Agradecemos Asya Smirnov y Laura Gonyar para la lectura crítica del manuscrito. Esta labor fue apoyada por subvenciones NIH R00 y R01 AI097312 TW008042 a AKCMBJ fue apoyado en parte por el NIH T32 AI007046.

1. La evaluación de viabilidad bacteriana con yoduro de propidio y SYTO9 <ol><li> Infectar las células que son adherentes a 12 mm de diámetro cubreobjetos de vidrio circulares en placas de 24 pocillos con bacterias de interés. NO fijar las células con aldehídos o disolventes orgánicos. </li><li> Enjuagar las células una vez suavemente en 0,1 M de 3 - (N-morfolino) propanosulfónico (MOPS), pH 7,2, que contiene 1 mM de MgCl 2 (MOPS / MgCl 2). </li><li> Se incuban las células durante 10 min en la oscuridad a temperatura ambiente con Alexa Fluor 647 anticuerpo acoplado o lectina que se une a las especies bacterianas de interés, en MOPS / MgCl 2, para detectar bacterias externas. </li></ol> NOTA: Conducta controla con bacterias vivas y muertas, en ausencia de las células huésped, para mostrar que la lectina o anticuerpo de interés se une a todas las bacterias, independientemente de la viabilidad (Figura 1). <ol start="4"><li> Enjuague las células dos veces con MOPS / MgCl 2. </li><li> Aspirar media de las células y añadir 0,5 ml Live / Dead solución de tinción. Live / Dead solución de tinción es SYTO9 5 mM, 30 mM de yoduro de propidio, y 0,1% de saponina (concentraciones finales) en MOPS / MgCl 2. </li><li> Se incuban las células durante 15 min a temperatura ambiente en la oscuridad. </li><li> Enjuagar las células dos veces en MOPS / MgCl 2. </li><li> Cubreobjetos Invertir boca abajo en portaobjetos de vidrio y sellan con esmalte de uñas transparente. No utilice soportes de montaje. </li><li> Adquirir imágenes dentro de 30 minutos, utilizando un microscopio de fluorescencia con filtros de conjuntos compatibles con la adquisición de imágenes verde, rojo y rojo lejano. </li></ol> NOTA: Tanto la microscopía de fluorescencia convencional y microscopía confocal de barrido láser puede ser utilizado. Después de 30 min los colorantes fluorescentes comienzan a gotear de las bacterias y los datos adquiridos ya no son exactos. Las imágenes mostradas en este artículo se adquirieron en un microscopio de fluorescencia Nikon Eclipse E800 vertical con cámara digital Hamamatsu Orca-ER usando software Openlab. La fluorescencia de Alexa Fluor 647 se detectó usando un filtro con longitud de onda de excitación de 590 a 650 nm y un filtro de emisión de 663 a 735 nm, y es de color azul falsa. La fluorescencia a partir de yoduro de propidio se detectó utilizando un filtro con longitud de onda de excitación de 540 a 580 nm y un filtro de emisión de 600 a 660 nm. Fluorescencia de SYTO9 se detectó utilizando un filtro con longitud de onda de excitación de 465 a 495 nm y un filtro de emisión de 515 a 555 nm. <ol start="10"><li> Este protocolo se traducirá en imágenes en las que las bacterias no viables externos aparecen azul + rojo, las bacterias no viables internos aparezcan rojos solamente, bacterias viables externos aparecen en azul + verde, y las bacterias viables internas aparecen verdes solamente. Cuente a ojo el número de bacterias que son viables, no viables interna, viable, y la interior viable externa externa. </li><li> Se calcula el porcentaje de bacterias viables externos dividiendo el número de bacterias viables externos por el número total de bacterias externas (viables más nonvipoder). Se calcula el porcentaje de bacterias viables internos dividiendo el número de bacterias viables internos por el número total de bacterias internas (más viable no viable) (Figura 4). </li><li> Hay dos controles esenciales para llevar a cabo con este protocolo. En primer lugar, confirman que todas las bacterias no viables son el yoduro de propidio y positivas todas las bacterias vivas son SYTO9-positivo. Una cultura semilogarítmica de bacterias (en ausencia de cualquier célula huésped) debe ser&gt; 95% SYTO9-positivo. Se muestra en la Figura 2 es una cultura semilogarítmica de N. gonorrhoeae (al 10 8 unidades formadoras de colonias por ml de formación) se incubaron con vivo Muerto Solución / tinción. En segundo lugar, validar que tanto el yoduro de propidio y SYTO9 pueden entrar permeabilizadas, células huésped infectadas. <ol><li> Para generar una población de bacterias muertas, recoger 2 x 10 8 colonia bacteriana unidades en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml que forma, añadir 70% de isopropanol y sentarse durante 10 min. Sedimentar las bacterias en una microcentrífuga unND lavar las bacterias dos veces en PBS para eliminar el isopropanol residual. A continuación, siga los pasos del protocolo de 01.05 a 01.07. Añadir 5 l de suspensión bacteriana a un portaobjetos de vidrio y las cubrirás con un cubreobjetos. Muestras de la imagen como en el paso de protocolo 1.9. En estas condiciones, 100% de la población debería ser de yoduro de propidio-positivo (Figura 2). En algunas especies bacterianas, yoduro de propidio no puede abrumar completamente tinción SYTO9, y las bacterias no viables puede aparecer de color amarillo o naranja. </li><li> Para las células fagocíticas, como los neutrófilos, exponer las células a las bacterias isopropanol-muertos y asegurar que el 100% de las bacterias intracelulares son yoduro de propidio-positivo (Figura 3). Para las células nonphagocytic que puede que no internalizar bacterias muertas, puede ser suficiente para tratar células infectadas con azida de sodio o de otros agentes antimicrobianos de células antes de la adición de permeante en vivo / muerto solución de tinción. </li></ol></li></ol> 2. La evaluación de viabilidad bacteriana con SYTOX Green y DAPI <ol><li> Bacterias de la etiqueta de interés con 10 mg / ml DAPI en Morse Definido Media 25 durante 20 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. </li><li> Infectar las células que son adherentes a 12 mm de diámetro cubreobjetos de vidrio circulares en placas de 24 pocillos con bacterias marcadas con DAPI. NO fijar las células con aldehídos o disolventes orgánicos. </li><li> Enjuague las células una vez con MOPS / MgCl 2. </li><li> Se incuban las células durante 10 min a temperatura ambiente en la oscuridad con Alexa Fluor 647 anticuerpo acoplado o lectina que se une a las especies bacterianas de interés, en MOPS / MgCl 2, para detectar bacterias externas. Vea la nota en el paso de protocolo 1.3 para los controles sugeridos. </li><li> Aspirar los medios de las células y añadir 0,5 ml 0,4 M SYTOX verde en MOPS / MgCl 2. </li><li> Se incuban las células durante 5 min a temperatura ambiente en la oscuridad. </li><li> Enjuagar las células dos veces en MOPS / MgCl 2. </li><li> Lavar las células una vez en MOPS / MgCl 2 durante 5 min. </li><li&gt; Adquirir imágenes dentro de 30 min con un microscopio de fluorescencia. Consulte el paso del protocolo 1.9 para la descripción de microscopio, cámara digital y software de adquisición. </li></ol> NOTA: fluorescencia de Alexa Fluor 647 se detectó usando un filtro con longitud de onda de excitación de 590 a 650 nm y un filtro de emisión de 663 a 735 nm, y es de color rojo falsa. Fluorescencia de SYTOX Verde se detectó utilizando un filtro con longitud de onda de excitación de 465 a 495 nm y un filtro de emisión de 515 a 555 nm. Fluorescencia de DAPI se detectó utilizando un filtro con longitud de onda de excitación de 355 a 375 nm y filtro de barrera de 400 nm. <ol start="10"><li> Este protocolo se traducirá en imágenes en las que las bacterias no viables externos aparecen de color rojo + verde, las bacterias no viables internos parecen verde + azul, bacterias viables externos aparecen de color rojo + azul, y las bacterias viables internas aparecen en azul solamente (Figura 4). Cuantificar el porcentaje de bacterias externas e internas como se describe en Ste protocolop 1.11. </li><li> Los controles descritos en el paso protocolo de 1,12 se deben realizar con la combinación de tinte DAPI / SYTOX Verde (Figuras 2 y 3). </li></ol> 3. La evaluación de viabilidad bacteriana Junto localización subcelular <ol><li> Bacterias de la etiqueta de interés con 10 mg / ml DAPI en medio definido de Morse durante 20 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. </li><li> Infectar las células que son adherentes a 12 mm de diámetro cubreobjetos de vidrio circulares en placas de 24 pocillos con bacterias marcadas con DAPI. NO fijar las células con aldehídos o disolventes orgánicos. </li><li> Enjuague las células una vez con MOPS / MgCl 2. </li><li> Incubar 10 min a temperatura ambiente en la oscuridad con Alexa Fluor 647 anticuerpo acoplado o lectina que se une a las especies bacterianas de interés, en MOPS / MgCl 2, para detectar bacterias externas. Vea la nota en el paso de protocolo 1.3 para los controles sugeridos. </li><li> Aspirar los medios de las células y enjuagar las células dos times en MOPS / MgCl 2. </li><li> Se incuban las células con Alexa Fluor 555 anticuerpo acoplado contra el marcador subcelular de interés durante 20 min, en MOPS / MgCl 2 que contiene 0,2% de saponina. </li><li> Enjuagar las células dos veces en MOPS / MgCl 2. </li><li> Lavar las células una vez en MOPS / MgCl 2 durante 5 min. </li><li> Aspirar los medios de las células y añadir 0,4 M SYTOX verde en MOPS / MgCl 2. </li><li> Se incuban las células 5 min a temperatura ambiente en la oscuridad. </li><li> Enjuagar las células dos veces en MOPS / MgCl 2. </li><li> Lavar las células una vez en MOPS / MgCl 2 durante 5 min. </li><li> Adquirir imágenes de diapositivas en 30 minutos en el microscopio de fluorescencia. Consulte el paso del protocolo 1.9 para la descripción de microscopio, cámara digital y software de adquisición. </li></ol> NOTA: La fluorescencia de Alexa Fluor 647 se detectó utilizando un filtro con la excitación de longitud de onda de 590 a 650 nm y filtro de emisión de 663 a 735 nm, y es de color púrpura falsa. Fluorescencia fROM Alexa Fluor 555 se detectó usando un filtro con longitud de onda de excitación de 540 a 580 nm y un filtro de emisión de 600 a 660 nm. Fluorescencia de SYTOX Verde se detectó utilizando un filtro con longitud de onda de excitación de 465 a 495 nm y un filtro de emisión de 515 a 555 nm. Fluorescencia de DAPI se detectó utilizando un filtro con longitud de onda de excitación de 355 a 375 nm y filtro de barrera de 400 nm. <ol start="14"><li> Este protocolo se traducirá en imágenes en las que las bacterias no viables externos aparecen púrpura + verde, las bacterias no viables internos parecen verde + azul, bacterias viables externos aparecen púrpura + azul, bacterias viables internas aparecen en azul solamente, y subcelular de proteínas se ve rojo (Figura 4). Cuantificar el perecent de bacterias viables externos e internos, como se describe en el protocolo de los pasos 1.11. </li><li> Los controles descritos en el paso protocolo de 1,12 se deben realizar con la combinación de tinte DAPI / SYTOX Verde (Figuras 2 y 3). </li><li> EnAdemás de contar las bacterias viables y no viables, clasificar cada bacteria, ya sea positivo o negativo para colocalización con el marcador subcelular de interés. </li><li> Se calcula el porcentaje de bacterias viables colocalized con el marcador subcelular dividiendo el número de bacterias viables colocalized por el número total de bacterias viables. Calcular el porcentaje de bacterias no viables colocalized con el marcador subcelular dividiendo el número de bacterias no viables colocalized por el número total de bacterias no viables. </li></ol>

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Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Aquí se presentan dos protocolos que utilizan tintes de unión a ADN y de viabilidad en relación con una lectina fluorescente para identificar bacterias vivas y muertas unidos a y dentro de las células humanas. Dado que ambos protocolos discriminan efectivamente en vivo a partir de bacterias muertas, la elección de qué protocolo utilizar depende del objetivo del experimento. El primer protocolo utiliza yoduro de propidio para detectar bacterias no viables y SYTO9 para detectar bacterias intactas. Se muestra en <str...

Hay una interacción dinámica y co-evolución entre las bacterias y los anfitriones en los que residen. Las bacterias han evolucionado orgánulos de adherencia, sistemas de secreción, y / o la capacidad de producir toxinas que permiten su infección productiva de fagocítica huésped y células no fagocíticas. Las bacterias también deben enfrentarse con el reconocimiento y la actividad antimicrobiana del sistema inmune del huésped. El sistema inmune del huésped se compone de componentes innatos y adaptativos, incluyendo barreras físicas y químicas, las células inmunes, el sistema del complemento, y otros componentes de la inmunidad humoral. Mientras que muchas bacterias son susceptibles a la muerte y despeje de la respuesta inmune del huésped de varias capas, algunas bacterias patógenas y oportunistas han desarrollado mecanismos para infectar una variedad de células huésped y subvertir despeje de la respuesta inmune del huésped 1. Neisseria gonorrhoeae es un ejemplo de un patógeno bacteriano que está altamente adaptado para persistir en su huésped humano. N. gonorrhoeae coloniza fácilmente las superficies luminales de las células epiteliales de la mucosa del tracto urogenital, la faringe, la conjuntiva, y el recto. Colonización desencadena la abundante reclutamiento de neutrófilos en las mucosas. Los neutrófilos son fagocitos profesionales que poseen una variedad de procesos antimicrobianos para matar los microorganismos, sin embargo, N. gonorrhoeae es capaz de sobrevivir en la presencia de neutrófilos 2-5. Entender cómo los patógenos bacterianos como N. gonorrhoeae subvertir, suprimir, y secuestrar la respuesta inmune a sobrevivir en última instancia, en entornos host normalmente hostiles es crucial para el desarrollo de nuevas terapias para combatir las enfermedades infecciosas. Los protocolos experimentales a menudo utilizados para investigar la supervivencia bacteriana en las células huésped incluyen ensayos de recuento de colonias, ensayos de protección de gentamicina, y microscopía electrónica. En los ensayos de recuento de colonias, una población de células infectadas se lisa (por ejemplo, con un detergente para quich las bacterias son resistentes) para liberar las bacterias. Los lisados ​​se diluyeron y se extendieron en placas sobre medios con agar, y las unidades formadoras de colonias en los lisados ​​se enumeran para cada punto de tiempo y / o condición experimental. Este enfoque informa de la viabilidad de toda la población bacteriana, pero no es capaz de diferenciar entre intracelular y extracelular de supervivencia. Una variación en el ensayo de recuento de colonias, el ensayo de protección de gentamicina, mide específicamente la supervivencia bacteriana intracelular, basado en la incapacidad de los antibióticos gentamicina para cruzar la membrana plasmática eucariota 6. Sin embargo, este ensayo depende de las bacterias que son susceptibles a la muerte por la gentamicina (u otro antibiótico que es similar eucariota membrana impermeable a) y la incapacidad del antibiótico para tener acceso a las bacterias internos. Por lo tanto, un ensayo de protección de la gentamicina puede no ser eficaz para el examen de todas las especies bacterianas o al examinar la supervivencia bacteriana en altamentecélulas de pinocitosis, tales como los neutrófilos. Ninguno de estos enfoques revela la localización subcelular u otro comportamiento de las bacterias individuales (por ejemplo, si las bacterias forman agregados o microcolonias que se comportan de manera diferente a partir de células bacterianas individuales). Otro enfoque utilizado con frecuencia para examinar la viabilidad de las bacterias externas e internas individuales es-sección delgada microscopía electrónica de transmisión (TEM). Este enfoque es ventajoso porque puede proporcionar información acerca de la ubicación de las bacterias en las células huésped (por ejemplo fagosoma, citoplasma, autofagosoma), que se puede investigarse más a fondo mediante microscopía inmunoelectrónica con anticuerpos de oro acoplado contra marcadores subcelulares. Sin embargo, la microscopía de electrones no es especialmente sensible a la evaluación de la viabilidad bacteriana. Cuando las secciones embebidas son teñidas con acetato de uranilo, citrato de plomo, u otros reactivos densos en electrones y imágenes de microscopía de electrones, las bacterias electrón-densos se consideran viables y electrónicostron-lucent inviable 7,8. Sin embargo, esta hipótesis sobrevalora la viabilidad bacteriana, ya que sólo las bacterias muertas con membranas gravemente perturbado y desprovistos de citoplasma aparece electrón-Lucent. Además, algunas especies bacterianas pueden mostrar una gama de densidades de electrones, dependiendo de su etapa de crecimiento, lo que hace difícil determinar la viabilidad. Como una alternativa o además de estos métodos ampliamente utilizados, aquí proporcionamos protocolos y fundamento para el uso de colorantes fluorescentes que indican la viabilidad bacteriana para evaluar la supervivencia de las bacterias unidas a y internalizados por las células huésped. Para identificar bacterias extracelulares, las células infectadas se primera expuestos a un reactivo fluorescente, tal como una lectina o anticuerpo de bacterias específicas. Las células infectadas se permeabilizaron y luego expuestos a colorantes específicos de ADN que son diferencialmente accesible a las bacterias con intacta vs membranas degradadas, como un sustituto para la viabilidad bacteriana. En la primera protocol, la membrana permeable SYTO9 tintura identifica la población bacteriana total, mientras que el yoduro de propidio sólo se puede acceder a esas bacterias que han puesto en peligro las membranas y por lo tanto se considera no viable. Yoduro de propidio y SYTO9 se han utilizado para evaluar la viabilidad bacteriana en las biopelículas, discriminar patógena de bacterias no patógenas, y enumerar bacterias transmitidas por el agua viables 9-12. En el segundo protocolo, 4 &#39;, 6&#39; diamidino-2-fenilindol (DAPI) identifica bacterias totales, mientras SYTOX verde es sólo accesible a la población no viable. Estos pares de colorantes de viabilidad se pueden combinar con inmunofluorescencia para determinar la ubicación de cada bacteria en relación con una proteína de interés, por ejemplo, para definir la localización subcelular bacteriana. El uso de estos ensayos proporciona una visión clave en las interacciones que resultan en la destrucción bacteriana o la supervivencia durante la infección de las células huésped. Los protocolos descritos en este artículo se utilizaron para evaluar la viabilidad deN. gonorrhoeae que se une a y dentro de los neutrófilos humanos primarios, incluyendo en diferentes poblaciones de fagosomas de neutrófilos 5,13,14. Sin embargo, estos protocolos pueden ser aplicados para evaluar la viabilidad de las bacterias Gram-positivas y gram-negativas en fagocitos profesionales, los fagocitos no profesionales, y protozoos 15-24.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>21 G 3/4 butterfly needles for blood collection</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>367251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blood collection tubes with Sodium Heparin 10 ml</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>366480</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile water for irrigation</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>07-09-64-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran 500</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>31392</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S641</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrose</td>
			<td>Ricca Chemical Company</td>
			<td>RDCD0200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s PBS no Ca2+ or Mg2+</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SH3002802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll solution</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-1440-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 mm circular glass coverslips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-545-80 12CIR-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plates</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>3524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pooled Human Serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>Mediatech</td>
			<td>15-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SH3007103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human interleukin-8</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>208-IL/CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M3183</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium Iodide</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>L7007 or L7012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYTO9</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>L7007 or L7012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saponin</td>
			<td>Fluka Analytical</td>
			<td>47036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647-coupled soybean lectin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>L-32463</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYTOX Green</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>S7020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-CD63</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>H5C6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 555 Antibody Labeling Kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A20187</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer Bright Line</td>
			<td>Hausser Scientific</td>
			<td>1492</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>EMS</td>
			<td>78320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall Legend RT + Centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75004377</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fluorescence microscopy methods for determining the viability of bacteria in association with mammalian cells

Central para el campo de la patogénesis bacteriana es la capacidad de definir si y cómo los microbios sobreviven después de la exposición a las células eucariotas. Los protocolos actuales para hacer frente a estas preguntas incluyen ensayos de recuento de colonias, ensayos de protección de la gentamicina y la microscopía electrónica. Ensayos de recuento de colonias y de protección de gentamicina sólo evaluar la viabilidad de toda la población bacteriana y son incapaces de determinar la viabilidad bacteriana individuo. La microscopía electrónica se puede utilizar para determinar la viabilidad de las bacterias individuales y proporcionar información sobre su localización en células huésped. Sin embargo, las bacterias a menudo muestran una gama de densidades de electrones, lo que hace difícil la evaluación de la viabilidad. Este artículo describe protocolos para el uso de colorantes fluorescentes que revelan la viabilidad de las bacterias individuales dentro y asociados con las células huésped. Estos ensayos fueron desarrollados originalmente para evaluar la supervivencia de Neisseria gonorrhoeae en los neutrófilos humanos primarios, pero deben ser unpplicable a cualquier interacción de las células bacteria-huésped. Estos protocolos se combinan colorantes fluorescentes de membrana permeable (SYTO9 y 4 &#39;,6-diamino-2-fenilindol [DAPI]), que se tiñen todas las bacterias, con colorantes fluorescentes de membrana impermeable (yoduro de propidio y SYTOX Green), que sólo son accesibles a los bacterias no viables. Antes de la permeabilización de células eucariotas, se añade un anticuerpo o reactivo fluorescente para identificar las bacterias extracelulares. Por lo tanto estos ensayos discriminan la viabilidad de las bacterias adherentes a y dentro de las células eucariotas. También se proporciona un protocolo para el uso de los colorantes de viabilidad en combinación con anticuerpos fluorescentes a los marcadores de células eucarióticas, con el fin de determinar la localización subcelular de las bacterias individuales. Los colorantes de viabilidad bacterianas se tratan en este artículo son un complemento y / o alternativa sensible a las técnicas tradicionales de microbiología para evaluar la viabilidad de las bacterias individuales y proporcionar información con respecto a que las bacterias sobreviven en la célula huéspeds.

Los protocolos descritos se utilizaron para examinar la supervivencia de N. gonorrhoeae después de la exposición a la enseñanza primaria humanos neutrófilos 5,26. Los neutrófilos fueron infectadas con N. gonorrhoeae y procesados ​​con el protocolo 1, utilizando el colorante de viabilidad SYTO9-verde fluorescente y el yoduro de propidio rojo fluorescente (Figura 4 A). Los colorantes se añadieron en la presencia de saponina, que secuestra el colesterol para permeabil...

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Fluorescence Microscopy Methods for Determining the Viability of Bacteria in Association with Mammalian Cells

Central para el campo de la patogénesis bacteriana es la capacidad de definir si y cómo los microbios sobreviven después de la exposición a las células eucariotas. Este artículo describe protocolos para el uso de colorantes fluorescentes que revelan la viabilidad de las bacterias individuales dentro y asociados con las células huésped.

Fluorescencia métodos de microscopía para determinar la viabilidad de las bacterias en asociación con las células de mamíferos

Central to the field of bacterial pathogenesis is the ability to define if and how microbes survive after exposure to eukaryotic cells. Current protocols ...

fluorescence-microscopy-methods-for-determining-viability-bacteria

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

43.5K vistas.  University of Virginia Health Sciences Center.  Central para el campo de la patogénesis bacteriana es la capacidad de definir si y cómo los microbios sobreviven después de la exposición a las células eucariotas. Este artículo describe protocolos para el uso de colorantes fluorescentes que revelan la viabilidad de las bacterias individuales dentro y asociados con las células huésped. 

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Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the simultaneous infection of the cell by a number of phages, one of two pathways is chosen: lytic (virulent) or lysogenic (dormant)3,4. We recently developed a method for fluorescently labeling individual phages, and were able to examine the post-infection decision in real-time under the microscope, at the level of individual phages and cells5. Here, we describe the full procedure for performing the infection experiments described in our earlier work5. This includes the creation of fluorescent phages, infection of the cells, imaging under the microscope and data analysis. The fluorescent phage is a "hybrid", co-expressing wild- type and YFP-fusion versions of the capsid gpD protein. A crude phage lysate is first obtained by inducing a lysogen of the gpD-EYFP (Enhanced Yellow Fluorescent Protein) phage, harboring a plasmid expressing wild type gpD. A series of purification steps are then performed, followed by DAPI-labeling and imaging under the microscope. This is done in order to verify the uniformity, DNA packaging efficiency, fluorescence signal and structural stability of the phage stock. The initial adsorption of phages to bacteria is performed on ice, then followed by a short incubation at 35&deg;C to trigger viral DNA injection6. The phage/bacteria mixture is then moved to the surface of a thin nutrient agar slab, covered with a coverslip and imaged under an epifluorescence microscope. The post-infection process is followed for 4 hr, at 10 min interval. Multiple stage positions are tracked such that ~100 cell infections can be traced in a single experiment. At each position and time point, images are acquired in the phase-contrast and red and green fluorescent channels. The phase-contrast image is used later for automated cell recognition while the fluorescent channels are used to characterize the infection outcome: production of new fluorescent phages (green) followed by cell lysis, or expression of lysogeny factors (red) followed by resumed cell growth and division. The acquired time-lapse movies are processed using a combination of manual and automated methods. Data analysis results in the identification of infection parameters for each infection event (e.g. number and positions of infecting phages) as well as infection outcome (lysis/lysogeny). Additional parameters can be extracted if desired.

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

This article describes the procedure for preparing a fluorescently-labeled version of bacteriophage lambda, infection of E. coli bacteria, following the infection outcome under the microscope, and analysis of infection results.

A raíz de la celda de destino en<em&gt; E. coli</em&gt; Después de la infección por fagos Lambda

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the ...

Investigación

Inmunología e Infección

Tractable Mammalian Cell Infections with Protozoan-primed Bacteria

Many intracellular bacterial pathogens use freshwater protozoans as a natural reservoir for proliferation in the environment. Legionella pneumophila, the causative agent of Legionnaires' pneumonia, gains a pathogenic advantage over in vitro cultured bacteria when first harvested from protozoan cells prior to infection of mammalian macrophages. This suggests that important virulence factors may not be properly expressed in vitro. We have developed a tractable system for priming L. pneumophila through its natural protozoan host Acanthamoeba castellanii prior to mammalian cell infection. The contribution of any virulence factor can be examined by comparing intracellular growth of a mutant strain to wild-type bacteria after protozoan priming. GFP-expressing wild-type and mutant L. pneumophila strains are used to infect protozoan monolayers in a priming step and allowed to reach late stages of intracellular growth. Fluorescent bacteria are then harvested from these infected cells and normalized by spectrophotometry to generate comparable numbers of bacteria for a subsequent infection into mammalian macrophages. For quantification, live bacteria are monitored after infection using fluorescence microscopy, flow cytometry, and by colony plating. This technique highlights and relies on the contribution of host cell-dependent gene expression by mimicking the environment that would be encountered in a natural acquisition route. This approach can be modified to accommodate any bacterium that uses an intermediary host as a means for gaining a pathogenic advantage.

This technique provides a method to harvest, normalize and quantify intracellular growth of bacterial pathogens that are pre-cultivated in natural protozoan host cells prior to infections of mammalian cells. This method can be modified to accommodate a wide variety of host cells for the priming stage as well as target cell types.

Las infecciones tratables con células de mamíferos Protozoarios cebados con bacterias

Many intracellular bacterial pathogens use freshwater protozoans as a natural reservoir for proliferation in the environment. Legionella pneumophila, the ...

Use of Image Cytometry for Quantification of Pathogenic Fungi in Association with Host Cells

Studies of the cellular pathogenesis mechanisms of pathogenic yeasts such as Candida albicans, Histoplasma capsulatum, and Cryptococcus neoformans commonly employ infection of mammalian hosts or host cells (i.e. macrophages) followed by yeast quantification using colony forming unit analysis or flow cytometry. While colony forming unit enumeration has been the most commonly used method in the field, this technique has disadvantages and limitations, including slow growth of some fungal species on solid media and low and/or variable plating efficiencies, which is of particular concern when comparing growth of wild-type and mutant strains. Flow cytometry can provide rapid quantitative information regarding yeast viability, however, adoption of flow cytometric detection for pathogenic yeasts has been limited for a number of practical reasons including its high cost and biosafety considerations. Here, we demonstrate an image-based cytometric methodology using the Cellometer Vision (Nexcelom Bioscience, LLC) for the quantification of viable pathogenic yeasts in co-culture with macrophages. Our studies focus on detection of two human fungal pathogens: Histoplasma capsulatum and Candida albicans. H. capsulatum colonizes alveolar macrophages by replicating within the macrophage phagosome, and here, we quantitatively assess the growth of H. capsulatum yeasts in RAW 264.7 macrophages using acridine orange/propidium iodide staining in combination with image cytometry. Our method faithfully recapitulates growth trends as measured by traditional colony forming unit enumeration, but with significantly increased sensitivity. Additionally, we directly assess infection of live macrophages with a GFP-expressing strain of C. albicans. Our methodology offers a rapid, accurate, and economical means for detection and quantification of important human fungal pathogens in association with host cells.

Here, we demonstrate how image cytometry can be used for quantification of pathogenic fungi in association with host cells in culture. This technique can be used as an alternative to CFU enumeration.

El uso de citometría de imagen para la cuantificación de hongos patógenos en asociación con las células huésped

Studies of the cellular pathogenesis mechanisms of pathogenic yeasts such as Candida albicans, Histoplasma capsulatum, and Cryptococcus neoformans ...

Fluorescence in situ Hybridizations (FISH) for the Localization of Viruses and Endosymbiotic Bacteria in Plant and Insect Tissues

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a name given to a variety of techniques commonly used for visualizing gene transcripts in eukaryotic cells and can be further modified to visualize other components in the cell such as infection with viruses and bacteria. Spatial localization and visualization of viruses and bacteria during the infection process is an essential step that complements expression profiling experiments such as microarrays and RNAseq in response to different stimuli. Understanding the spatiotemporal infections with these agents complements biological experiments aimed at understanding their interaction with cellular components. Several techniques for visualizing viruses and bacteria such as reporter gene systems or immunohistochemical methods are time-consuming, and some are limited to work with model organisms&#160;and involve complex methodologies. FISH that targets RNA or DNA species in the cell is a relatively easy and fast method for studying spatiotemporal localization of genes and for diagnostic purposes. This method can be robust and relatively easy to implement when the protocols employ short hybridizing, commercially-purchased probes, which are not expensive. This is particularly robust when sample preparation, fixation, hybridization, and microscopic visualization do not involve complex steps. Here we describe a protocol for localization of bacteria and viruses in insect and plant tissues. The method is based on simple preparation, fixation, and hybridization of insect whole mounts and dissected organs or hand-made plant sections, with 20 base pairs short DNA probes conjugated to fluorescent dyes on their 5&#39; or 3&#39; ends. This protocol has been successfully applied to a number of insect and plant tissues, and can be used to analyze expression of mRNAs or other RNA or DNA species in the cell.

Fluorescence in situ Hybridizations FISH for the Localization of Viruses and Endosymbiotic Bacteria in Plant and Insect Tissues

We describe here a simple fluorescence in situ hybridization (FISH) method for the localization of viruses and bacteria in insect and plant tissues. This protocol can be extended for the visualization of mRNA in whole mount and microscopic sections.

Fluorescencia<em&gt; In situ</em&gt; Las hibridaciones (FISH) para la localización de los virus y las bacterias endosimbióticas en plantas e insectos tejidos

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a name given to a variety of techniques commonly used for visualizing gene transcripts in eukaryotic cells ...

Electroporation of Functional Bacterial Effectors into Mammalian Cells

The study of protein interactions in the context of living cells can generate critical information about localization, dynamics, and interacting partners. This information is particularly valuable in the context of host-pathogen interactions. Many pathogen proteins function within host cells in a variety of way such as, enabling evasion of the host immune system and survival within the intracellular environment. To study these pathogen-protein host-cell interactions, several approaches are commonly used, including: in vivo infection with a strain expressing a tagged or mutant protein, or introduction of pathogen genes via transfection or transduction. Each of these approaches has advantages and disadvantages. We sought a means to directly introduce exogenous proteins into cells. Electroporation is commonly used to introduce nucleic acids into cells, but has been more rarely applied to proteins although the biophysical basis is exactly the same. A standard electroporator was used to introduce affinity-tagged bacterial effectors into mammalian cells. Human epithelial and mouse macrophage cells were cultured by traditional methods, detached, and placed in 0.4 cm gap electroporation cuvettes with an exogenous bacterial pathogen protein of interest (e.g. Salmonella Typhimurium GtgE). After electroporation (0.3 kV) and a short (4 hr) recovery period, intracellular protein was verified by fluorescently labeling the protein via its affinity tag and examining spatial and temporal distribution by confocal microscopy. The electroporated protein was also shown to be functional inside the cell and capable of correct subcellular trafficking and protein-protein interaction. While the exogenous proteins tended to accumulate on the surface of the cells, the electroporated samples had large increases in intracellular effector concentration relative to incubation alone. The protocol is simple and fast enough to be done in a parallel fashion, allowing for high-throughput characterization of pathogen proteins in host cells including subcellular targeting and function of virulence proteins.

Electroporation was used to insert purified bacterial virulence effector proteins directly into living eukaryotic cells. Protein localization was monitored by confocal immunofluorescence microscopy. This method allows for studies on trafficking, function, and protein-protein interactions using active exogenous proteins, avoiding the need for heterologous expression in eukaryotic cells.

La electroporación de efectores bacterianos funcionales en células de mamífero

The study of protein interactions in the context of living cells can generate critical information about localization, dynamics, and interacting partners. ...

Porphyromonas gingivalis as a Model Organism for Assessing Interaction of Anaerobic Bacteria with Host Cells

Anaerobic bacteria far outnumber aerobes in many human niches such as the gut, mouth, and vagina. Furthermore, anaerobic infections are common and frequently of indigenous origin. The ability of some anaerobic pathogens to invade human cells gives them adaptive measures to escape innate immunity as well as to modulate host cell behavior. However, ensuring that the anaerobic bacteria are live during experimental investigation of the events may pose challenges. Porphyromonas gingivalis, a Gram-negative anaerobe, is capable of invading a variety of eukaryotic non-phagocytic cells. This article outlines how to successfully culture and assess the ability of P. gingivalis to invade human umbilical vein endothelial cells (HUVECs). Two protocols were developed: one to measure bacteria that can successfully invade and survive within the host, and the other to visualize bacteria interacting with host cells. These techniques necessitate the use of an anaerobic chamber to supply P. gingivalis with an anaerobic environment for optimal growth.
The first protocol is based on the antibiotic protection assay, which is largely used to study the invasion of host cells by bacteria. However, the antibiotic protection assay is limited; only intracellular bacteria that are culturable following antibiotic treatment and host cell lysis are measured. To assess all bacteria interacting with host cells, both live and dead, we developed a protocol that uses fluorescent microscopy to examine host-pathogen interaction. Bacteria are fluorescently labeled with 2&#39;,7&#39;-Bis-(2-carboxyethyl)-5-(and-6)-carboxyfluorescein acetoxymethyl ester (BCECF-AM) and used to infect eukaryotic cells under anaerobic conditions. Following fixing with paraformaldehyde and permeabilization with 0.2% Triton X-100, host cells are labeled with TRITC phalloidin and DAPI to label the cell cytoskeleton and nucleus, respectively. Multiple images taken at different focal points (Z-stack) are obtained for temporal-spatial visualization of bacteria. Methods used in this study can be applied to any cultivable anaerobe and any eukaryotic cell type.

Porphyromonas gingivalis as a Model Organism for Assessing Interaction of Anaerobic Bacteria with Host Cells

This article presents two protocols: one to measure anaerobic bacteria that can successfully invade and survive within the host, and the other to visualize anaerobic bacteria interacting with host cells. This study can be applied to any cultivable anaerobe and any eukaryotic cell type.

Porphyromonas gingivalis como organismo modelo para la evaluación de la interacción de bacterias anaerobias con células huésped

Anaerobic bacteria far outnumber aerobes in many human niches such as the gut, mouth, and vagina. Furthermore, anaerobic infections are common and ...

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte extravasation might result in pathophysiological changes in the CNS. Thus, investigation of lymphocyte migration into the CNS is important to understand inflammatory CNS diseases and to develop new therapy approaches. Here we present an in vitro model of the human blood-brain barrier to study lymphocyte extravasation. Human brain microvascular endothelial cells (HBMEC) are confluently grown on a porous polyethylene terephthalate transwell insert to mimic the endothelium of the blood-brain barrier. Barrier function is validated by zonula occludens immunohistochemistry, transendothelial electrical resistance (TEER) measurements as well as analysis of evans blue permeation. This model allows investigation of the diapedesis of rare lymphocyte subsets such as CD56brightCD16dim/- NK cells. Furthermore, the effects of other cells, cytokines and chemokines, disease-related alterations, and distinct treatment regimens on the migratory capacity of lymphocytes can be studied. Finally, the impact of inflammatory stimuli as well as different treatment regimens on the endothelial barrier can be analyzed.

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Here, we describe a human blood-brain barrier model enabling to investigate lymphocyte transmigration into the central nervous system in vitro.

Análisis de linfocitos extravasación El uso de una<em&gt; In Vitro</em&gt; Modelo de la barrera sangre-cerebro humano

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

Quantification of Efferocytosis by Single-cell Fluorescence Microscopy

Studying the regulation of efferocytosis requires methods that are able to accurately quantify the uptake of apoptotic cells and to probe the signaling and cellular processes that control efferocytosis. This quantification can be difficult to perform as apoptotic cells are often efferocytosed piecemeal, thus necessitating methods which can accurately delineate between the efferocytosed portion of an apoptotic target versus residual unengulfed cellular fragments. The approach outlined herein utilizes dual-labeling approaches to accurately quantify the dynamics of efferocytosis and efferocytic capacity of efferocytes such as macrophages. The cytosol of the apoptotic cell is labeled with a cell-tracking dye to enable monitoring of all apoptotic cell-derived materials, while surface biotinylation of the apoptotic cell allows for differentiation between internalized and non-internalized apoptotic cell fractions. The efferocytic capacity of efferocytes is determined by taking fluorescent images of live or fixed cells and quantifying the amount of bound versus internalized targets, as differentiated by streptavidin staining. This approach offers several advantages over methods such as flow cytometry, namely the accurate delineation of non-efferocytosed versus efferocytosed apoptotic cell fractions, the ability to measure efferocytic dynamics by live-cell microscopy, and the capacity to perform studies of cellular signaling in cells expressing fluorescently-labeled transgenes. Combined, the methods outlined in this protocol serve as the basis for a flexible experimental approach that can be used to accurately quantify efferocytic activity and interrogate cellular signaling pathways active during efferocytosis.

Efferocytosis, the phagocytic removal of apoptotic cells, is required to maintain homeostasis and is facilitated by receptors and signaling pathways that allow for the recognition, engulfment, and internalization of apoptotic cells. Herein, we present a fluorescence microscopy protocol for the quantification of efferocytosis and the activity of efferocytic signaling pathways.

Cuantificación de Efferocytosis por microscopía de fluorescencia unicelular

Studying the regulation of efferocytosis requires methods that are able to accurately quantify the uptake of apoptotic cells and to probe the signaling ...

High-throughput Measurement of Plasma Membrane Resealing Efficiency in Mammalian Cells

In their physiological environment, mammalian cells are often subjected to mechanical and biochemical stresses that result in plasma membrane damage. In response to these damages, complex molecular machineries rapidly reseal the plasma membrane to restore its barrier function and maintain cell survival. Despite 60 years of research in this field, we still lack a thorough understanding of the cell resealing machinery. With the goal of identifying cellular components that control plasma membrane resealing or drugs that can improve resealing, we have developed a fluorescence-based high-throughput assay that measures the plasma membrane resealing efficiency in mammalian cells cultured in microplates. As a model system for plasma membrane damage, cells are exposed to the bacterial pore-forming toxin listeriolysin O (LLO), which forms large 30-50 nm diameter proteinaceous pores in cholesterol-containing membranes. The use of a temperature-controlled multi-mode microplate reader allows for rapid and sensitive spectrofluorometric measurements in combination with brightfield and fluorescence microscopy imaging of living cells. Kinetic analysis of the fluorescence intensity emitted by a membrane impermeant nucleic acid-binding fluorochrome reflects the extent of membrane wounding and resealing at the cell population level, allowing for the calculation of the cell resealing efficiency. Fluorescence microscopy imaging allows for the enumeration of cells, which constitutively express a fluorescent chimera of the nuclear protein histone 2B, in each well of the microplate to account for potential variations in their number and allows for eventual identification of distinct cell populations. This high-throughput assay is a powerful tool expected to expand our understanding of membrane repair mechanisms via screening for host genes or exogenously added compounds that control plasma membrane resealing.

Here we describe a high-throughput fluorescence-based assay that measures the plasma membrane resealing efficiency through fluorometric and imaging analyses in living cells. This assay can be used for screening drugs or target genes that regulate plasma membrane resealing in mammalian cells.

Medida de alto rendimiento de membrana plasmática resellado eficacia en células de mamíferos

In their physiological environment, mammalian cells are often subjected to mechanical and biochemical stresses that result in plasma membrane damage. In ...

Image Processing Protocol for the Analysis of the Diffusion and Cluster Size of Membrane Receptors by Fluorescence Microscopy

Particle tracking on a video sequence and the posterior analysis of their trajectories is nowadays a common operation in many biological studies. Using the analysis of cell membrane receptor clusters as a model, we present a detailed protocol for this image analysis task using Fiji (ImageJ) and Matlab routines to: 1) define regions of interest and design masks adapted to these regions; 2) track the particles in fluorescence microscopy videos; 3) analyze the diffusion and intensity characteristics of selected tracks. The quantitative analysis of the diffusion coefficients, types of motion, and cluster size obtained by fluorescence microscopy and image processing provides a valuable tool to objectively determine particle dynamics and the consequences of modifying environmental conditions. In this article we present detailed protocols for the analysis of these features. The method described here not only allows single-molecule tracking detection, but also automates the estimation of lateral diffusion parameters at the cell membrane, classifies the type of trajectory and allows complete analysis thus overcoming the difficulties in quantifying spot size over its entire trajectory at the cell membrane.

Here, we present a protocol for single particle tracking image analysis that allows quantitative evaluation of diffusion coefficients, types of motion and cluster sizes of single particles detected by fluorescence microscopy.

Procesamiento de imagen protocolo para el análisis de la difusión y del tamaño del clúster de receptores de membrana por microscopía de fluorescencia

Particle tracking on a video sequence and the posterior analysis of their trajectories is nowadays a common operation in many biological studies. Using ...