El trabajo en el laboratorio de SM es apoyado por un Wellcome Trust Career Development Research Fellowship [WT097411MA].

<ol>
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Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Al supervisar la autofagia y el citoesqueleto in vitro utilizando células de cultivo de tejidos, los protocolos descritos en las secciones 1 y 2 se pueden aplicar a una amplia variedad de tipos de células de cultivo de tejidos. Por otra parte, para seguir la autofagia (por ejemplo, Atg8 / LC3 + ve autofagosomas) y el citoesqueleto (por ejemplo., Colas de actina, jaulas septinas) dinámica, en tiempo real durante la infección por Shigella utilizando imágenes en vivo, las células de cultivo de tejido pueden ser transfectadas transitoriamente utilizando GFP, construcciones RFP- o CFP-etiquetado como anteriormente descritos 7,8. Para aumentar el porcentaje de células infectadas por Shigella (es decir, generalmente deseable para el análisis en tiempo real teniendo en cuenta que Shigella puede invadir 5-30% de las células HeLa en 100:. 1 MOI), añadir directamente 400 l de Shigella (OD 600 = 0,3 -0,6) a las células en 2 ml de MEM (suero de hambre) y esperar por lo menos 1,5 horas después de la infección para la entrada de bacterias suficiente, escapar del fagosoma, la replicación, aureconocimiento tophagy y enjaulamiento septina. Alternativamente, se puede utilizar la cepa de Shigella M90T AfaI que expresa la adhesina AfaE y han mucho más altas capacidades de invasión en las células epiteliales comparación con la cepa M90T 28. Es de destacar que la cepa M90T AfaI aún no se ha probado in vivo utilizando el pez cebra. Las placas de colonias de Shigella pueden mantenerse a 4 ° C durante 2-3 días y se utilizan para varios experimentos. Sin embargo, con el tiempo, las colonias de Shigella que han perdido el plásmido de virulencia también puede absorber el Rojo Congo y parece que han conservado su plásmido de virulencia. Por este motivo, se recomienda utilizar las cepas bacterianas frescos siempre que sea posible. Cuando el control de la biología de las células de la infección in vivo, los protocolos descritos en las secciones 3 y 4 de tipo salvaje utilización AB línea de pez cebra. Para monitorizar las interacciones -leukocyte Shigella, líneas de pez cebra transgénico se pueden utilizar, por ejemplo, mpx: GFP o lyz: DsRed a Visualize neutrófilos 19,29,30 o MPEG1: mCherry visualizar macrófagos 19,31. Para visualizar la autofagia en vivo, la línea transgénica pez cebra-GFP Lc3 19,24 se puede utilizar como se describe en la sección 3.8. Para perturbar la autofagia en vivo, la dosis efectiva oligonucleótido morfolino debe evaluarse experimentalmente en base a su eficacia para inhibir la transcripción de empalme o la traducción de proteínas. Es aconsejable llevar a cabo un experimento de valoración y para confirmar el agotamiento por RT-PCR (por oligonucleótido morfolino de empalme) o por SDS-PAGE (oligonucleótido de morfolino de traslación) 32. Aislamiento de ARN a partir de embriones de pez cebra o larvas se puede realizar mediante la extracción de tiocianato de guanidinio-fenol-cloroformo. Para extraer proteína a partir de larvas de pez cebra (8 a 15 larvas / tubo), homogeneizar mecánicamente usando una mano de mortero en 200 l de tampón de lisis (Tris 1 M, 5 M NaCl, 0,5 M EDTA, 0,01% octilfenol condensac óxido de etilenoe, y el inhibidor de la proteasa). Tubos centrífuga a 19.000 xga 4 ° C durante 15 min y transferir el sobrenadante a un nuevo tubo. Añadir tampón de Laemmli y se calienta la muestra a 95 ° C durante 15 min. Lisados ​​pueden ser almacenadas a -80 ° C hasta que sea necesario, y pueden ser evaluadas por Western Blot como se describe en la sección 2.3. El pez cebra es un modelo excelente para la aplicación del fármaco en vivo. Análisis utilizando oligonucleótidos de morfolino se puede complementar con fármacos establecidos para manipular la autofagia (por ejemplo, rapamicina y bafilomicina). Larvas no infectadas y / o infectados puede ser tratado con rapamicina (1,5 M) o bafilomicina (80 nM) diluido en E2 y el flujo de autofagia puede evaluarse mediante transferencia de Western como se describe en 25,33. La consecuencia de la manipulación de la autofagia en el resultado de la infección y la supervivencia de las larvas infectadas se puede evaluar como se describe en la sección 3.5. Además de estudiar la célula huéspeddeterminantes, in vitro e in vivo protocolos pueden ser aplicados para evaluar determinantes bacterianas necesarias para el reconocimiento de la autofagia, utilizando cepas mutantes bacterianas que están diferencialmente reconocidos por la autofagia, por ejemplo., Shigella ΔicsA (la proteína Shigella ICSA recluta N-WASP y luego Arp2 / 3 de cola de actina y la formación septina jaula; en su ausencia no puede haber colas de actina, no hay jaulas septina) y ShigellaΔicsB (Shigella evita la respuesta autofagia mediante la proteína efectora bacteriana ICSB, lo que impide la contratación de maquinaria para la autofagia ICSA; en su ausencia no puede haber más jaulas septina, más autofagia) 7,8. Shigella no es un patógeno natural de pez cebra y crece óptimamente a 37 ° C. Sin embargo, el trabajo ha demostrado que los factores de virulencia necesarios para la invasión Shigella, escapar de la vacuola fagocítica y la replicación en el CYTosol puede expresarse y son funcionales en larvas de pez cebra a 28 ° C 19. 28 ° C es la temperatura más comúnmente utilizado para la cría de pez cebra y la temperatura estándar para asegurar el desarrollo de pez cebra normal de 23. Sorprendentemente, los principales eventos patogénicos que conducen a la shigelosis en los seres humanos (es decir, la muerte celular de macrófagos, la invasión y multiplicación dentro de las células epiteliales, propagación de célula a célula, la destrucción inflamatoria del epitelio del huésped) se reproducen fielmente en el modelo de pez cebra de la infección por Shigella 19. Genes autofagia y el citoesqueleto se expresan de forma ubicua y tienen una amplia gama de funciones biológicas. Estudios en ratones han demostrado que la eliminatoria de la autofagia esencial 26 o septina genes 5 son embriones letal, y es probable que algunos de estos genes también será esencial para el desarrollo del pez cebra (aunque este problema puede ser reducido por el hecho de que el pez cebra tiene múltiplesgenes paralogous 33). Si es así, hay varias alternativas para superar este problema, incluyendo (i) el uso de reactivos farmacológicos para regular la autofagia y el citoesqueleto, (ii) morfolinos se pueden valorar hacia abajo, (iii) knockout de los genes puede ser diseñado para sólo celda específica tipos, y / o (iv) los genes implicados en el reconocimiento autophagic que no son esenciales para el desarrollo animal (por ejemplo., p62) pueden ser el objetivo. Mientras que el pez cebra es un sistema modelo ideal para investigar la autofagia y el citoesqueleto durante la infección por Shigella, herramientas moleculares actualidad se carece. El campo necesita para generar nuevas herramientas y expresión específica de células de accionamiento de las proteínas de interés. Para derribar expresión de genes autofagia / citoesqueleto, se requieren nuevas secuencias de morfolino, y nuevos métodos para la ingeniería del genoma (por ejemplo, TALEN, CRISPR / Cas9) también se pueden utilizar. Mientras tanto, varias herramientas generados anteriormente para los estudios de humanos o de ratónigualmente puede trabajar para el pez cebra. Las bacterias intracelulares S. flexneri ha surgido como un organismo modelo excepcional para abordar las cuestiones clave en la biología, incluyendo la capacidad de las bacterias para ser reconocido por el sistema inmune 1,2. La célula hospedadora emplea septins para restringir la motilidad de S. flexneri y dirigirlos a la autofagia, un componente crítico de la inmunidad celular autónoma 7,8. Estas observaciones sugieren un nuevo marco molecular para estudiar la autofagia y su capacidad para degradar bacterias citosólicas. Una cuestión importante es ahora de descifrar completamente los eventos moleculares y celulares subyacentes, y para validar estos hechos analizados in vitro durante la infección bacteriana in vivo en modelos animales pertinentes. Para este fin, el pez cebra se ha establecido como un nuevo huésped valiosa para el análisis de S. infección flexneri 19. Las interacciones entre las bacterias y las células huésped se pueden obtener imágenes en alta resolución, yel modelo de pez cebra debería resultar útil para la comprensión de la biología celular de la infección por Shigella in vivo. Larvas de pez cebra se puede utilizar para investigar el papel de la autofagia bacteriana en la defensa del huésped, y el trabajo que ha demostrado que la perturbación de la autofagia puede afectar negativamente a la supervivencia de acogida en respuesta a la infección por Shigella 19. Las observaciones generadas a partir de estudio de Shigella, septina enjaulamiento y autofagia in vitro utilizando células de cultivo de tejidos y en vivo utilizando larvas de pez cebra podría proporcionar avances fundamentales en la comprensión de la defensa del huésped. También podrían sugerir el desarrollo de nuevas estrategias para combatir las enfermedades infecciosas. Un objetivo fundamental de este informe es dar sentido a los eventos moleculares y celulares analizados in vitro (es decir, la autofagia, las colas de actina, septina enjaular) durante la infección bacteriana in vivo en el contexto de una entIRE organismo, utilizando larvas de pez cebra. Si no está familiarizado con la biología del pez cebra y la manipulación, se puede hacer referencia a los protocolos de profundidad para la cría de pez cebra adecuada 23 y en el análisis in vivo de la infección por el pez cebra 19,35.

Shigella flexneri, una bacteria enteropatógena invasiva Gram-negativa, puede escapar de los fagosomas al citosol, y polimerizar el citoesqueleto de actina de acogida para evadir la respuesta inmune citosólicas y promover intra e intercelular movimiento 1,2. A pesar de la comprensión de la motilidad basado en actina in vitro 3,4, los mecanismos que restringen la diseminación bacteriana in vivo no han sido completamente definido. Esto es crítico para una comprensión más completa de la inmunidad innata y la defensa del huésped. Septinas, una familia de proteínas altamente conservadas entre los metazoos, son guanosina trifosfato (GTP) -vinculante proteínas que se ensamblan en complejos hetero-oligoméricos y forman filamentos polares que se asocian con las membranas celulares y el citoesqueleto de 5,6. Trabajos recientes han descubierto que las células huésped infectadas pueden impedir la motilidad basado Shigella actina por bacterias compartimentar dirigidos a autophAgy dentro &quot;jaulas septina &#39;, revelando el primer mecanismo celular que contrarresta la motilidad basado actina 7,8. Un campo abierto de investigación se encuentra ahora en la &quot;biología septina y la infección&quot;. Asamblea Septina, inducida por una variedad de agentes patógenos (por ejemplo, Listeria monocytogenes 7,9,10, Mycobacterium marinum 7,8, Candida albicans 11), puede surgir como un tema clave en la defensa del huésped 5,12. La autofagia, un proceso de degradación intracelular altamente conservada, es visto como un componente clave de la inmunidad de células autónomas debido a su capacidad para ofrecer bacterias citosólicas al lisosoma 13,14. Sin embargo, el papel de la autofagia bacteriana in vivo para restringir o promover la replicación bacteriana sigue siendo poco entendido 15,16. El pez cebra (Danio rerio) ha surgido como un modelo para el estudio de los vertebrados de infecciones debido a que es accesible ópticamenteen las etapas larvales cuando el sistema inmune innato ya es funcional 17,18. Trabajos recientes han caracterizado a la susceptibilidad de las larvas de pez cebra para S. flexneri, un paradigma para la autofagia bacteriana 15, y se ha utilizado el modelo de infección -zebrafish Shigella a estudiar la manipulación de la autofagia para la terapia antibacteriana in vivo 19. Este informe proporciona nuevas herramientas y ensayos para estudiar S. interacciones flexneri con la autofagia y el citoesqueleto. En una primera etapa, los protocolos para monitorear las interacciones autofagia citoesqueleto se describen utilizando la infección por Shigella de la línea celular epitelial humana HeLa. Para evaluar el papel de las interacciones autofagia-citoesqueleto en el proceso de infección por Shigella in vitro, los métodos para manipular la autofagia y componentes del citoesqueleto (utilizando siRNA o reactivos farmacológicos) se proporcionan. El nuevo trabajo ha demostrado que mediante el uso de Shigella infección olarvas de pez cebra f, ensayos similares se puede aplicar para estudiar la biología de las células de la infección in vivo. Protocolos para preparar e infectan larvas de pez cebra se detallan, y para evaluar la respuesta del huésped a la infección por Shigella en vivo, los protocolos para determinar la supervivencia de acogida y la carga bacteriana de larvas infectadas se proporcionan. Métodos para controlar el reclutamiento de marcadores septinas y autofagia a Shigella (utilizando larvas de pez cebra fija o vivir) y los métodos para probar el papel de estos procesos in vivo [usando oligonucleótidos de morfolino (inyectadas en embriones en estadio de 1-4 células) o reactivos farmacológicos ( se añade directamente al agua del baño de pez cebra)] también se discuten. Se espera que este programa de trabajo para proporcionar una visión de los mecanismos necesarios para el control de la infección por las respuestas de acogida citosólicas.

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	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">Name of Material/ Equipment</td>
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			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
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		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">Bafilomycin A1</td>
			<td style="width:240px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>B1793&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">Blebbistatin</td>
			<td style="width:240px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>B0560</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Borosilicate glass microcapillars&#160;</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>30038</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Coarse manual manipulator&#160;</td>
			<td>Narishige</td>
			<td style="width:119px;">M-152</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cytochalasin D</td>
			<td style="width:240px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">C6762</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4&#39;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td>
			<td style="width:240px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:119px;">D1306</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">Dumont #5 fine tweezers</td>
			<td style="width:240px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">11254-20</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Forchlorfeneuron&#160;</td>
			<td style="width:240px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">32974</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">Goat anti-mouse IgG (H+L) antibody</td>
			<td style="width:240px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:119px;">N/A&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">Goat ant-rabbit IgG (H+L) antibody</td>
			<td style="width:240px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">JetPEI transfection reagent</td>
			<td style="width:240px;">Polyplus transfection</td>
			<td style="width:119px;">101-01N</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">Latrunculin B</td>
			<td style="width:240px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">L5288</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">LC3 antibody</td>
			<td style="width:240px;">Novus Biologicals</td>
			<td style="width:119px;">NB100-2220</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">Low melting agarose</td>
			<td style="width:240px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">V2111</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">MatTek glass bottom dish</td>
			<td style="width:240px;">MatTek corporation</td>
			<td style="width:119px;">P35G-1.0-14</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MEM plus L-alanyl-L-glutamine&#160;</td>
			<td style="width:240px;">GIBCO</td>
			<td style="width:119px;">41090028</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">MEM non-essential amino acids solution</td>
			<td style="width:240px;">GIBCO</td>
			<td style="width:119px;">11140-035</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microinjector&#160;</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>IM-300</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micropipette puller device&#160;</td>
			<td>Sutter Instrument Co., Novato,</td>
			<td>P-87&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">Mineral oil</td>
			<td style="width:240px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P35G-1.0-14</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">Monoclonal anti-tubulin, acetylated antibody&#160;</td>
			<td style="width:240px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T6793</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nocodazole</td>
			<td style="width:240px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">M1404</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">N-phenylthiourea&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P7629</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:240px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">158127</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phalloidin&#160;</td>
			<td style="width:240px;">Molecular Probes</td>
			<td>A12379</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">Phenol red solution</td>
			<td style="width:240px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P0290</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">Protease inhibitor cocktail</td>
			<td style="width:240px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">4693116001</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:412px;">p62/SQSTM1 antibody</td>
			<td style="width:240px;">Cliniscience</td>
			<td style="width:119px;">PM045</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rapamycin</td>
			<td style="width:240px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">R8781</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">Sodium pyruvate</td>
			<td style="width:240px;">GIBCO</td>
			<td style="width:119px;">11360039</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">Transfection reagent</td>
			<td style="width:240px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">12252-011</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vectashield hard set mounting medium containing DAPI&#160;</td>
			<td style="width:240px;">Vector Laboratories</td>
			<td style="width:119px;">H-1500&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of shigella flexneri to study autophagy-cytoskeleton interactions

Flexneri Shigella es un patógeno intracelular que puede escapar de los fagosomas para alcanzar el citosol, y polimerizar el anfitrión actina del citoesqueleto para promover su motilidad y difusión. El nuevo trabajo ha demostrado que las proteínas implicadas en la motilidad actina basada también están vinculados a la autofagia, un proceso de degradación intracelular crucial para la inmunidad celular autónoma. Sorprendentemente, las células huésped pueden impedir la movilidad basada en la actina de S. flexneri por compartimentar bacterias dentro de &#39;jaulas septina&#39; y la orientación a la autofagia. Estas observaciones indican que una comprensión más completa de septins, una familia de proteínas de unión a GTP filamentosos, proporcionará nuevos conocimientos sobre el proceso de autofagia. Este informe describe los protocolos para monitorear las interacciones autofagia-citoesqueleto causadas por S. flexneri in vitro utilizando células de cultivo de tejidos e in vivo utilizando larvas de pez cebra. Estos protocolos permiten la investigación de mechanis intracelularesms que controlan diseminación bacteriana a nivel de organismo molecular, celular, y todo.

Tras la infección de las células de cultivo de tejidos in vitro, S. flexneri puede escapar del fagosoma e invadir el citosol. En el citosol, las células huésped pueden prevenir la basada en la motilidad-actina de Shigella por compartimentar las bacterias dentro de jaulas de septinas (Figura 1A). Las bacterias atrapadas por jaulas septinas también pueden marcarse mediante marcadores de autofagia p62 (Figura 1B) y LC3 (Figura 1C). Estas observaciones ponen de manifiesto un nuevo mecanismo de defensa del huésped que limita la difusión de patógenos invasivos, y también revelan nuevos vínculos entre la autofagia y el citoesqueleto. Sorprendentemente, el agotamiento de los marcadores de autofagia reduce significativamente septinas jaulas de bacterias (Figura 2A), y el trabajo también ha demostrado que el agotamiento de las jaulas de septinas reduce significativamente el reclutamiento de los marcadores de autofagia 8. Así, al menos en el caso de Shigella, septina conjunto de jaula y formatio autofagosoman puede ser visto como procesos interdependientes. Otros requisitos celulares para la compartimentación de Shigella por jaulas septinas incluyen polimerización de la actina y la actividad de actomiosina (Figura 2B). No existe un modelo natural de ratón de la shigelosis, y la investigación de la patogénesis de Shigella, la biología y la autofagia septina bacteriana in vivo se pueden beneficiar de un nuevo modelo animal de la infección, las larvas de pez cebra 19. Es posible infectar larvas de pez cebra mediante la inyección de bacterias en diversos sitios anatómicos tales como inyecciones intravenosas caudales para los experimentos de supervivencia, y las inyecciones musculares de la cola para la microscopía in vivo (Figura 3A). Dependiendo de la dosis, S. flexneri inyecta en larvas de pez cebra puede o bien ser eliminado dentro de 48 horas después de la infección, o puede dar lugar a una infección progresiva y finalmente fatal (Figuras 3B - 3D). Shigella virulencia factors se expresan a 28 ° C, la temperatura óptima de crecimiento del pez cebra, pez cebra y la infección por Shigella es estrictamente dependiente de su sistema de secreción de tipo III (T3SS) 19, un determinante de virulencia esencial en la enfermedad humana. Tomado en conjunto, estas observaciones indican que la larva de pez cebra representa un nuevo huésped valiosa para el análisis in vivo de la infección por Shigella. La accesibilidad óptica de las larvas de pez cebra permite la visualización de las jaulas septina vivo (Figura 4A) en, un logro que nunca antes se había logrado mediante modelos huésped de mamífero. Para complementar la evidencia de que las jaulas septina atrapan bacterias específicas para la autofagia en vivo, se puede infectar larvas de pez cebra transgénico que expresa GFP-Lc3 y observar contratación marcador de autofagia de Shigella (Figura 4B). Para el análisis de ultrastrucutral autofagosomas Shigella in vivo, elmicroscopía ECTRON se puede utilizar para mostrar claramente el secuestro citosólica de bacterias por vacuolas dobles de membrana 19. La autofagia es vista como un componente clave de la inmunidad de células autónomas y un mecanismo de defensa crucial contra bacterias intracytosolic 14-16. Para caracterizar la función de la autofagia in vivo, p62 larvas de pez cebra morfolino-tratada puede ser utilizado. A diferencia de la maquinaria autofagia núcleo [por ejemplo., Las 36 proteínas relacionadas con la autofagia (ATG) 26], p62 no es esencial para el desarrollo de vertebrados y 27 larvas de pez cebra por lo tanto puede desarrollarse normalmente antes de la infección. Sorprendentemente, las larvas de p62-agotado inoculados con S. resultado flexneri en un aumento significativo de la mortalidad y el aumento de la carga bacteriana 19. De acuerdo con el trabajo in vitro que muestran que el montaje septina jaula es interdependiente con la formación autofagosoma 7,8, reclutamiento septina a Shigella se reduce claramente en larvas p62-empobrecido ( <strong&gt; Figura 4C). Estos datos demuestran que la supervivencia depende de pez cebra autofagia mediada por p62 para controlar la infección bacteriana intracelular. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51601/51601fig1highres.jpg" width="500" /> Figura 1. La jaula septinas in vitro. Células HeLa (A) se infectaron con S. flexneri durante 4 h 40 min, fijo, marcado con anticuerpos contra SEPT9 y phalloidin, y fotografiada por microscopía confocal. Barra de escala, 1 m. (B) células HeLa fueron infectadas con S. flexneri durante 4 h 40 min, fijo, marcado con anticuerpos frente a p62 y sept2, y fotografiada por microscopía de luz fluorescente. Barra de escala, 1 m. Células (C) HeLa fueron transfectadas con GFP-Atg8 / LC3, infectado con S. flexneri durante 4 h 40 min, fijo, marcado con anticuerpos contra sept2, y fotografiada por fluorescentes mi luzmicroscopia. Barra de escala, 1 m. Estas cifras se han modificado desde Mostowy et al 7. <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51601/51601fig2highres.jpg" width="500" /> Figura 2. requisitos celulares para la formación jaula -septin Shigella. (A) células HeLa fueron tratados con control (CTRL), p62, ATG5, ATG6 o ATG7 siRNA. Lisados ​​de células enteras de células tratadas con siRNA se inmunotransfirieron para GAPDH, p62, ATG5, ATG6 o ATG7 para mostrar la eficiencia de agotamiento siRNA (arriba). siRNA células tratadas se infectaron con S. flexneri durante 4 h 40 min, fijo, y etiquetados para la microscopía cuantitativa. Gráficos (abajo) representan la media ± SEM% de Shigella dentro de jaulas de sept2 n ≥3 experimentos por tratamiento. (B) células HeLa fueron infectadas con S. flexneri, tratado con DMSO, citocalasina D (CytD), latrunculin B (LatB), nocodazole (Noco), o blebbistatin (ampolla) y después de 4 h 40 min se fijaron y etiquetados para la microscopía cuantitativa. Los gráficos representan la media ± SEM% de Shigella dentro de jaulas sept2 a partir de dos experimentos independientes por tratamiento. Estas cifras se han modificado desde Mostowy et al 7. <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51601/51601fig3highres.jpg" width="500" /> Figura 3. El modelo de pez cebra de la infección por Shigella. (A) Imágenes para ilustrar la orientación de la larva de pez cebra bajo el microscopio estereoscópico. (Panel izquierdo) de pez cebra larvas de 72 h después de la fertilización se posiciona lateralmente en la placa de inyección con su lado dorsal hacia la aguja de inyección. Infección (panel medio) del torrente sanguíneo fue realizado por injecting las bacterias (solución roja) en la vena caudal, posterior a la apertura urogenital. (Panel derecho) La infección en el músculo de la cola se llevó a cabo mediante la inyección de las bacterias (solución de color rojo) sobre un somite. (B) Curvas de supervivencia de larvas de 72 horas después de la fertilización inyectados con diversas dosis de S. flexneri y se incubó a 28 ° C durante 48 h después de la infección. El inóculo efectivo se clasificó como bajo (&lt;10 CFU 3, círculos abiertos), medio (~ 4 x 10 3 UFC, triángulos abiertos) o alta (~ 10 4 CFU, cuadrados abiertos). % ± SEM (barras horizontales) La media de n ≥3 experimentos por clase inóculo. (C) La enumeración de bacterias vivas en los homogeneizados de larvas individuales en diferentes momentos después de la infección medido por placas en LB Nota, sólo larvas de haber sobrevivido a la infección se incluyen en el análisis de la enumeración. La media ± SEM (barras horizontales) también se muestra. (D) Distribución de las buenas prácticas agrarias Shigella determinado porimágenes en vivo usando un estereomicroscopio fluorescente en diversos momentos después de la infección usando un, medio o inóculo alta dosis baja (caudal inyecciones intravenosas). Superposición imagen de transmisión (gris) y la fluorescencia de GFP (verde) (B) de -. (D) Estas cifras se han modificado desde Mostowy et al 19. <img alt="Figura 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51601/51601fig4highres.jpg" width="500" /> Figura 4. la biología celular de la infección por Shigella in vivo. (A) larvas de pez cebra fueron infectados en el músculo de la cola con GFP-Shigella (dosis baja) durante 24 horas, fijo, marcado con anticuerpos contra SEPT7 (rojo) y para GFP (verde ), y la imagen por microscopía confocal. La barra de escala, 5 micras. Larvas de pez cebra (B) GFP-Lc3 estaban infectados con mCherry- Shigella (dosis media) para4 hr, fijo, marcado con anticuerpos contra mCherry (rojo) y de GFP (verde), y la imagen por microscopía confocal. . Barra de escala, 1.5 micras (C) larvas de pez cebra se tratara con el control (CTRL; imagen de la izquierda) o p62 (imagen de la derecha) morfolinos fueron infectadas con Shigella GFP durante 4 horas (dosis media), fijo, marcado con anticuerpos contra SEPT7 ( rojo) y para GFP (verde), y la imagen por microscopía confocal. Flechas destacan algunos ejemplos de Shigella atrapadas en jaulas septinas (CTRL) o no (p62 agotado) una después de la infección 4 hr. Barra de escala, 5 m. Estas cifras se han modificado desde Mostowy et al 19.

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Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

Para contrarrestar la diseminación de patógenos, células huésped reorganizar su citoesqueleto de compartimentar bacterias e inducir la autofagia. Uso de la infección por Shigella de las células de cultivo de tejidos, de acogida y determinantes de patógenos subyacentes este proceso se identifican y se caracteriza. El uso de modelos de pez cebra de la infección por Shigella, el papel de las moléculas y mecanismos descubiertos son investigados in vivo.

El uso de<em&gt; Flexneri Shigella</em&gt; Para estudiar las interacciones Autophagy Citoesqueleto

Shigella flexneri is an intracellular pathogen that can escape from phagosomes to reach the cytosol, and polymerize the host actin cytoskeleton to promote ...

use-of-shigella-flexneri-to-study-autophagy-cytoskeleton-interactions

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

15.7K vistas.  Imperial College London.  Para contrarrestar la diseminación de patógenos, células huésped reorganizar su citoesqueleto de compartimentar bacterias e inducir la autofagia. Uso de la infección por Shigella de las células de cultivo de tejidos, de acogida y determinantes de patógenos subyacentes este proceso se identifican y se caracteriza. El uso de modelos de pez cebra de la infección por Shigella, el papel de las moléculas y mecanismos descubiertos son investigados 

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Use of an Optical Trap for Study of Host-Pathogen Interactions for Dynamic Live Cell Imaging

Dynamic live cell imaging allows direct visualization of real-time interactions between cells of the immune system1, 2; however, the lack of spatial and temporal control between the phagocytic cell and microbe has rendered focused observations into the initial interactions of host response to pathogens difficult. Historically, intercellular contact events such as phagocytosis3 have been imaged by mixing two cell types, and then continuously scanning the field-of-view to find serendipitous intercellular contacts at the appropriate stage of interaction. The stochastic nature of these events renders this process tedious, and it is difficult to observe early or fleeting events in cell-cell contact by this approach. This method requires finding cell pairs that are on the verge of contact, and observing them until they consummate their contact, or do not. To address these limitations, we use optical trapping as a non-invasive, non-destructive, but fast and effective method to position cells in culture.
Optical traps, or optical tweezers, are increasingly utilized in biological research to capture and physically manipulate cells and other micron-sized particles in three dimensions4. Radiation pressure was first observed and applied to optical tweezer systems in 19705, 6, and was first used to control biological specimens in 19877. Since then, optical tweezers have matured into a technology to probe a variety of biological phenomena8-13.
We describe a method14 that advances live cell imaging by integrating an optical trap with spinning disk confocal microscopy with temperature and humidity control to provide exquisite spatial and temporal control of pathogenic organisms in a physiological environment to facilitate interactions with host cells, as determined by the operator. Live, pathogenic organisms like Candida albicans and Aspergillus fumigatus, which can cause potentially lethal, invasive infections in immunocompromised individuals15, 16 (e.g. AIDS, chemotherapy, and organ transplantation patients), were optically trapped using non-destructive laser intensities and moved adjacent to macrophages, which can phagocytose the pathogen. High resolution, transmitted light and fluorescence-based movies established the ability to observe early events of phagocytosis in living cells. To demonstrate the broad applicability in immunology, primary T-cells were also trapped and manipulated to form synapses with anti-CD3 coated microspheres in vivo, and time-lapse imaging of synapse formation was also obtained. By providing a method to exert fine spatial control of live pathogens with respect to immune cells, cellular interactions can be captured by fluorescence microscopy with minimal perturbation to cells and can yield powerful insight into early responses of innate and adaptive immunity.

A method is described to individually select, manipulate, and image live pathogens using an optical trap coupled to a spinning disk microscope. The optical trap provides spatial and temporal control of organisms and places them adjacent to host cells. Fluorescence microscopy captures dynamic intercellular interactions with minimal perturbation to cells.

El uso de una trampa óptica para el estudio de interacciones huésped-patógeno de imágenes dinámicas de células vivas

Dynamic live cell imaging allows direct visualization of real-time interactions between cells of the immune system1, 2; however, the lack of spatial and ...

Investigación

Inmunología e Infección

Use of the EpiAirway Model for Characterizing Long-term Host-pathogen Interactions

Nontypeable Haemophilus influenzae (NTHi) are human-adapted Gram-negative bacteria that can cause recurrent and chronic infections of the respiratory mucosa 1; 2. To study the mechanisms by which these organisms survive on and inside respiratory tissues, a model in which successful long-term co-culture of bacteria and human cells can be performed is required. We use primary human respiratory epithelial tissues raised to the air-liquid interface, the EpiAirway model (MatTek, Ashland, MA). These are non-immortalized, well-differentiated, 3-dimensional tissues that contain tight junctions, ciliated and nonciliated cells, goblet cells that produce mucin, and retain the ability to produce cytokines in response to infection. 
This biologically relevant in vitro model of the human upper airway can be used in a number of ways; the overall goal of this method is to perform long-term co-culture of EpiAirway tissues with NTHi and quantitate cell-associated and internalized bacteria over time. As well, mucin production and the cytokine profile of the infected co-cultures can be determined. This approach improves upon existing methods in that many current protocols use submerged monolayer or Transwell cultures of human cells, which are not capable of supporting bacterial infections over extended periods3. For example, if an organism can replicate in the overlying media, this can result in unacceptable levels of cytotoxicity and loss of host cells, arresting the experiment. The EpiAirway model allows characterization of long-term host-pathogen interactions. Further, since the source for the EpiAirway is normal human tracheo-bronchial cells rather than an immortalized line, each is an excellent representation of actual human upper respiratory tract tissue, both in structure and in function4.
For this method, the EpiAirway tissues are weaned off of anti-microbial and anti-fungal compounds for 2 days prior to delivery, and all procedures are performed under antibiotic-free conditions. This necessitates special considerations, since both bacteria and primary human tissues are used in the same biosafety cabinet, and are co-cultured for extended periods.

This method allows characterization of extended bacterial co-culture with EpiAirways, primary human respiratory epithelial tissue grown at the air-liquid interface, a biologically relevant in vitro model. The approach can be used with any microbe that is amenable to long-term co-culture.

Utilización del modelo de EpiAirway para la caracterización de largo plazo Interacciones Huésped-Patógeno

Nontypeable Haemophilus influenzae  (NTHi) are human-adapted Gram-negative bacteria that can cause recurrent and chronic infections of the respiratory ...

Use of Galleria mellonella as a Model Organism to Study Legionella pneumophila Infection

Legionella pneumophila, the causative agent of a severe pneumonia named Legionnaires&#39; disease, is an important human pathogen that infects and replicates within alveolar macrophages. Its virulence depends on the Dot/Icm type IV secretion system (T4SS), which is essential to establish a replication permissive vacuole known as the Legionella containing vacuole (LCV). L. pneumophila infection can be modeled in mice however most mouse strains are not permissive, leading to the search for novel infection models. We have recently shown that the larvae of the wax moth Galleria mellonella are suitable for investigation of L. pneumophila infection. G. mellonella is increasingly used as an infection model for human pathogens and a good correlation exists between virulence of several bacterial species in the insect and in mammalian models. A key component of the larvae&#39;s immune defenses are hemocytes, professional phagocytes, which take up and destroy invaders. L. pneumophila is able to infect, form a LCV and replicate within these cells. Here we demonstrate protocols for analyzing L. pneumophila virulence in the G. mellonella model, including how to grow infectious L. pneumophila, pretreat the larvae with inhibitors, infect the larvae and how to extract infected cells for quantification and immunofluorescence microscopy. We also describe how to quantify bacterial replication and fitness in competition assays. These approaches allow for the rapid screening of mutants to determine factors important in L. pneumophila virulence, describing a new tool to aid our understanding of this complex pathogen.

Use of Galleria mellonella as a Model Organism to Study Legionella pneumophila Infection

The larva of the wax moth Galleria mellonella was recently established as an in vivo model to study Legionella pneumophila infection. Here, we demonstrate fundamental techniques to characterize the pathogenesis of Legionella in the larvae, including inoculation, measurement of bacterial virulence and replication as well as extraction and analysis of infected hemocytes.

El uso de<em&gt; Galleria mellonella</em&gt; Como organismo modelo para estudiar<em&gt; Legionella pneumophila</em&gt; Infección

Legionella pneumophila, the causative agent of a severe pneumonia named Legionnaires&#39; disease, is an important human pathogen that infects and ...

Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential to be used as drug therapies for HIV-1 infection. Post-integration inhibitors include ribozymes, short hairpin (sh) RNAs, small interfering (si) RNAs, U1 interference (U1i) RNAs and RNA aptamers. Many of these have been identified using transient co-transfection assays with an HIV-1 expression plasmid and some have advanced to clinical trials. In addition to measures of efficacy, small RNAs have been evaluated for their potential to affect the expression of human RNAs, alter cell growth and/or differentiation, and elicit innate immune responses. In the protocols described here, a set of transient transfection assays designed to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are described. We have used these assays to identify new ribozymes and optimize the format of shRNAs and siRNAs targeting HIV-1 RNA. The methods provide a quick set of assays that are useful for screening new anti-HIV-1 RNAs and could be adapted to screen other post-integration inhibitors of HIV-1 replication.

Methods to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps of the HIV-1 replication cycle are described. These methods are useful for screening new molecules and optimizing the format of existing ones.

Evaluación de la eficacia y la toxicidad de los ARN del VIH-1 Orientación de la producción para uso en terapia génica o de drogas

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential ...

Creation of a Dense Transposon Insertion Library Using Bacterial Conjugation in Enterobacterial Strains Such As Escherichia Coli or Shigella flexneri

Transposon mutagenesis is a method that allows gene disruption via the random genomic insertion of a piece of DNA called a transposon. The protocol below outlines a method for high efficiency transfer between bacterial strains of a plasmid harboring a transposon containing a kanamycin resistance marker. The plasmid-borne transposase is encoded by a variant tnp gene that inserts the transposon into the genome of the recipient strain with very low insertional bias. This method thus allows the creation of large mutant libraries in which transposons have been inserted into unique genomic positions in a recipient strain of either Escherichia coli or Shigella flexneri bacteria. By using bacterial conjugation, as opposed to other methods such as electroporation or chemical transformation, large libraries with hundreds of thousands of unique clones can be created. This yields high-density insertion libraries, with insertions occurring as frequently as every 4-6 base pairs in non-essential genes. This method is superior to other methods as it allows for an inexpensive, easy to use, and high efficiency method for the creation of a dense transposon insertion library. The transposon library can be used in downstream applications such as transposon sequencing (Tn-Seq), to infer genetic interaction networks, or more simply, in mutational (forward genetic) screens.

Creation of a Dense Transposon Insertion Library Using Bacterial Conjugation in Enterobacterial Strains Such As Escherichia Coli or Shigella flexneri

Presented here is a simple method for creating a high-density transposon insertion library in Escherichia coli or Shigella flexneri using bacterial conjugation. This protocol allows the creation of a collection of hundreds of thousands of unique mutants in bacteria by the random genomic insertion of a transposon.

Creación de un denso Transposon inserción biblioteca usando Conjugación bacteriana en cepas enterobacterianas tales como Escherichia Coli o Shigella flexneri

Transposon mutagenesis is a method that allows gene disruption via the random genomic insertion of a piece of DNA called a transposon. The protocol below ...

Imaging Ca2+ Responses During Shigella Infection of Epithelial Cells

Ca2+ is a ubiquitous ion involved in all known cellular processes. While global Ca2+ responses may affect cell fate, local variations in free Ca2+ cytosolic concentrations, linked to release from internal stores or an influx through plasma membrane channels, regulate cortical cell processes. Pathogens that adhere to or invade host cells trigger a reorganization of the actin cytoskeleton underlying the host plasma membrane, which likely affects both global and local Ca2+ signaling. Because these events may occur at low frequencies in a pseudo-stochastic manner over extended kinetics, the analysis of Ca2+ signals induced by pathogens raises major technical challenges that need to be addressed.
Here, we report protocols for the detection of global and local Ca2+ signals upon a Shigella infection of epithelial cells. In these protocols, artefacts linked to a prolonged exposure and photodamage associated with the excitation of Ca2+ fluorescent probes are troubleshot by stringently controlling the acquisition parameters over defined time periods during a Shigella invasion. Procedures are implemented to rigorously analyze the amplitude and frequency of global cytosolic Ca2+ signals during extended infection kinetics using the chemical probe Fluo-4.

Imaging Ca2+ Responses During Shigella Infection of Epithelial Cells

Here, we present protocols to visualize calcium (Ca2+) responses elicited by HeLa cells infected by Shigella. By optimizing the parameters of bacterial infection and imaging with Ca2+ fluorescent probes, atypical global and local Ca2+ signals induced by bacteria over a large range of infection kinetics are characterized.

Imágenes de Ca2 + respuestas durante la infección de Shigella de células epiteliales

Ca2+ is a ubiquitous ion involved in all known cellular processes. While global Ca2+ responses may affect cell fate, local variations in free Ca2+ ...

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella spp./Shigella spp. The gold standard method for the detection of Salmonella spp./Shigella spp. is direct culture but this is labor-intensive and time-consuming. Here, we describe a high-throughput platform for Salmonella spp./Shigella spp. screening, using real-time polymerase chain reaction (PCR) combined with guided culture. There are two major stages: real-time PCR and the guided culture. For the first stage (real-time PCR), we explain each step of the method: sample collection, pre-enrichment, DNA extraction and real-time PCR. If the real-time PCR result is positive, then the second stage (guided culture) is performed: selective culture, biochemical identification and serological characterization. We also illustrate representative results generated from it. The protocol described here would be a valuable platform for the rapid, specific, sensitive and high-throughput screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Salmonella spp./Shigella spp. are common pathogens attributed to diarrhea. Here, we describe a high-throughput platform for the screening of Salmonella spp./Shigella spp. using real-time PCR combined with guided culture.

Una plataforma de alto rendimiento para la detección de Salmonella spp. /Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...

Complementary Use of Microscopic Techniques and Fluorescence Reading in Studying Cryptococcus-Amoeba Interactions

To simulate Cryptococcus infection, amoeba, which is the natural predator of cryptococcal cells in the environment, can be used as a model for macrophages. This predatory organism, similar to macrophages, employs phagocytosis to kill internalized cells. With the aid of a confocal laser-scanning microscope, images depicting interactive moments between cryptococcal cells and amoeba are captured. The resolution power of the electron microscope also helps to reveal the ultrastructural detail of cryptococcal cells when trapped inside the amoeba food vacuole. Since phagocytosis is a continuous process, quantitative data is then integrated in the analysis to explain what happens at the timepoint when an image is captured. To be specific, relative fluorescence units are read in order to quantify the efficiency of amoeba in internalizing cryptococcal cells. For this purpose, cryptococcal cells are stained with a dye that makes them fluoresce once trapped inside the acidic environment of the food vacuole. When used together, information gathered through such techniques can provide critical information to help draw conclusions on the behavior and fate of cells when internalized by amoeba and, possibly, by other phagocytic cells.

Complementary Use of Microscopic Techniques and Fluorescence Reading in Studying Cryptococcus-Amoeba Interactions

This paper details a protocol for preparing a co-culture of cryptococcal cells and amoebae that is studied using still, fluorescent images and high-resolution transmission electron microscope images. Illustrated here is how quantitative data can complement such qualitative information.

Uso complementario de técnicas microscópicas y lectura de fluorescencia en el estudio de las interacciones Cryptococcus-Amoeba

To simulate Cryptococcus infection, amoeba, which is the natural predator of cryptococcal cells in the environment, can be used as a model for ...

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing activity by assessing the ability of antibodies in serum to bind to bacteria and activate complement. This complement activation results in the lysis and killing of the target bacteria. These assays are valuable because they go beyond quantifying antibody production to elucidate the biological functions that these antibodies have, allowing researchers to study the role that antibodies may play in preventing infection. SBAs have been used to study immune responses for many human pathogens, but there is no widely accepted methodology for Shigella at present. Historically, SBAs have been very labor-intensive, requiring many time-consuming steps to accurately quantify surviving bacteria. This protocol describes a simple, robust, and high-throughput assay that measures functional antibodies specific for Shigella in serum in vitro. The method described here offers many advantages over traditional SBAs, including the use of frozen bacterial stocks, 96 well assay plates, a micro-culture system, and automated colony-counting. All of these modifications make this assay less labor-intensive and more high-throughput. This protocol is simpler and faster to perform than traditional SBAs while still using simple technologies and readily available reagents. The protocol has been successfully applied in multiple independent laboratories and the assay is robust and reproducible. The assay can be used to assess immune responses in pre-clinical as well as clinical studies. Quantifying shigellacidal antibody titers both before and after antigen exposure (either by immunization or infection) allows for a broader understanding of how functional antibody responses are generated and their contribution to protective immunity. The development of this standardized, well-characterized assay may greatly facilitate Shigella vaccine design.

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

Here we present a protocol to measure Shigellacidal activity of antibodies in serum. Serum is mixed with bacteria and exogenous complement, incubated, and the reaction mixture is plated on agar plates. Viable bacteria form colonies which are counted, using an automated colony enumerator, and used to determine the bactericidal titer.

Un alto rendimiento Shigella-ensayo bactericida específico

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing ...

Human Colonoid Monolayers to Study Interactions Between Pathogens, Commensals, and Host Intestinal Epithelium

Human 3-dimensional (3D) enteroid or colonoid cultures derived from crypt base stem cells are currently the most advanced ex vivo model of the intestinal epithelium. Due to their closed structures and significant supporting extracellular matrix, 3D cultures are not ideal for host-pathogen studies. Enteroids or colonoids can be grown as epithelial monolayers on permeable tissue culture membranes to allow manipulation of both luminal and basolateral cell surfaces and accompanying fluids. This enhanced luminal surface accessibility facilitates modeling bacterial-host epithelial interactions such as the mucus-degrading ability of enterohemorrhagic E. coli (EHEC) on colonic epithelium. A method for 3D culture fragmentation, monolayer seeding, and transepithelial electrical resistance (TER) measurements to monitor the progress towards confluency and differentiation are described. Colonoid monolayer differentiation yields secreted mucus that can be studied by the immunofluorescence or immunoblotting techniques. More generally, enteroid or colonoid monolayers enable a physiologically-relevant platform to evaluate specific cell populations that may be targeted by pathogenic or commensal microbiota.

Here, we present a protocol to culture human enteroid or colonoid monolayers that have intact barrier function to study host epithelial-microbiota interactions at the cellular and biochemical level.

Monocapas de Colonoid humano para estudiar las interacciones entre patógenos, comensales y epitelio Intestinal Host

Human 3-dimensional (3D) enteroid or colonoid cultures derived from crypt base stem cells are currently the most advanced ex vivo model of the intestinal ...