. In contrast, breast cancer cells engraftment to the mammary fat pad of mice better recapitulates the location of the disease and presence of the proper stromal compartment and therefore better mimics human cancerous disease. In this article, we describe how to implant breast cancer cells into mice orthotopically and explain how to collect tissues to analyse the tumor milieu and metastasis to distant organs. Using this model, many aspects (growth, angiogenesis, and metastasis) of cancer can be investigated simply by providing a proper environment for tumor cells to grow.

Cancer is a complex disease that is influenced by the tissue surrounding the tumor as well as local pro- and anti-inflammatory mediators. Therefore, orthotropic injection models, rather than subcutaneous models may be useful to study cancer progression in a manner that better mimics human pathology.

Inyección ortotópico de células de cáncer de mama en el Mamaria Fat Pad de ratones para estudiar el crecimiento del tumor.

Breast cancer growth can be studied in mice using a plethora of models. Genetic manipulation of breast cancer cells may provide insights into the ...

An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

The study of hormone action in the human breast has been hampered by lack of adequate model systems. Upon in vitro culture, primary mammary epithelial cells tend to lose hormone receptor expression. Widely used hormone receptor positive breast cancer cell lines are of limited relevance to the in vivo situation. Here, we describe an ex vivo model to study hormone action in the human breast. Fresh human breast tissue specimens from surgical discard material such as reduction mammoplasties or mammectomies are mechanically and enzymatically digested to obtain tissue fragments containing ducts and lobules and multiple stromal cell types. These tissue microstructures kept in basal medium without growth factors preserve their intercellular contacts, the tissue architecture, and remain hormone responsive for several days. They are readily processed for RNA and protein extraction, histological analysis or stored in freezing medium. Fluorescence activated cell sorting (FACS) can be used to enrich for specific cell populations. This protocol provides a straightforward, standard approach for translational studies with highly complex, varied human specimens.

An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

We have developed a novel ex vivo model to study hormone action in the human breast. It is based on tissue microstructures isolated from surgical breast tissue specimens which preserve tissue architecture, intercellular interactions, and paracrine signaling.

Una<em&gt; Ex vivo</em&gt; Modelo para estudiar la acción hormonal en el pecho humano

The study of hormone action in the human breast has been hampered by lack of adequate model systems. Upon in vitro culture, primary mammary epithelial ...

Mammosphere Formation Assay from Human Breast Cancer Tissues and Cell Lines

Similar to healthy tissues, many blood and solid malignancies are now thought to be organised hierarchically, with a subset of stem-like cancer cells that self-renew while giving rise to more differentiated progeny. Understanding and targeting these cancer stem cells in breast cancer, which may possess enhanced chemo- and radio-resistance compared to the non-stem tumor bulk, has become an important research area. Markers including CD44, CD24, and ALDH activity can be assessed using fluorescence activated cell sorting (FACS) to prospectively isolate cells that display enhanced tumorigenicity when implanted into immunocompromised mice: the mammosphere assay has also become widely used for its ability to retrospectively identify sphere-forming cells that develop from single stem cell-like clones. Here we outline approaches for the appropriate culturing of mammospheres from cell lines or primary patient samples, their passaging, and calculations to estimate sphere forming efficiency (SFE). First we discuss key considerations and pitfalls in the appropriate planning and interpretation of mammosphere experiments.

Floating mammosphere assays can investigate the subset of stem-like breast cancer cells that survive in suspension conditions and show enhanced tumorigenesis when implanted into mice. This protocol provides a convenient in vitro measure of sphere-forming ability, a proxy for in vivo tumorigenesis, while facilitating analysis of the stem-associated transcriptional landscape.

Mammosphere Ensayo Formación de cáncer de mama humano tejidos y líneas celulares

Similar to healthy tissues, many blood and solid malignancies are now thought to be organised hierarchically, with a subset of stem-like cancer cells that ...