La investigación en el laboratorio fue apoyado por becas de la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG HA 3125/3-2, DFG HA 3125/4-2) y el Ministerio Federal de Educación e Investigación (BMBF) Genómica Médica Infección (FKZ 0315828A) a SH.

Los experimentos de infección de los animales que aquí se describen deben realizarse en estricta conformidad con los planos local e internacional (por ejemplo, la Ley de Salud de la Federación Europea de Asociaciones de Ciencia Animal de Laboratorio (FELASA)) directrices y reglamentos para el uso de animales vertebrados. Los experimentos tienen que ser aprobados por el comité de ética local y Comité de Cuidado de Animales institucional. Todos los experimentos con S. pneumoniae en el laboratorio o las infecciones en los animales se llevan a cabo en una Clase II Bioseguridad Gabinete. 1. Preparación de la Bolsa de Infecciosas de bioluminiscente Pneumocococi <ol><li> Preparar cultivos madre neumocócicas en caldo Todd-Hewitt suplementado con 1% (w / v) de extracto de levadura y una concentración final de 20% de glicerol para el mantenimiento a 80 º C. </li><li> Placa de una pequeña cantidad de la cultura de stock neumocócica congelado en una placa de agar sangre e incubar las bacterias durante 10 horas a 37 ° C en 5% de CO 2. Tplaca de agar sangre que contiene los antibióticos apropiados, tales como kanamicina (150 mg / ml) para la inserción del transposón de la casete del gen de luxABCDE en el genoma. </li><li> Sub-cultivar una colonia fresca en una nueva placa de agar sangre para un máximo de 10 horas. </li><li> Inocular THY medio suplementado con 10% (v / v) inactivado por calor (30 min a 56 ° C) de suero bovino fetal (FBS) con neumococos y empezar el cultivo a una DO 600 de 0,05-0,07. </li><li> Incubar neumococos sin agitación a 37 ° C y 5% de CO 2 hasta que el cultivo alcanzó una DO 600 de 0,35 a 0,40. El crecimiento dura entre 3-4 horas. </li><li> Neumococos cosecha por centrifugación a 3750 xg durante 10 min y resuspender neumococos bioluminiscente en solución salina tamponada con fosfato de pH 7,4 (PBS) suplementado con 0,5% de FBS. </li><li> Ajuste el inóculo a la concentración deseada en PBS/10% de FBS. La dosis de infección depende de la cepa de neumococo utilizado y los antecedentes genéticos del micrófonoe. Para infectar outbred ratones CD-1 por vía intranasal con S. pneumoniae D39 lux la dosis de infección se debe ajustar a 1 x 10 7 UFC en una suspensión de 20 l suplementado con 90 unidades de hialuronidasa. No agite o vórtice neumococos, ya que esto dará lugar a la autolisis. </li><li> Comprobar la concentración de inóculo mediante siembra de diluciones seriadas 10 veces en agar sangre y el recuento de las colonias después del crecimiento durante la noche a 37 ° C en 5% de CO 2. </li><li> Verificar la bioluminiscencia del inóculo neumocócica mediante la medición de la bioluminiscencia usando un sistema de imagen óptica. </li></ol> 2. Intranasal y la infección intraperitoneal de ratones con neumococos bioluminiscente <ol><li> Utilice ratones hembra consanguínea en la edad de 7-10 semanas para la neumonía aguda y el modelo de sepsis. El peso de estos ratones debe estar entre 20-30 g. </li><li> Anestesie ratones por inyección intraperitoneal de ketamina y xilazina. Prepare una mezcla de 1,0 mgketamina y 0,1 mg de xilazina en 100 l estéril al 0,9% (w / v) de cloruro sódico para ratones con un peso corporal de 20 g. Esto es consistente con una dosis de 50 mg / kg de peso corporal para la ketamina y 5 mg / kg de peso corporal para xilazina. Para ser exactos, pesar los ratones antes de la inyección de los anestésicos. </li><li> Se inyecta la mezcla en la cavidad intraperitoneal y colocar los animales dentro de la jaula hasta que los anestésicos actúan y los animales son narcotizados. La respiración de los ratones será muy lento y regular. Los ratones tienen que ser totalmente narcotizado, de manera que la inoculación intranasal y la inhalación de la suspensión bacteriana no darán lugar a estornudos y, por tanto, la pérdida de inóculo. Esto se puede evaluar por pellizcar el ratón en el extremo de su cola; un ratón totalmente narcotizado carecerá de la capacidad de respuesta. </li><li> Recoger suavemente hasta un ratón narcotizado y mantenga pulsado el ratón entre los dedos y el pulgar, con la nariz en posición vertical (Figura 1). </li><li> Utilice una pipeta con largas puntas estrechas (Gel LoaderTips) y colocar los neumococos bioluminiscente en múltiples pequeñas gotas en las fosas nasales (10 l / ventana de la nariz) del ratón 26-29. El ratón involuntariamente inhalar la bacteria. Mantenga el ratón 1-2 min en posición vertical y observe si el ratón estornuda o mantiene el inóculo. </li><li> Infect 7-10 semanas de edad ratones CD-1 por vía intranasal con una dosis de infección de 1 x 10 7 o 7,5 x 10 7 neumococos de D39 cepa y TIGR4, respectivamente, para controlar la infección en tiempo real. El límite de detección para el sistema sin ninguna absorción por el tejido del huésped es de aproximadamente 1 x 10 6 bacterias bioluminiscentes. </li><li> Infectar ratones por vía intraperitoneal (IP) para evaluar y bioimagen virulencia del neumococo en un modelo de infección sepsis ratón. Utilice 5 x 10 3 UFC en 100 l de D39 tensión y 1 x 10 4 de cepa TIGR4. Los ratones no son anestesiados utilizando la ruta IP. </li><li> Se inoculan los ratones de control con PBS. <img alt="Figura 1" fo:content-width = &quot;5in&quot; fo: src = &quot;/ files/ftp_upload/51174/51174fig1highres.jpg&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/51174/51174fig1.jpg&quot; width = &quot;500px&quot; /&gt; Figura 1. Infección intranasal de ratones CD-1 con S. pneumoniae. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51174/51174fig1highres.jpg" target="_blank">Haz clic aquí para ver la imagen más grande</a> . </li></ol> 3. Visualizar neumocócica Difusión en el Pulmón y la Sangre Usando el sistema de imágenes Difusión de imagen de neumococos después de la infección intranasal de ratones CD1 hembras consanguíneos en tiempo real, utilizando un sistema de imagen en vivo. <ol><li> Encienda el sistema de imagen e iniciar el software de análisis de imágenes se encuentra en el equipo preconfigurar. </li><li> El sistema de imágenes inicializa automáticamente y la cámara CCD se enfría termoeléctricamente a 90 ° C antes de ser activo. </li><li> Los ajustes y hurgar en la basura dependen del número de ratones medidosimultáneamente y en la fuerza de la señal bioluminiscente. El campo de visión (FOV) para supervisar la bioluminiscencia de los animales es variable y la ampliación oscila entre un campo de visión de 22,5 cm para medir cinco ratones, y un campo de visión de 3,9 cm para medir un solo ratón o partes del animal como el pecho o la cabeza. </li><li> Utilizar habitualmente un tiempo de exposición de 1 min, un grado medio de hurgar en la basura, y un campo de visión de 22,5 cm (conjunto D). En primer lugar, seleccionar el modo de imagen luminiscente y luego configurar los parámetros de la imagen. </li><li> La emisión de la señal puede depender de la cepa bacteriana y cepa de ratón utilizado, y el pigmento del ratón. Afeitar el pecho de los ratones cuando se utiliza por ejemplo, ratones C57BL / 6, que puede ser ventajoso cuando obtención de imágenes del desarrollo de neumonía en estos ratones. </li><li> Imagen ratones infectados a intervalos de tiempo preseleccionado. Mida la bioluminiscencia de los ratones en el modelo de neumonía aguda en intervalos de tiempo de máximo 8-12 hr. Vigile también el bienestar de los ratones infectados por observing su apariencia, comportamiento, y la determinación de la pérdida de peso. </li><li> Anestesie ratones en la cámara de narcóticos del sistema de anestesia de los equipos de formación de imágenes antes de las mediciones en la cámara. Inicie la inhalación de una mezcla de isoflurano y oxígeno y esperar hasta que los ratones respirar lenta y regularmente. </li><li> Coloque los animales anestesiados en la cámara de formación de imágenes del sistema y mantener los ratones en posición supina. La cámara CCD en la parte superior de la cámara A continuación, la imagen del tracto respiratorio murino. </li><li> Coloca los animales con su nariz en los tubos para permitir la inhalación de los anestésicos. </li><li> El isoflurano se permite la entrada en la cámara de formación de imágenes a través de una tubería de gas para mantener la anestesia. </li><li> Para activar la cámara CCD en la parte superior de la cámara y empezar a imágenes ópticas bioluminiscente, pulse &quot;Acquire&quot; en el software de imágenes. Inmediatamente una fotografía de los ratones en la cámara cerrada aparece en la pantalla. Después de un minuto de<html> la medición una superposición de los datos de la bioluminiscencia y la foto se muestra. </li><li> Detener la anestesia después de que aparezca la superposición de imágenes en la ventana del programa y poner a los ratones de nuevo en sus jaulas. </li><li> Los ratones son monitoreados para la recuperación. <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51174/51174fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51174/51174fig2.jpg" width="500px" /> Figura 2. Anestesia y seguimiento de los ratones infectados con neumococos bioluminiscente usando la anestesia IVIS y sistema de IVIS Spectrum, respectivamente. A) El sistema de IVIS Espectro de formación de imágenes. B) El sistema de anestesia de IVIS con la cámara de incubación. C) ratones anestesiados en la cámara de incubación . D) Ratones situado dentro de la cámara de IVIS Spectrum Imaging con la nariz inhalando el anestésico._blank &quot;&gt; Haga clic aquí para ver la imagen más grande. </li></ol> 4. Cuantificación y Evaluación de la bioluminiscencia de los ratones infectados con S. bioluminiscente pneumoniae <ol><li> Determinar las intensidades de bioluminiscencia de los ratones o de una región seleccionada de los ratones mediante la cuantificación de la emisión de fotones total de (fotones / seg) usando el software de análisis de imagen. </li><li> Utilice los valores de la emisión de fotones que se proporcionan en una hoja de datos de Excel para preparar un gráfico. Dado que la variación de los datos es a menudo alta dentro de los ratones agrupados, generar un gráfico cuadro de bigote para mostrar las diferencias en los ratones infectados con las diferentes cepas de neumococo. </li><li> Proporcionar los fotones por ratones o como alternativa los resultados como el promedio de radiación (fotones / s / cm 2 / SR) de un área seleccionada. </li><li> Los datos de medición de ROI (región de interés) en el modo de fotones pueden ser cuantitativamente diferente comparado a través de los sistemas de imágenes in vivo con diferentes vinoajustes ra, ya que las medidas en unidades de luminosidad toman en cuenta automáticamente los ajustes de la cámara (por ejemplo, tiempo de integración, hurgar en la basura, f / parada, y el campo de visión). </li></ol>

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R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+characterization+of+pneumococcal+isolates+from+pets+and+laboratory+animals.">Molecular characterization of pneumococcal isolates from pets and laboratory animals.</a> PLoS One. 4, (2009).</li><li>Brehm, , et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence+of+the+adenine+methylase+gene+of+the+Streptococcus+faecalis+plasmid+pAM+beta+1.">Sequence of the adenine methylase gene of the Streptococcus faecalis plasmid pAM beta 1.</a> Nucleic Acids Res. 15, 3177 (1987).</li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

<html> Todos los experimentos realizados en animales tienen que ser aprobados por las autoridades locales y las comisiones de ética. En experimentos in vivo de infección de la carga bacteriana en los diversos nichos de acogida de animales infectados tiene que ser determinada en diversos puntos temporales después de la infección. Bajo estas condiciones experimentales los animales tienen que ser sacrificados antes del aislamiento de las bacterias de la sangre, nasofaringe, lavado bronchoalvelar, o órganos tal...

Infecciones de las vías respiratorias causadas por virus o bacterias siguen siendo uno de los problemas o adquiridas en la comunidad clínicas más comunes en todo el mundo que causan aproximadamente un tercio de todas las muertes en todo el mundo. Las especies bacterianas clave son Haemophilus influenzae y Streptococcus pneumoniae 2. Sin embargo, estas especies bacterianas son normalmente constituyentes comunes de la flora del tracto respiratorio naturales. Así carro bacteriana es también de cierto riesgo para la enfermedad invasiva y dependiendo del estado inmunitario o predisposiciones de los individuos. La colonización asintomática se dispara a las infecciones invasivas. Streptococcus pneumoniae es el patógeno principal de neumonía adquirida en la comunidad (NAC) y una de las causas más comunes de la bacteriemia en los seres humanos. En individuos sanos S. pneumoniae (neumococo) son a menudo asintomáticos colonizadores e inofensivos del tracto respiratorio superior, donde se enfrentan a las bacterias patógenasde la flora residente, sino también con agentes patógenos como Haemophilus spp. o Staphylococcus aureus y la primera línea del sistema de defensa inmunológico humano. Las tasas de transporte son más altos en los niños pequeños (37%) e incluso superior en los centros de atención de día de hacinamiento (58%) 3-5. La población más joven y el anciano, que recibe el neumococo a través de la transmisión por aerosol de los transportistas y las secreciones nasofaríngeas 6, pertenecen a los grupos de alto riesgo y la vacunación con una de las vacunas neumocócicas conjugadas (PCV10 o PCV13 en niños y 23-valente polisacárida PPSV23 en adultos) se recomienda en los Estados Unidos (EE.UU.) y muchos países europeos 4. El PPSV23 cubre los serotipos responsables de ~ 90% de las enfermedades neumocócicas bacteriemia en los EE.UU. y Europa, la prevención de enfermedades neumocócicas así eficientemente invasiva (ENI) en los adultos, mientras que los PCVs cubren los serotipos más prevalentes en los niños. En consecuencia, la ENI por tipos vacunales (VT) se reduserotipos no vacunales ced pero que muestran un alto potencial de virulencia y resistencia a los antibióticos se han convertido 4,7-12. La nasofaringe como reservorio es el punto de partida de los neumococos a extenderse a los senos paranasales o el oído medio que inician infecciones locales dañinos. Más importante aún, los neumococos difundir directamente a través de la vía aérea a los bronquios y del pulmón que resulta en peligro la vida de la PAC 4,13. Las infecciones pulmonares son acompañados a menudo con el tejido y destrucción de la barrera, lo que permite al patógeno a extenderse a la sangre y causando IPD. Las incidencias de la PAC y la ENI son más altos en personas inmunodeprimidas o en los extremos de 4,13 años. Las circunstancias responsables de la conversión de un comensal a un patógeno con alta virulencia son aún objeto de debate. Sin embargo, además de los cambios en la susceptibilidad del huésped y la adaptación evolutiva acompañado con una mayor virulencia y el aumento de la resistencia a los antibióticos se han sugerido a tener un impacto crucial en el PNEinfecciones umococcal 14-16. El patógeno está dotado de una multiplicidad de adhesinas que median el contacto íntimo de la mucosa células epiteliales. Después de superar la mucosidad de las vías respiratorias, la adhesión de neumococo a las células huésped se facilita a través de interacciones directas de adhesinas de superficie expuesta con los receptores celulares y mediante la explotación de componentes de la matriz extracelular o proteínas séricas como moléculas puente 4,17,18. Patógenos Como versátiles neumococos también están equipados con los factores involucrados en la evasión de los mecanismos de defensa del huésped inmune. Además, tienen la capacidad de adaptarse a diversos ambientes huésped, tales como el pulmón, la sangre y el líquido cefalorraquídeo (LCR), respectivamente 5,17,19,20. El impacto de los factores bacterianos en las respuestas de la patogénesis y de acogida inflamatoria se investiga en modelos animales experimentales de la neumonía, bacteriemia o meningitis 21-25. A pesar de ser un patógeno humano, estos modelos son nosotrosll establecida para descifrar tropismo tisular neumocócica, los mecanismos de virulencia, o protectividad de candidatas a vacunas neumocócicas. El fondo genético de cepas puras ratón determina la susceptibilidad a los neumococos. Ratones BALB / c por vía intranasal infectados con neumococos se encontró que eran resistentes, mientras que CBA / Ca y SJL ratones eran más susceptibles contra infecciones neumocócicas 22. Esto implica que, de forma similar a los seres humanos, los antecedentes genéticos y los mecanismos de defensa del huésped determinar el resultado de la infección. Por lo tanto, se necesitan más esfuerzos para desentrañar loci de resistencia en el genoma de los ratones menos susceptibles a las infecciones neumocócicas. Los resultados han dado lugar a cambios en los protocolos de virulencia en vivo. En lugar de los ratones BALB / c endogámicos de uso frecuente en el pasado, las cepas de ratón outbred CD-1/MF1 altamente susceptibles se utilizan hoy en día a menudo para estudiar el efecto de la virulencia o la aptitud neumocócica pérdida de la función de factores de 26-28. Por otra parte, la disponibilidadde neumococos bioluminiscente y técnicas de formación de imágenes ópticas permite que el tiempo real bioimagen bioluminiscencia de las infecciones. En neumococos el casete del gen de luxABCDE optimizado (plásmido Paul-Un Tn 4001 luxABCDE Km R) ha sido insertado en un único sitio de integración del cromosoma por mutagénesis de transposones. Neumococos bioluminiscente se han empleado para evaluar la atenuación de los mutantes deficientes en neumocócicas de virulencia o aptitud factores y su translocación desde un sitio anatómico a otro 26,28-31. Aquí les ofrecemos un protocolo para la bioimagen de infecciones neumocócicas en una neumonía murina o modelo de sepsis. La amplificación y la difusión de neumococos bioluminiscente en ratones por vía intranasal o por vía intraperitoneal infectados pueden ser fácilmente monitorizados en el tiempo utilizando un sistema de imagen óptica y el mismo animal en diferentes puntos de tiempo.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="985">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Todd Hewitt broth</td>
			<td style="width:280px;">Carl Roth, Karlsruhe, Germany</td>
			<td style="width:129px;">X936.1</td>
			<td style="width:280px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Yeast extract</td>
			<td style="width:280px;">Carl Roth, Karlsruhe, Germany</td>
			<td style="width:129px;">2363.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Blood agar plates</td>
			<td style="width:280px;">Oxoid, Wesel, Germany</td>
			<td style="width:129px;">PB5039A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Kanamycin</td>
			<td style="width:280px;">Carl Roth, Karlsruhe, Germany</td>
			<td style="width:129px;">T832.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Erythromycin</td>
			<td style="width:280px;">Sigma-Aldrich,Taufkirchen, Germany</td>
			<td style="width:129px;">E6376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td style="width:280px;">PAA Laboratories, Coelbe, Germany</td>
			<td style="width:129px;">A11-151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">CD-1 mice, female</td>
			<td style="width:280px;">Charles River, Sulzfeld, Germany</td>
			<td style="width:129px;">CD1SIFE06W08W</td>
			<td>female CD-1 mice, six to eight weeks old</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ketamin 500mg, Curamed injection solution</td>
			<td>Schwabe-Curamed, Karlsruhe, Germany</td>
			<td style="width:129px;"> </td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Rompun 2%, injection solution</td>
			<td>Bayer Animal Health, Monheim, Germany</td>
			<td style="width:129px;"> </td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BD Plastipak 1 ml syringes</td>
			<td>Becton Dickinson, Heidelberg, Germany</td>
			<td style="width:129px;">300015</td>
			<td>sterile Luer-Lok&#8482; syringes with needle</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Gel Loader Tips</td>
			<td style="width:280px;">peqlab</td>
			<td style="width:129px;">81-13790</td>
			<td>M&#181;ltiFlex&#8482; Tips</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Hyaluronidase</td>
			<td style="width:280px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:129px;">H3884-100mg</td>
			<td>Hyaluronidase Type IV-S from Bovine test</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Oxygen</td>
			<td style="width:280px;">Air Liquide, D&#252;sseldorf, Germany</td>
			<td style="width:129px;">M1001L50R2A001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Isofluoran</td>
			<td style="width:280px;">Baxter, Unterschlei&#223;heim, Germany</td>
			<td style="width:129px;"> </td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">pGEM-T Easy</td>
			<td style="width:280px;">Promega, Mannheim, Germany</td>
			<td style="width:129px;"> </td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Oligonucleotides </td>
			<td style="width:280px;">Eurofins MWG, Ebersberg, Germany</td>
			<td style="width:129px;"> </td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Qiaprep Spin Midiprep Kit </td>
			<td style="width:280px;">Qiagen, Hilden, Germany</td>
			<td style="width:129px;">27104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:296px;">PCR DNA purification kit</td>
			<td style="width:280px;">Qiagen, Hilden, Germany</td>
			<td style="width:129px;">28106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:296px;">Equipment</td>
			<td style="width:280px;"> </td>
			<td style="width:129px;"> </td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:296px;">Living Image 4.1 software</td>
			<td style="width:280px;">Caliper Life Sciences/PerkinElmer, Rodgau, Germany</td>
			<td style="width:129px;"> </td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:296px;">XGI-8 Gas Anesthesia System</td>
			<td style="width:280px;">Caliper Life Sciences/PerkinElmer, Rodgau, Germany</td>
			<td style="width:129px;"> </td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:296px;">IVIS Spectrum Imaging System </td>
			<td style="width:280px;">Caliper Life Sciences/PerkinElmer, Rodgau, Germany</td>
			<td style="width:129px;"> </td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Biophotometer</td>
			<td style="width:280px;">Eppendorf AG, Hamburg, Germany</td>
			<td style="width:129px;"> </td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

following in real time the impact of pneumococcal virulence factors in an acute mouse pneumonia model using bioluminescent bacteria

La neumonía es una de los principales problemas de salud en países en desarrollo e industrializados y se asocia con una considerable morbilidad y mortalidad. A pesar de los avances en el conocimiento de esta enfermedad, la disponibilidad de las unidades de cuidados intensivos (UCI), y el uso de potentes agentes antimicrobianos y vacunas eficaces, las tasas de mortalidad siguen siendo elevados 1. Streptococcus pneumoniae es el patógeno principal de neumonía adquirida en la comunidad (NAC) y una de las causas más comunes de la bacteriemia en seres humanos. Este patógeno está equipado con un arsenal de adhesinas de superficie expuesta y factores de virulencia que contribuyen a la neumonía y la enfermedad neumocócica invasiva (ENI). La evaluación de la función in vivo de los factores de aptitud o de virulencia bacteriana es de suma importancia para desentrañar S. mecanismos de patogenicidad pneumoniae. Los modelos murinos de neumonía, bacteremia y meningitis se utilizan para determinar el impacto de los factores de neumococo en difeFerent etapas de la infección. Aquí se describe un protocolo para controlar la difusión de neumococo en tiempo real en los ratones después intranasal o infecciones intraperitoneales con bacterias bioluminiscentes. Los resultados muestran la multiplicación y difusión de neumococos en el tracto respiratorio inferior y la sangre, que puede ser visualizado y evaluado utilizando un sistema de imagen y el software de análisis adjunto.

La adquisición y la absorción de la metionina es de importancia central para los neumococos a mantener la forma física en su nicho de acogida 32,33. La metionina ABC transportador de lipoproteína se codifica en D39 por el SPD _ 0151 genes (TIGR4: sp_0149) y nombró MetQ 32. Los neumococos producen más enzimas de la biosíntesis de la metionina (D39: Spd_0510 - Spd_0511; TIGR4 Sp_0585 - Sp_0586, mete y metF). La falta de metionina en un medio químicamente definido af...

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Following in Real Time the Impact of Pneumococcal Virulence Factors in an Acute Mouse Pneumonia Model Using Bioluminescent Bacteria

Streptococcus pneumoniae es el patógeno que lleva causando neumonía adquirida en la comunidad grave y responsable de más de 2 millones de muertes en todo el mundo. El impacto de los factores bacterianos implicados en la aptitud o la virulencia se puede controlar en tiempo real en una neumonía o bacteriemia modelo agudo ratón utilizando bacterias bioluminiscentes.

Siguiendo en tiempo real el impacto de factores de virulencia neumocócica en un ratón de neumonía aguda modelo utilizando bacterias bioluminiscentes

Pneumonia is one of the major health care problems in developing and industrialized countries and is associated with considerable morbidity and mortality. ...

following-real-time-impact-pneumococcal-virulence-factors-an-acute

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

14.9K vistas.  University of Greifswald.  Streptococcus pneumoniae es el patógeno que lleva causando neumonía adquirida en la comunidad grave y responsable de más de 2 millones de muertes en todo el mundo. El impacto de los factores bacterianos implicados en la aptitud o la virulencia se puede controlar en tiempo real en una neumonía o bacteriemia modelo agudo ratón utilizando bacterias bioluminiscentes. 

Video: Following in Real Time the Impact of Pneumococcal Virulence Factors in an Acute Mouse Pneumonia Model Using Bioluminescent Bacteria

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of infection with influenza virus alone. Instead, most individuals are thought to have succumbed to a secondary bacterial infection, predominately caused by the bacterium Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus). The synergistic relationship between infections caused by influenza virus and the pneumococcus has subsequently been observed during the 1957 Asian influenza virus pandemic, as well as during seasonal outbreaks of the virus (reviewed in 1, 2). Here, we describe a protocol used to investigate the mechanism(s) that may be involved in increased morbidity as a result of concurrent influenza A virus and S. pneumoniae infection. We have developed an infant murine model to reliably and reproducibly demonstrate the effects of influenza virus infection of mice colonised with S. pneumoniae. Using this protocol, we have provided the first insight into the kinetics of pneumococcal transmission between co-housed, neonatal mice using in vivo imaging 3.

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

A concurrent infection with influenza A virus is one of the factors implicated in the induction of invasive pneumococcal disease during asymptomatic Streptococcus pneumoniae carriage. Here we describe a mixed infection method using infant mice to investigate the synergism between these two respiratory pathogens.

Utilizando imágenes bioluminiscentes encargado de investigar la sinergia entre Streptococcus pneumoniae Y el Virus de la Influenza en ratones lactantes

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of ...

Investigación

Inmunología e Infección

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

Adherence of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) to the epithelial lining of the nasopharynx can result in colonization and is considered a prerequisite for pneumococcal infections such as pneumonia and otitis media. In vitro adherence assays can be used to study the attachment of pneumococci to epithelial cell monolayers and to investigate potential interventions, such as the use of probiotics, to inhibit pneumococcal&#160;colonization.&#160;The protocol described here is used to investigate the effects of the probiotic Streptococcus salivarius on the adherence of pneumococci to the human epithelial cell line CCL-23 (sometimes referred to as HEp-2 cells). The assay involves three main steps: 1) preparation of epithelial and bacterial cells, 2) addition of bacteria to epithelial cell monolayers, and 3) detection of adherent pneumococci by viable counts (serial dilution and plating) or quantitative real-time PCR (qPCR). This technique is relatively straightforward and does not require specialized equipment other than a tissue culture setup. The assay can be used to test other probiotic species and/or potential inhibitors of pneumococcal colonization and can be easily modified to address other scientific questions regarding pneumococcal adherence and invasion.

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

In vitro adherence assays can be used to study the attachment of Streptococcus pneumoniae to epithelial cell monolayers and to investigate potential interventions such as the use of probiotics for inhibiting pneumococcal colonization.

La investigación de los efectos de los probióticos en antineumocócica Colonización El uso de un<em&gt; In Vitro</em&gt; Ensayo de adherencia

Adherence of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) to the epithelial lining of the nasopharynx can result in colonization and is considered a ...

Capsular Serotyping of Streptococcus pneumoniae Using the Quellung Reaction

There are over 90 different capsular serotypes of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus). As well as being a tool for understanding pneumococcal epidemiology, capsular serotyping can provide useful information for vaccine efficacy and impact studies.&#160;The Quellung reaction is the gold standard method for pneumococcal capsular serotyping. The method involves testing a pneumococcal cell suspension with pooled and specific antisera directed against the capsular polysaccharide. The antigen-antibody reactions are observed microscopically. The protocol has three main steps: 1) preparation of a bacterial cell suspension, 2) mixing of cells and antisera on a glass slide, and 3) reading the Quellung reaction using a microscope. The Quellung reaction is reasonably simple to perform and can be applied wherever a suitable microscope and antisera are available.

Capsular Serotyping of Streptococcus pneumoniae Using the Quellung Reaction

The Quellung reaction is the gold standard technique for serotyping Streptococcus pneumoniae. This technique utilizes a microscope and specific pneumococcal antisera and is commonly used in reference and research laboratories worldwide.

Capsular serotipificación de<em&gt; Streptococcus pneumoniae</em&gt; Uso de la Reacción Quellung

There are over 90 different capsular serotypes of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus). As well as being a tool for understanding pneumococcal ...

An Ex vivo Model of an Oligodendrocyte-directed T-Cell Attack in Acute Brain Slices

Death of oligodendrocytes accompanied by destruction of neurons and axons are typical histopathological findings in cortical and subcortical grey matter lesions in inflammatory demyelinating disorders like multiple sclerosis (MS). In these disorders, mainly CD8+ T-cells of putative specificity for myelin- and oligodendrocyte-related antigens are found, so that neuronal apoptosis in grey matter lesions may be a collateral effect of these cells. Different types of animal models are established to study the underlying mechanisms of the mentioned pathophysiological processes. However, although they mimic some aspects of MS, it is impossible to dissect the exact mechanism and time course of &#8216;&#8216;collateral&#8217;&#8217; neuronal cell death. To address this course, here we show a protocol to study the mechanisms and time response of neuronal damage following an oligodendrocyte-directed CD8+ T cell attack. To target only the myelin sheath and the oligodendrocytes, in vitro activated oligodendrocyte-specific CD8+ T-cells are transferred into acutely isolated brain slices. After a defined incubation period, myelin and neuronal damage can be analysed in different regions of interest. Potential applications and limitations of this model will be discussed.

An Ex vivo Model of an Oligodendrocyte-directed T-Cell Attack in Acute Brain Slices

To address mechanisms of demyelination and neuronal apoptosis in cortical lesions of inflammatory demyelinating disorders, different animal models are used. We here describe an ex vivo approach by using oligodendrocyte-specific CD8+ T-cells on brain slices, resulting in oligodendroglial and neuronal death. Potential applications and limitations of the model are discussed.

Una<em&gt; Ex vivo</em&gt; Modelo de un ataque de células T Oligodendrocyte dirigida en Rebanadas cerebral agudo

Death of oligodendrocytes accompanied by destruction of neurons and axons are typical histopathological findings in cortical and subcortical grey matter ...

Applying an Inducible Expression System to Study Interference of Bacterial Virulence Factors with Intracellular Signaling

The technique presented here allows one to analyze at which step a target protein, or alternatively a small molecule, interacts with the components of a signaling pathway. The method is based, on the one hand, on the inducible expression of a specific protein to initiate a signaling event at a defined and predetermined step in the selected signaling cascade. Concomitant expression, on the other hand, of the gene of interest then allows the investigator to evaluate if the activity of the expressed target protein is located upstream or downstream of the initiated signaling event, depending on the readout of the signaling pathway that is obtained. Here, the apoptotic cascade was selected as a defined signaling pathway to demonstrate protocol functionality. Pathogenic bacteria, such as Coxiella burnetii, translocate effector proteins that interfere with host cell death induction in the host cell to ensure bacterial survival in the cell and to promote their dissemination in the organism. The C. burnetii effector protein CaeB effectively inhibits host cell death after induction of apoptosis with UV-light or with staurosporine. To narrow down at which step CaeB interferes with the propagation of the apoptotic signal, selected proteins with well-characterized pro-apoptotic activity were expressed transiently in a doxycycline-inducible manner. If CaeB acts upstream of these proteins, apoptosis will proceed unhindered. If CaeB acts downstream, cell death will be inhibited. The test proteins selected were Bax, which acts at the level of the mitochondria, and caspase 3, which is the major executioner protease. CaeB interferes with cell death induced by Bax expression, but not by caspase 3 expression. CaeB, thus, interacts with the apoptotic cascade between these two proteins.

The method described here is used to induce the apoptotic signaling cascade at defined steps in order to dissect the activity of an anti-apoptotic bacterial effector protein. This method can also be used for inducible expression of pro-apoptotic or toxic proteins, or for dissecting interference with other signaling pathways.

La aplicación de un sistema de expresión inducible para el Estudio de la interferencia de los factores de virulencia bacteriana con Señalización Intracelular

The technique presented here allows one to analyze at which step a target protein, or alternatively a small molecule, interacts with the components of a ...

Evaluating Virulence and Pathogenesis of Aeromonas Infection in a Caenorhabditis elegans Model

The human pathogen Aeromonas has been clinically shown to cause gastroenteritis, wound infections, septicemia, and urinary tract infections. Most human diseases have been reported to be associated with four species of bacteria: Aeromonas dhakensis, Aeromonas hydrophila, Aeromonas veronii, and Aeromonas caviae. The model organism Caenorhabditis elegans is a bacterivore that provides an excellent infection model by which to study the bacterial pathogenesis of Aeromonas. Here, we introduce three different experiments to study Aeromonas infection using a C. elegans model, including survival, liquid toxicity, and muscle necrosis assays. The results of the three methods determining the virulence of Aeromonas were consistent. A. dhakensis was shown to be the most toxic among the 4 major Aeromonas species causing clinical infections. These methods are shown to be a convenient way to evaluate the toxicity among and within Aeromonas species and contribute to our understanding of the pathogenesis of Aeromonas infection.

Evaluating Virulence and Pathogenesis of Aeromonas Infection in a Caenorhabditis elegans Model

Here, we introduce three different experiments to study Aeromonas infection in C. elegans. Using these convenient methods, it is easy to evaluate the toxicity among and within Aeromonas species.

Evaluación de la virulencia y patogenia de la infección por Aeromonas en un modelo elegans de Caenorhabditis

The human pathogen Aeromonas has been clinically shown to cause gastroenteritis, wound infections, septicemia, and urinary tract infections. Most human ...

Imaging of In Situ Interferon Gamma Production in the Mouse Spleen following Listeria monocytogenes Infection

Cytokines are small proteins secreted by cells, mediating cell-cell communications that are crucial for effective immune responses. One characteristic of cytokines is their pleiotropism, as they are produced by and can affect a multitude of cell types. As such, it is important to understand not only which cells are producing cytokines, but also in which environment they do so, in order to define more specific therapeutics. Here, we describe a method to visualize cytokine production in situ following bacterial infection. This technique relies on imaging cytokine-producing cells in their native environment by confocal microscopy. To do so, tissue sections are stained for markers of multiple cell types together with a cytokine stain. Key to this method, cytokine secretion is blocked directly in vivo before harvesting the tissue of interest, allowing for detection of the cytokine that accumulated inside the producing cells. The advantages of this method are multiple. First, the microenvironment in which cytokines are produced is preserved, which could ultimately inform on the signals required for cytokine production and the cells affected by those cytokines. In addition, this method gives an indication of the location of the cytokine production in vivo, as it does not rely on artificial in vitro re-stimulation of the producing cells. However, it is not possible to simultaneously analyze cytokine downstream signaling in cells that receive the cytokine. Similarly, the cytokine signals observed correspond&#160;only to the time-window during which cytokine secretion was blocked. While we describe the visualization of the cytokine Interferon (IFN) gamma in the spleen following mouse infection by the intracellular bacteria Listeria monocytogenes, this method could potentially be adapted to the visualization of any cytokine in most organs.

Imaging of In Situ Interferon Gamma Production in the Mouse Spleen following Listeria monocytogenes Infection

Here, we describe a simple confocal imaging method to visualize the in situ localization of cells secreting the cytokine Interferon gamma in murine secondary lymphoid organs. This protocol can be extended for the visualization of other cytokines in diverse tissues.

Imagen de la producción de interferón gamma in situ en el bazo de ratón después de la infección por Listeria monocytogenes

Cytokines are small proteins secreted by cells, mediating cell-cell communications that are crucial for effective immune responses. One characteristic of ...

Generation of In-Frame Gene Deletion Mutants in Pseudomonas aeruginosa and Testing for Virulence Attenuation in a Simple Mouse Model of Infection

Microorganisms are genetically versatile and diverse and have become a major source of many commercial products and biopharmaceuticals. Though some of these products are naturally produced by the organisms, other products require genetic engineering of the organism to increase the yields of production. Avirulent strains of Escherichia coli have traditionally been the preferred bacterial species for producing biopharmaceuticals; however, some products are difficult for E. coli to produce. Thus, avirulent strains of other bacterial species could provide useful alternatives for production of some commercial products. Pseudomonas aeruginosa is a common and well-studied Gram-negative bacterium that could provide a suitable alternative to E. coli. However, P. aeruginosa is an opportunistic human pathogen. Here, we detail a procedure that can be used to generate nonpathogenic strains of P. aeruginosa through sequential genomic deletions using the pEX100T-NotI plasmid. The main advantage of this method is to produce a marker-free strain. This method may be used to generate highly attenuated P. aeruginosa strains for the production of commercial products, or to design strains for other specific uses. We also describe a simple and reproducible mouse model of bacterial systemic infection via intraperitoneal injection of validated test strains to test the attenuation of the genetically engineered strain in comparison to the FDA-approved BL21 strain of E. coli.

Generation of In-Frame Gene Deletion Mutants in Pseudomonas aeruginosa and Testing for Virulence Attenuation in a Simple Mouse Model of Infection

Here, we describe a simple and reproducible protocol of mouse model of infection to evaluate the attenuation of the genetically modified strains of Pseudomonas aeruginosa in comparison to the United States Food and Drug Administration (FDA)-approved Escherichia coli for commercial applications.

Generación de mutantes de eliminación de genes en el marco en Pseudomonas aeruginosa y pruebas para la atenuación de la virulencia en un modelo simple de infección de ratón

Microorganisms are genetically versatile and diverse and have become a major source of many commercial products and biopharmaceuticals. Though some of ...

Real-Time Quantification of Reactive Oxygen Species in Neutrophils Infected with Meningitic Escherichia Coli

Escherichia coli (E. coli) is the most common Gram-negative bacteria causing neonatal meningitis. The occurrence of bacteremia and bacterial penetration through the blood-brain barrier are indispensable steps for the development of E. coli meningitis. Reactive oxygen species (ROS) represent the major bactericidal mechanisms of neutrophils to destroy the invaded pathogens. In this protocol, the time-dependent intracellular ROS production in neutrophils infected with meningitic E. coli was quantified using fluorescent ROS probes detected by a real-time fluorescence microplate reader. This method may also be applied to the assessment of ROS production in mammalian cells during pathogen-host interactions.

Real-Time Quantification of Reactive Oxygen Species in Neutrophils Infected with Meningitic Escherichia Coli

Escherichia coli is the leading cause of neonatal Gram-negative bacterial meningitis. During the bacterial infection, reactive oxygen species produced by neutrophils play a major bactericidal role. Here we introduce a method to detect the reactive oxygen species in neutrophils in response to meningitis E. coli.

Cuantificación en tiempo real de especies reactivas de oxígeno en neutrófilos infectados con escherichia coli meningítica

Escherichia coli (E. coli) is the most common Gram-negative bacteria causing neonatal meningitis. The occurrence of bacteremia and bacterial penetration ...

Tools for the Real-Time Assessment of a Pseudomonas aeruginosa Infection Model

Pseudomonas aeruginosa (Pa) is one of the most common opportunistic pathogens associated with cystic fibrosis (CF). Once Pa colonization is established, a large proportion of the infecting bacteria form biofilms within airway sputum. Pa biofilms isolated from CF sputum have been shown to grow in small, dense aggregates of ~10-1,000 cells that are spatially organized and exhibit clinically relevant phenotypes such as antimicrobial tolerance. One of the biggest challenges to studying how Pa aggregates respond to the changing sputum environment is the lack of nutritionally relevant and robust systems that promote aggregate formation. Using a synthetic CF sputum medium (SCFM2), the life history of Pa aggregates can be observed using confocal laser scanning microscopy (CLSM) and image analysis at the resolution of a single cell. This in vitro system allows the observation of thousands of aggregates of varying size in real time, three dimensions, and at the micron scale. At the individual and population levels, having the ability to group aggregates by phenotype and position facilitates the observation of aggregates at different developmental stages and their response to changes in the microenvironment, such as antibiotic treatment, to be differentiated with precision.

Tools for the Real-Time Assessment of a Pseudomonas aeruginosa Infection Model

Synthetic cystic fibrosis sputum medium (SCFM2) can be utilized in combination with both confocal laser scanning microscopy and fluorescence-activated cell sorting to observe bacterial aggregates at high resolution. This paper details methods to assess aggregate populations during antimicrobial treatment as a platform for future studies.

Herramientas para la evaluación en tiempo real de un modelo de infección por Pseudomonas aeruginosa

Pseudomonas aeruginosa (Pa) is one of the most common opportunistic pathogens associated with cystic fibrosis (CF). Once Pa colonization is established, a ...